申 翔,楊 蔚,李代清

(1天津市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科,天津 300000;2天津醫(yī)科大學朱憲彝紀念醫(yī)院糖尿病研究室;3常德市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科;*通訊作者,E-mail:daiqingli68@126.com)

2型糖尿病發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈“爆發(fā)式”增長的趨勢,目前對胰島beta細胞分泌缺陷分子靶點的研究是熱點之一,其中針對胰島素顆粒酸化、錨定、啟動、融合等過程的研究還有待深入。國外文獻[1]報道和我們前期研究結(jié)果[2]表明多重耐藥基因Mdr1(abcb1)調(diào)控的P糖蛋白可能是參與胰島素顆粒酸化和釋放的重要分子之一,但國內(nèi)該領(lǐng)域的研究資料卻十分有限,本研究通過分析大鼠胰島beta細胞截短型P糖蛋白的表達,為進一步探討P糖蛋白表達對胰島素分泌的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性Wistar大鼠,250-300 g,10只,由天津醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 細胞與試劑

大鼠胰島beta細胞瘤細胞系(INS-1細胞),由武漢大學細胞庫提供;TrizolReagent(Invitrogen, USA),DEPC(Sigma, USA),反義核酸第一鏈cDNA合成試劑盒(Thermo, USA),TaKaRa LA Tag(TaKaRa, Japan),瓊脂糖凝膠DNA/PCR產(chǎn)物回收試劑盒(BIOMIGA, USA),質(zhì)粒小量提取試劑盒(BIOMIGA,USA),SYBR premix Ex TagTM(TaKaRa,Japan),羅氏地高辛標記與檢測試劑盒(Roche,Switzerland),蛋白提取試劑盒(上海貝博)。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因abcb1b、abcb1a的檢測 實時熒光定量PCR方法檢測大鼠胰島、INS-1細胞及肝P糖蛋白主要調(diào)控基因abcb1b、abcb1a的表達,用Trizol法分別提取大鼠胰島、INS-1細胞、肝臟的總RNA,針對abcb1b的3′末端及5′末端設(shè)計N端引物和C端引物,并設(shè)計P糖蛋白的另一個調(diào)控基因abcb1a的引物,反應(yīng)引物均出自文獻[3]并經(jīng)BLAST軟件行同源性分析,由北京奧科生物公司合成。BioPhotometer分光光度計測定總RNA的純度,OD260/280為1.8-2.0,電泳法測定完整性。以各RNA標本經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA為模板進行PCR擴增,反應(yīng)條件為94 ℃預變性10 min后經(jīng)95 ℃變性5 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物行1.2%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳,以Trans2K plus DNA Marker作為分子量標記,于凝膠圖像分析儀中(SYNGENE, USA)照相保存。

用試劑盒對PCR產(chǎn)物進行回收,取純化PCR產(chǎn)物與商品化提供的pEASY T克隆載體進行連接,重組載體轉(zhuǎn)入Trans1-T1感受態(tài)細胞后通過分子克隆技術(shù)獲得單克隆重組質(zhì)粒。應(yīng)用試劑盒對重組質(zhì)粒進行提取,用BioPhotometer分光光度計測其濃度,OD260/OD280在1.8-2.0。根據(jù)公式[4]:拷貝數(shù)=[質(zhì)粒濃度(ng/μl)/(質(zhì)粒分子量×660)]×阿伏伽德羅常數(shù)計算出各質(zhì)?？截悢?shù),用ddH2O行倍比稀釋得到拷貝數(shù)為1×108,1×107,1×106,1×105,1×104的5種濃度梯度的質(zhì)粒標準品。在Bio-RadChrom04實時熒光定量PCR儀上,選用5個不同濃度梯度的質(zhì)粒標準品為模板進行熒光定量PCR反應(yīng),條件為95 ℃預變性5 min后94 ℃變性15 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,共35個循環(huán),制作標準曲線。取等量胰島、INS-1細胞及肝cDNA為模板,用與制作標準曲線相同的反應(yīng)體系和條件分別檢測abcb1b N端、C端及abcb1a的絕對表達量,每次檢測均帶有標準曲線,檢測結(jié)果數(shù)據(jù)由SDS.4軟件按標準曲線自動生成。

