張曉靜,陳延松,陳 晨,劉 元,金功圣,劉先富

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科,蚌埠 233000;*通訊作者,E-mail:276325428@qq.com)

乳腺癌是一種普遍存在的惡性疾病,在全世界婦女死亡率中排名第二[1],嚴(yán)重影響女性的身心健康。近些年隨著分子生物學(xué)的進(jìn)步,目前乳腺癌的分子分型主要由雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)、人表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,Her-2)和Ki-67在患者腫瘤組織中的表達(dá)量決定,可將乳腺癌分為四種類型:Luminal A型、Luminal B型、Her-2陽性型、三陰性型[2]。隨著研究的深入,提高了我們對(duì)不同亞型乳腺癌生物學(xué)特性的理解,但由于腫瘤無限增殖和遷移的發(fā)生限制了乳腺癌的臨床治療效果[3]。因此,亟需尋找乳腺癌增殖、遷移的新分子機(jī)制。

miR-126位于9號(hào)染色體EGFL7基因的第7位內(nèi)含子上,在毛細(xì)血管和大血管的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá),具有調(diào)節(jié)血管生成的功能[4]。越來越多的研究表明,miR-126在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,并證實(shí)miR-126在結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌、食管癌中低表達(dá)[5-8],而miR-126在乳腺癌中的作用仍存在爭(zhēng)議,有待深入研究。本課題將探究miR-126對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移的影響,并尋找其可能的作用機(jī)制,為乳腺癌的臨床治療提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

MCF-10A細(xì)胞培養(yǎng)基主要成分為:DMEM/F12培養(yǎng)基,依次加入5%馬血清、10 μg/ml胰島素、20 ng/ml表皮生長(zhǎng)因子、100 ng/ml霍亂毒素、0.5 μg/ml氫化可的松,均購買于武漢普諾賽(Procell)生物試劑公司;DMEM和RPMI-1640高糖培養(yǎng)基購于Hyclone(美國(guó))公司;轉(zhuǎn)染試劑購自鎮(zhèn)江Abm公司;CCK-8試劑盒購于日本同仁生物試劑公司;miR-126模擬物(miR-126 mimics)、陰性對(duì)照(mimics-NC)和相關(guān)引物由滁州通用生物公司合成;STED8、PCNA、β-actin抗體購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;pcDNA3.1-SETD8質(zhì)粒購于南京金斯瑞生物公司;Transwell小室購于Corning公司;青鏈霉素溶液購于碧云天生物試劑公司。

1.2 細(xì)胞株和細(xì)胞培養(yǎng)

MCF-10A、MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR-3、BT-549細(xì)胞購于武漢普諾賽生物試劑公司。乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞使用專用培養(yǎng)基培養(yǎng);乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞均采用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),乳腺癌SK-BR-3和BT-549細(xì)胞培養(yǎng)采用RPMI-1640高糖培養(yǎng)基,且含10%胎牛血清和1%青鏈霉素溶液,置于37 ℃,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)miR-126的相對(duì)表達(dá)量

使用Trizol試劑分別抽取乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A,乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR-3、BT-549的總RNA、使用試劑盒每組逆轉(zhuǎn)錄1 μg RNA作為cDNA用于后續(xù)qRT-PCR實(shí)驗(yàn),檢測(cè)miR-126的表達(dá)情況。根據(jù)SYBR Green Mix試劑盒說明書配制反應(yīng)體系:Mix 10 μl,上游引物0.5 μl,下游引物0.5 μl,cDNA模板4 μl,去離子水5 μl。U6作為內(nèi)參。miR-126上游引物為:5′-TATGGTTGTTCTCGACTCCTTCAC-3′,下游引物為:5′-TCGTCTGTCGTACCGTGAGTAAT-3′;U6上游引物為:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,U6下游引物為:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)步驟為:預(yù)變性95 ℃ 5 min(1個(gè)循環(huán)),循環(huán)反應(yīng)95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s(40個(gè)循環(huán))。使用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-126相對(duì)表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

選取生長(zhǎng)狀態(tài)較好的MCF-7細(xì)胞接種于6孔板,4×105個(gè)/孔,培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h進(jìn)行轉(zhuǎn)染。本實(shí)驗(yàn)中需進(jìn)行兩種類型轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),miR-126過表達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照組(mimics NC)組和miR-126模擬物組(miR-126 mimics);挽救實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照組(mimics NC)、miR-126模擬物組(miR-126 mimics)、STED8回補(bǔ)組(miR-126 mimics和pcDNA3.1-SETD8質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染),每孔轉(zhuǎn)染復(fù)合物體系為:0.5 ml無血清DMEM高糖培養(yǎng)基中加入4 μl DNAfectin plus轉(zhuǎn)染試劑,5 μl siRNA或5 μl siRNA+2 μg質(zhì)粒,充分混勻、室溫靜置10 min,加入6孔板。培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

