趙 琳,鞏 楠

(西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科,西安 710077;*通訊作者,E-mail:1906974438@qq.com)

鼻咽癌是我國南部常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率為耳鼻咽喉惡性腫瘤之首。因其原發(fā)部位較為隱蔽,疾病早期不易被發(fā)現(xiàn),故多數(shù)患者確診時已屬中晚期,并大多伴有遠處轉(zhuǎn)移。目前鼻咽癌最有效的治療手段是放療和化療結(jié)合治療,但由于非靶向性和非特異性,放化療的毒副作用可嚴(yán)重影響治療效果,并導(dǎo)致許多后遺癥[1,2]。因此尋找療效好、毒副作用低的藥物對提高患者生活質(zhì)量很有必要。近年來天然植物抗腫瘤藥物因其低毒性、高利用度等特點已成為腫瘤治療的研究熱點[3,4]。

迷迭香酸(rosrarinicacid,RA)是迷迭香的主要化學(xué)成分之一,是一種天然水溶性的多酚羥基化合物,廣泛分布于唇形科、葫蘆科、紫草科等植物中[5]。目前醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),RA具有廣泛的藥理活性,如抗氧化、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)抗菌和抗病毒等多種作用[6,7]。已有研究證實RA對鼻咽癌細(xì)胞增殖發(fā)揮抑制作用,但其機制尚需深入研究[8]。已有研究表明鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[9],而NLRP3是目前研究較多且深入的炎癥小體,但關(guān)于NLRP3炎癥小體與鼻咽癌相關(guān)性的研究卻較少。此外,對于RA在鼻咽癌中發(fā)揮抗腫瘤作用與NLRP3炎癥小體的關(guān)系鮮有報道。本研究以CNE-1細(xì)胞為對象,觀察RA對其增殖和凋亡的影響,探討NLRP3炎癥小體在其中的作用,為以NLRP3炎癥小體為新靶點用于鼻咽癌的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

RA(上海恒斐生物科技有限公司),CNE-1細(xì)胞(武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司),10%小牛血清(Gibco公司),胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素溶液(碧云天公司),RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司),CCK-8試劑盒(Sigma公司),Annexin Ⅴ-PE/7-AAD流式試劑盒(BD公司),BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司),兔多抗NLRP3(118KD,美國Novus公司),兔單抗ASC(22KD,英國Abcam公司),兔單抗pro Caspase-1+p10+p12(35/45 kD,英國Abcam公司),兔多抗GAPDH(37 kD,杭州賢至生物有限公司),辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將CNE-1細(xì)胞復(fù)蘇后,置于37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。其中RPMI-1640培養(yǎng)基內(nèi)含10%胎牛血清,青霉素100 U/ml和鏈霉素100 μg/ml。每2-3 d傳代換液1次,取對數(shù)生長期的細(xì)胞進行實驗。

1.3 CCK-8檢測細(xì)胞增殖

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞胰酶消化后,計數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104個/ml,將細(xì)胞均勻的接種到96孔板中,每孔100 μl,每組細(xì)胞設(shè)3個復(fù)孔,同時設(shè)置空白對照孔,周圍孔加入100 μl PBS,將96孔板移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。分別加0,20,40,80 μmol/L RA處理,37 ℃、5%CO2飽條件培養(yǎng)48 h。每孔加入10 μl CCK-8溶液,37 ℃培養(yǎng)4 h,放至搖床低速振蕩10 min,使用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處的吸光度值A(chǔ)。細(xì)胞增殖率(%)=(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡

用6孔板培養(yǎng)細(xì)胞,待細(xì)胞生長達到60%-70%,根據(jù)上述實驗分組處理細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清和沉淀,2 000 r/min離心5 min;用PBS洗滌細(xì)胞2次,2 000 r/min離心5 min,收集1×105個細(xì)胞;在50 μl的Binding Buffer中加入5 μl 7-AAD染液,混勻;收集細(xì)胞中加入上述7-AAD染液,混勻;室溫、避光、反應(yīng)10 min;反應(yīng)后再加入450 μl的Binding Buffer混勻;加入1 μl的Annexin Ⅴ-PE混勻;室溫、避光、反應(yīng)10 min;1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀觀察和檢測細(xì)胞凋亡。