1.3.2 大鼠胰島abcb1b基因選擇性剪切的檢測 利用Northern Blot制備探針,取胰島及INS-1細胞RNA行RT-PCR合成所需探針DNA片段,反應(yīng)條件為94 ℃預變性5 min后經(jīng)98 ℃變性10 s,58 ℃退火30 s,68 ℃延伸1 min,共35個循環(huán)。引物依據(jù)大鼠MDR1cDNA序列(abcb1基因序列)由Primer5軟件設(shè)計并經(jīng)BLAST軟件行同源性分析,由北京奧科生物公司合成,產(chǎn)物行1.2%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳鑒定,回收純化目的探針DNA片段,應(yīng)用試劑盒進行地高辛-dUTP標記,獲得Northern blot檢測探針。取20 μg胰島及INS-1細胞RNA行甲醛變性凝膠電泳,于凝膠圖像分析儀中觀察RNA完整性并照相保存。凝膠RNA經(jīng)虹吸印跡法轉(zhuǎn)移至尼龍膜上后120 ℃ 30 min烘烤固定。將地高辛-dUTP標記探針與尼龍膜置于雜交緩沖液(DIG EASY HyB,Roche)中,在雜交爐中42 ℃震蕩過夜使標記探針與RNA核酸互補序列進行雜交,尼龍膜經(jīng)嚴謹洗滌后應(yīng)用試劑盒進行檢測。

1.3.3 大鼠胰島beta細胞截短型P糖蛋白的檢測 采用Western blot技術(shù),取T25細胞培養(yǎng)瓶對數(shù)生長期的INS-1細胞,用裂解液按照蛋白提取試劑盒說明進行操作,蛋白酶抑制劑組加入蛋白酶抑制劑“Protease Inhibitor Cocktail Tablets”(商品名:complete, ULTRA, Mini, EDTA-free, EASY, pack. Roche),無蛋白酶抑制劑組裂解液不含“Protease Inhibitor Cocktail”。BCA法測定蛋白濃度,取20 μg蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白,轉(zhuǎn)膜,用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1 h。加P糖蛋白特異性單克隆抗體C129(1 ∶200)4 ℃孵育過夜,加HRP結(jié)合的二抗(1 ∶10 000)室溫孵育2 h,TBST漂洗10 min×3次,ECL增強顯色,凝膠圖像分析儀曝光拍照。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 基因abcb1b、abcb1a檢測結(jié)果

大鼠abcb1bN端、C端及abcb1a目的片段經(jīng)PCR擴增后1.2%瓊脂糖凝膠電泳清晰可見(見圖1)。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示大鼠胰島、INS-1細胞及肝的abcb1b表達量遠大于abcb1a,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);進一步分析結(jié)果顯示大鼠胰島、INS-1細胞的abcb1b C端拷貝數(shù)大于N端(約1.7倍),差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而在肝臟中abcb1b C端與N端拷貝數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見表1)。

1.大鼠管家基因β-actin;2.abcb1a;3.abcb1b N端;4.abcb1b C端;M.Trans2K plus DNA marker圖1 大鼠abcb1b N端、C端及abcb1a目的片段PCR產(chǎn)物電泳圖Figure 1 Electrophoretogram of PCR products of abcb1b N terminus, C terminus and abcb1a

表1 不同組織abcb1b N端、C端及abcb1a絕對定量 (×104拷貝數(shù),

2.2 abcb1b選擇性剪切的檢測結(jié)果

胰島及INS-1細胞RNA經(jīng)RT-PCR后1.2%瓊脂糖凝膠電泳示abcb1b目的探針DNA片段清晰(見圖2),abcb1b目的探針DNA片段經(jīng)地高辛-dUTP標記后,按照10,3,1,0.3 pg梯度稀釋探針至1 pg后仍檢測清晰,探針達到預期標記效率(見圖3),能夠滿足雜交試驗的要求。胰島及INS-1細胞RNA甲醛變性電泳示RNA 28S、18S條帶清晰(見圖4),表明RNA樣品完整,無明顯降解,RNA經(jīng)轉(zhuǎn)膜后與標記探針雜交可見模糊單條帶(見圖5)。

1.胰島細胞cDNA為模板abcb1b目的探針DNA片段;2.INS-1細胞cDNA為模板abcb1b目的探針DNA片段;3.大鼠管家基因β-actin;M.Trans2K plus DNA marker圖2 胰島及INS-1細胞abcb1b目的探針DNA片段電泳圖Figure 2 Electrophoretogram of abcb1b target probe DNA fragments in islets and INS-1 cells

圖3 地高辛-dUTP標記的abcb1b目的基因探針效率檢測Figure 3 The efficiency of abcb1b probe labeled by digoxin dUTP

2.3 大鼠胰島beta細胞截短型P糖蛋白檢測結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示INS-1細胞無蛋白酶抑制劑組僅有65 kD截短型P糖蛋白的表達,而蛋白酶抑制劑保護組主要表達分子量為170 kD大小的全長P糖蛋白,截短型P糖蛋白表達顯著減低,截短型P糖蛋白的組間表達差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖6),無蛋白酶抑制劑組截短型P糖蛋白的表達量是蛋白酶抑制劑組的1.78±0.23倍。

圖4 胰島及INS-1細胞RNA甲醛變性電泳圖Figure 4 Electrophoretogram of RNA denaturation by formaldehyde in islets and INS-1 cells

圖5 胰島及INS-1細胞RNA與標記探針Northern blot雜交結(jié)果Figure 5 Northern blot hybridization results of with labeled probe and RNA in islet and INS-1 cells