選擇轉(zhuǎn)染后生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞,消化離心,接種于96孔板中,3 000個(gè)/孔,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別于0,24,48,72 h每孔加入10 μl CCK-8溶液(以接種后細(xì)胞完全貼壁時(shí)作為0 h檢測(cè)點(diǎn)),37 ℃孵育2 h,酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度值(optical density,OD)。

1.6 集落克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

選取轉(zhuǎn)染后生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MCF-7細(xì)胞,胰酶消化離心、計(jì)數(shù),接種于6孔板中,1 000個(gè)/孔。置于37 ℃,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d,取出6孔板,棄去培養(yǎng)基,PBS洗滌一次;每孔加入1 ml甲醇室溫固定20 min,0.1%結(jié)晶紫染色30 min,去離子水洗滌干凈,37 ℃烘箱烘干拍照,并在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

使用轉(zhuǎn)染后生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MCF-7細(xì)胞,胰酶消化離心,用無血清培養(yǎng)基洗滌一次,再次使用無血清培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù),每個(gè)Transwell小室上室加入3×104個(gè)細(xì)胞,下室加入700 μl含10%血清的完全培養(yǎng)基,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h,取出小室,甲醇室溫固定20 min,0.1%結(jié)晶紫室溫染色20 min,棉簽輕柔擦去上室表面未遷移細(xì)胞,去離子水清洗兩次,顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照計(jì)數(shù)、求出各組遷移細(xì)胞平均數(shù)。

1.8 Targetscan Human 7.2數(shù)據(jù)庫在線預(yù)測(cè)miR-126下游靶基因

打開網(wǎng)站http://www.targetscan.org/vert-72/,首先選擇物種為Human,然后輸入microRNA名稱為miR-126,對(duì)其靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.9 Western blot檢測(cè)SETD8、PCNA、β-actin蛋白表達(dá)

選取轉(zhuǎn)染后對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞、消化計(jì)數(shù),接種于60 mm平皿中,6×105個(gè)/皿,細(xì)胞培養(yǎng)箱中48 h,收集細(xì)胞于1.5 ml EP管,預(yù)冷的PBS洗滌一次,棄去PBS,加入適量RIPA裂解液,冰上裂解30 min,13 000g離心15 min,收集上清。加入1/4體積loading buffer,100 ℃煮樣5 min變性蛋白。隨后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,分別加入SETD8、PCNA、β-actin一抗(均使用5%脫脂牛奶按1 ∶1 000稀釋),4 ℃過夜孵育,PBST洗膜3次、20 min/次,加入對(duì)應(yīng)兔二抗(使用PBST溶液按1 ∶5 000稀釋),室溫孵育2 h,PBST洗膜3次、20 min/次,ECL發(fā)光液顯影曝光。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-126在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)水平降低

qRT-PCR結(jié)果顯示:相比于乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A,miR-126在四株乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)均降低(P<0.05),且MCF-7細(xì)胞中表達(dá)水平最低(見圖1)。

與MCF-10A細(xì)胞比較,*P<0.05圖1 miR-126在乳腺上皮細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況Figure 1 Expression of miR-126 in breast epithelial cells and breast cancer cells

2.2 miR-126抑制乳腺癌細(xì)胞增殖

相比于NC組,miR-126 mimics組miR-126水平顯著升高(P<0.05,見圖2);隨后使用CCK-8和集落克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖,結(jié)果顯示:相比于NC組,miR-126 mimics組細(xì)胞增殖能力明顯降低(P<0.05,見圖2)。

與mimics NC組比較,*P<0.05圖2 miR-126對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響Figure 2 Effect of miR-126 on the proliferation of breast cancer MCF-7 cells

2.3 miR-126抑制乳腺癌細(xì)胞遷移

Transwell實(shí)驗(yàn)表明:相比于NC組,miR-126 mimics組細(xì)胞遷移能力顯著下降(P<0.05,見圖3)。

與mimics NC組比較,*P<0.05圖3 miR-126對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移的影響Figure 3 The effect of miR-126 on the migration of breast cancer MCF-7 cells

2.4 miR-126靶向SETD8抑制其表達(dá)

使用Targetscan網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-126下游靶基因,結(jié)果表明:miR-126能夠結(jié)合在SETD8的3′-UTR區(qū)域(見圖4A),推測(cè)SETD8可能為miR-126的下游靶基因;Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí):轉(zhuǎn)染miR-126 mimics確能降低SETD8蛋白表達(dá)(P<0.05,見圖4B)。

與mimics NC組比較,*P<0.05圖4 miR-126對(duì)MCF-7細(xì)胞SETD8表達(dá)的影響Figure 4 The effect of miR-126 on SETD8 expression in MCF-7 cells

2.5 miR-126能抑制PCNA表達(dá)

通過Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí):乳腺癌MCF-7細(xì)胞中miR-126可以下調(diào)PCNA蛋白表達(dá)(P<0.05,見圖5)。

與mimics NC組比較,*P<0.05圖5 miR-126對(duì)MCF-7細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響Figure 5 The effect of miR-126 on the expression of PCNA in MCF-7 cells