1.5 Western blot檢測NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白表達

收集上述各組細(xì)胞,BCA法測定蛋白濃度,取50 μg等量蛋白上樣,經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜,封閉液室溫封1 h,加入一抗NLRP3(1 ∶1 000),ASC(1 ∶10 000),Caspase-1(1 ∶1 000)、GADPH(1 ∶1 000)。4 ℃孵育過夜,加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000),室溫孵育2 h,凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析,以GAPDH為內(nèi)參計算各組目的蛋白的相對表達水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 RA對CNE-1細(xì)胞增殖的影響

CCK-8結(jié)果顯示,培養(yǎng)48 h時,對照組、20 μmol/L RA組、40 μmol/L RA組和80 μmol/L RA組細(xì)胞增殖率分別為99.97%±0.88%,88.92%±1.56%,75.09%±1.12%,53.77%±1.93%。與對照組相比,20,40,80 μmol/LRA組CNE-1細(xì)胞增殖均明顯抑制(P<0.05),且隨著RA濃度的增加,其抑制細(xì)胞增殖的效應(yīng)也增強,各濃度組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05,見圖1)。

圖1 RA對CNE-1細(xì)胞增殖的影響Figure 1 Effect of RA on proliferation of CNE-1 cells

2.2 RA對CNE-1細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,0,20,40,80 μmol/L RA處理細(xì)胞48 h,各組細(xì)胞凋亡率明顯上升,分別為2.82%±0.35%,6.31%±0.46%,14.01%±0.36%,24.34%±1.56%。與0 μmol/L相比,20,40,80 μmol/L的RA均能明顯促進CNE-1細(xì)胞凋亡(均P<0.05),且隨著RA濃度的增加,其促細(xì)胞凋亡效應(yīng)也增強,各濃度組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05,見圖2)。

圖2 RA對CNE-1細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 Effect of RA on apoptosis of CNE-1 cells

2.3 RA對CNE-1細(xì)胞表達NLRP3炎癥小體的影響

Western blot法檢測各CNE-1細(xì)胞中NLRP3,ASC及Caspase-1蛋白的表達水平。結(jié)果顯示,與0 μmol/L相比,20,40,80 μmol/L的RA均能明顯抑制CNE-1細(xì)胞表達NLRP3,ASC及Caspase-1蛋白(均P<0.05),且隨著RA濃度的增加,其抑制細(xì)胞表達NLRP3炎癥小體的效應(yīng)也增強,各濃度組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05,見圖3)。

與對照組相比,*P<0.05;與20μmol/L RA組相比,#P<0.05;與40μmol/L RA組相比,&P<0.05圖3 RA對CNE-1細(xì)胞表達NLRP3,ASC及Caspase-1蛋白的影響Figure 3 Effect of RA on the expressions of NLRP3, ASC and Caspase-1 in CNE-1 cells

3 討論

鼻咽癌是一種起源于鼻咽上皮細(xì)胞的惡性腫瘤,其惡性程度高,容易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移,嚴(yán)重威脅人類生命健康[10]。鼻咽癌的分布具有明顯的地域性,在世界范圍內(nèi)呈低發(fā)水平,但在我國是常見的惡性腫瘤之一,全世界80%的鼻咽癌患者發(fā)生在我國的華南地區(qū)[11]。目前鼻咽癌的治療手段以放化療為主,但經(jīng)一線放化療后仍難以避免出現(xiàn)疾病進展,出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后較差[12]。目前尋找放化療中的輔助藥物已經(jīng)成為腫瘤領(lǐng)域研究的熱點,因此尋找新的療效好、無毒副作用的藥物成為必然趨勢。鼻咽癌的發(fā)病機制仍未完全闡明,一般認(rèn)為鼻咽癌的發(fā)病是環(huán)境、病毒、基因多種因素相互作用導(dǎo)致的。大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查和分子生物學(xué)實驗已證實了慢性炎癥與腫瘤的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)至少有25%的惡性腫瘤和慢性炎癥相關(guān)[13,14]。與其他頭頸部鱗癌相比,鼻咽癌的顯著特征是與EB病毒感染密切相關(guān),EB病毒感染可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞募集密切及多種趨化因子的產(chǎn)生。組織學(xué)上可見鼻咽癌微環(huán)境中有大量的炎癥細(xì)胞浸潤,這些腫瘤浸潤炎癥細(xì)胞在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的演進中發(fā)揮了異常重耍的作用[15]。鼻咽癌的發(fā)病是一個復(fù)雜的過程,涉及多條信號通路的交互作用,以炎癥作為抗腫瘤藥物的靶點進行研究意義重大。