圖6 Western blot測定INS-1細胞蛋白表達結(jié)果Figure 6 Protein expression of INS-1 cells by Western blot

3 討論

P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)作為多重耐藥(multidrug resistance,MDR)基因MDR1/abcb1產(chǎn)物,于1976年首次被描述,人MDR1基因與鼠MDR1基因間的同源性為81%[5]。P糖蛋白在人體正常組織及腫瘤均有表達，不僅能夠調(diào)節(jié)多種生理作用，還對腫瘤耐藥機制的研究具有重要意義[6,7],眾多研究結(jié)果表明P糖蛋白表達量與高血糖狀態(tài)相關(guān)[8,9]。一些研究在探測某些細胞P糖蛋白時發(fā)現(xiàn)分子量約65 kD的P糖蛋白類似物mini-P糖蛋白(mini-P-glycoprotein)且認為其與酶原顆粒的酸化成熟相關(guān)[10],Barg等[11]研究發(fā)現(xiàn)小鼠胰島素顆粒上存在mini-P糖蛋白，并進一步推斷其具有類似磺脲類受體調(diào)節(jié)胰島素釋放的功能。我們前期研究發(fā)現(xiàn)[2,12]在INS-1細胞僅探測全長P糖蛋白表達,但在胰島蛋白勻漿中僅探測到65 kD大小的min-P糖蛋白,而RT-PCR卻證實全長P糖蛋白在胰島中有表達且siRNA干擾實驗也證實了P糖蛋白(INS-1)和mini-P糖蛋白(胰島)與胰島素分泌相關(guān),因前期研究[3]已表明大鼠胰島alpha細胞幾乎不表達P糖蛋白,故對胰島beta細胞截短型P糖蛋白表達存在與否的鑒定是進一步研究P糖蛋白與胰島素分泌相關(guān)性的必要前提。

本研究RT-qPCR示abcb1b遠大于abcb1a,大鼠胰島abcb1b C端表達量大于N端表達量(約1.7倍),由于經(jīng)典P糖蛋白分子量約是該mini-P糖蛋白的2倍,且P糖蛋白C端及N端(除去起始端10-15 kD的糖基化區(qū)域即非功能區(qū))是高度保守區(qū)域,兩端功能區(qū)的同源性達46%,故推測mini-P糖蛋白有可能是abcb1b基因在轉(zhuǎn)錄水平上選擇性剪切造成的。雖然RT-qPCR結(jié)果顯示一個基因的兩端具有不同表達量,提示可能存在兩個轉(zhuǎn)錄模板的問題,但該方法不能完全排除基因一端因降解而導致該端表達量降低的可能,故驗證選擇性剪切的存在需進一步進行Northern blot檢測。

Northern blot是檢驗目的基因是否具有選擇性剪切的首選方法,優(yōu)勢在于其特異性及直觀性的結(jié)果表達:如檢測到一條帶,那么沒有選擇性剪切;如果有兩條或多條,提示存在選擇性剪切[13]。本研究Northern blot結(jié)果為一條帶即提示并不存在選擇性剪切,與RT-qPCR結(jié)果推測矛盾。因為RT-qPCR是定量觀察編碼P糖蛋白基因的N端與C端表達量的差異,可提示有無選擇性剪切,為可能性判斷。而Northern blot直觀特異地證明選擇性剪切是否存在,從研究目的上來說更具意義。因為考慮手工摘取胰島方式容易有外分泌腺組織污染,胰島勻漿制備時蛋白酶的含量比細胞株勻漿的高,從而推測前期胰島勻漿中探測到的65 kD大小的P糖蛋白類似物很有可能是一個蛋白降解產(chǎn)物。進一步應(yīng)用Western blot在蛋白質(zhì)表達水平上檢測INS-1細胞P糖蛋白,發(fā)現(xiàn)無蛋白酶抑制劑條件下僅檢測到65 kD截短型P糖蛋白,與前期胰島勻漿探測到的結(jié)果一致,而在蛋白酶抑制劑保護情況下主要表達分子量在170 kD大小的全長P糖蛋白且截短型P糖蛋白表達顯著減低,綜上結(jié)果,初步認為前期發(fā)現(xiàn)的大鼠胰島beta細胞截短型P糖蛋白可能為蛋白降解產(chǎn)物。

一方面本實驗Northern blot條帶清晰度及重復性欠佳,故應(yīng)進一步優(yōu)化實驗條件并增加陽性對照組以獲得更加滿意的實驗結(jié)果。另一方面我們尚不能確定前期在胰島蛋白勻漿中探測到65 kD大小的截短型P糖蛋白與Barg等[11]探測到的mini-P糖蛋白是否為同一分子。因此,仍需通過多種實驗手段進一步研究P糖蛋白與胰島素顆粒酸化及釋放的關(guān)系,從而為糖尿病的治療提供理論支持及干預靶點。