2.6 回補(bǔ)SETD8增加乳腺癌細(xì)胞增殖能力

Western blot實(shí)驗(yàn)表明:相比于miR-126 mimics轉(zhuǎn)染組,SETD8回補(bǔ)組能升高SETD8的蛋白表達(dá)(見圖6A)。CCK-8和集落克隆實(shí)驗(yàn)證實(shí):相比于miR-126 mimics組,SETD8回補(bǔ)組細(xì)胞增殖能力略有升高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖6)。

2.7 回補(bǔ)SETD8增加乳腺癌細(xì)胞遷移能力

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,回補(bǔ)SETD8表達(dá)能明顯恢復(fù)細(xì)胞的遷移能力(P<0.05,見圖7)。

與miR-126 mimics組比較,*P<0.05圖6 回補(bǔ)SETD8表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響Figure 6 Effect of backfilling SETD8 expression on the proliferation ability of breast cancer cells

與miR-126 mimics組比較,*P<0.05圖7 回補(bǔ)SETD8表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響Figure 7 Effect of backfilling SETD8 expression on the migration ability of breast cancer cells

2.8 回補(bǔ)SETD8增加PCNA蛋白表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí),相比于miR-126 mimics組,SETD8回補(bǔ)組能夠增加PCNA的蛋白水平(見圖8),證實(shí)miR-126能通過SETD8調(diào)控PCNA表達(dá)。

3 討論

miRNA是由21-25個(gè)核苷酸組成的短鏈非編碼RNA,能夠靶向目的基因mRNA的3′-UTR區(qū)域,從而抑制蛋白質(zhì)的翻譯。目前對(duì)miRNA在各種疾病中的作用進(jìn)行了深入研究,發(fā)現(xiàn)miRNA能影響視網(wǎng)膜疾病、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、癌癥發(fā)生發(fā)展等[9]。關(guān)于miRNA在癌癥中的作用已有大量報(bào)道,有研究表明miR-146能抑制多種腫瘤進(jìn)展,并能作為一些非轉(zhuǎn)移性腫瘤的分子標(biāo)志物[10];miR-10a能負(fù)調(diào)控BDNF蛋白表達(dá),進(jìn)而抑制宮頸癌的增殖和遷移[11];miR-132能逆轉(zhuǎn)卵巢癌對(duì)順鉑的耐藥性[12]。這些研究證實(shí)miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。

與miR-126 mimics組比較,*P<0.05圖8 回補(bǔ)SETD8對(duì)PCNA表達(dá)的影響Figure 8 Effect of backfilling SETD8 on PCNA expression

miR-126在腫瘤中研究較多,最近有研究表明miR-126能夠在靶向PIK3R2并調(diào)控AKT/mTOR通路降低乳腺癌對(duì)曲妥單抗的耐藥性[13];Wang等[14]證實(shí)miR-126可抑制ADAM9蛋白表達(dá)進(jìn)而降低乳腺癌細(xì)胞侵襲性;Hong等[15]報(bào)道m(xù)iR-126可通過靶向RGS3抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成。本研究證實(shí)miR-126在多株乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá),且miR-126能抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖和遷移,與以前研究[14,15]結(jié)果一致,均表明miR-126在乳腺癌中發(fā)揮抑癌功能。通過Tatgetscan網(wǎng)站在線預(yù)測(cè)表明miR-126可能結(jié)合在SETD8的3′-UTR區(qū)域,隨后通過Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-126確能降低SETD8的表達(dá)。

SETD8屬于組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(histone lysine methyltransferase)家族中的一員,包含SET結(jié)構(gòu)域,能夠催化組蛋白H4第20位賴氨酸發(fā)生單甲基(H4K20me)和非組蛋白甲基化,已發(fā)現(xiàn)其可以參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA損傷、細(xì)胞周期等生物學(xué)過程[16]。已有研究表明SETD8能促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌、骨肉瘤等發(fā)生發(fā)展[17-19]。目前僅有Huang等[20]證實(shí)SETD8可以增加HIF-1α蛋白穩(wěn)定性從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖。因此,仍需進(jìn)一步探究SETD8在乳腺癌中的作用機(jī)制。

已有報(bào)道表明SETD8能夠通過提高PCNA蛋白穩(wěn)定性,進(jìn)而促進(jìn)其表達(dá)[9]。那么乳腺癌細(xì)胞中miR-126是否可以通過SETD8調(diào)控PCNA表達(dá),引起了我們極大興趣。本研究證實(shí)SETD8在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中可調(diào)控PCNA表達(dá)。隨后,我們通過挽救實(shí)驗(yàn)回補(bǔ)SETD8的表達(dá),結(jié)果表明回補(bǔ)SETD8表達(dá)后能部分增加乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移能力,同時(shí)能恢復(fù)PCNA的表達(dá)。挽救實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-126能夠靶向SETD8下調(diào)PCNA表達(dá),進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移的特異性和重要性。

綜上所述,本研究初步證實(shí)miR-126/SETD8/PCNA軸能調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移,豐富了乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。此外,本研究為乳腺癌的臨床治療提供了新的思路和方法。