RA是從唇形科迷迭香屬植物迷迭香中提取的天然活性成分,其化學(xué)名稱是[R(E)]α-{[3-(3,4-二羥基苯基)-1-氧代-2-丙烯基]氧基}-3,4-二羥基苯丙酸。RA在植物中廣泛分布,以唇形科和紫草科含量最高。研究表明,RA分子結(jié)構(gòu)中具有多電子的酚羥基,使其具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎等多種藥理作用,在很多疾病中顯現(xiàn)出極大的治療潛能[16-19]。細(xì)胞實驗證實,RA對多種腫瘤具有明顯的抑制作用,可有效抑制癌細(xì)胞增殖,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,如宮頸癌、卵巢癌、直腸癌、乳腺癌等[20-22]。在本研究中,我們選用人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞為模型,觀察RA對其增殖的影響,結(jié)果表明不同濃度RA(20,40,80 μmol/L)處理細(xì)胞48 h均可抑制其增殖活性,且呈劑量依賴性。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡的過程,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),本研究中我們采用流式細(xì)胞技術(shù),檢測RA對CNE-1細(xì)胞的凋亡作用,結(jié)果表明不同濃度RA能夠誘導(dǎo)CNE-1細(xì)胞發(fā)生凋亡。以上結(jié)果提示RA能通過抑制增殖,并促進凋亡從而在鼻咽癌中發(fā)揮抗腫瘤作用。目前,RA的抗腫瘤作用機制尚未完全闡明,研究表明可能與其調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23]、通過VEGF通路抑制腫瘤血管形成和腫瘤細(xì)胞遷移[24]等有關(guān)。與本研究結(jié)果相似,楊沛霖等的研究顯示,迷迭香酸能劑量依賴性地抑制CNE-1細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡,其機制可能與調(diào)控PTEN、PI3K/Akt/m TOR信號通路有關(guān)[8]。該研究小組還發(fā)現(xiàn),迷迭香酸類似物RA-C1可有效地抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE-1細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡,其機制很可能是通過激活依賴Caspase的線粒體通路促進CNE-1細(xì)胞的凋亡[25]。

炎癥小體是一種細(xì)胞內(nèi)大分子量的多蛋白復(fù)合體,是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。NLRP3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors 3)炎癥小體是近年來備受關(guān)注的一種胞漿內(nèi)模式識別受體,是研究較為深入的一類炎癥小體[26]。NLRP3炎癥小體由NLRP3、含胱天蛋白酶招募結(jié)構(gòu)域(Caspase recruitment domain,CARD)的凋亡相關(guān)顆粒樣蛋白(apoptosis-associated speck like protein,ASC)和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1(cysteiny aspartate-specific protease-1,Caspase-1)組成,各種危險信號通過激活NIRP3炎癥小體,進而激活下游的炎癥反應(yīng),在很多疾病中都發(fā)揮重要作用[27]。炎癥影響腫瘤發(fā)生的所有階段,其中包括NLRP3在內(nèi)的炎癥小體通過調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)、細(xì)胞死亡、增殖和/或腸道微生物群來影響癌癥的發(fā)病機制,在多種癌癥中的臨床相關(guān)性突出了其作為分子靶點的治療前景[28]。然而,目前關(guān)于NLRP3與鼻咽癌的研究較少,有研究發(fā)現(xiàn),NLRP3在鼻咽癌組織中的表達顯著高于正常鼻咽黏膜組織,NLRP3的表達水平與鼻咽癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及患者的臨床預(yù)后有關(guān)[29,30]。本研究通過Western blot法檢測不同濃度RA對CNE-1細(xì)胞NLRP3炎癥小體蛋白NLRP3、ASC及Caspase-1蛋白表達水平的影響,表明RA能夠不同程度抑制CNE-1細(xì)胞NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的表達,且呈劑量依賴性,從而起到抑制炎癥反應(yīng)的作用。在多種惡性腫瘤,例如肺癌[31]、食管癌[32]中的研究,NLRP3炎癥小體激活可直接增強腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力,促進癌癥的發(fā)生與進展,而本研究結(jié)果提示,RA可通過抑制NLRP3炎癥小體的表達從而抑制CNE-1細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上,RA能夠通過誘導(dǎo)凋亡抑制鼻咽癌細(xì)胞生長,且呈劑量依賴性,其作用機制可能與抑制NLRP3炎癥小體信號通路有關(guān)。RA廣泛的藥理作用使其具有巨大的醫(yī)用前景,本研究結(jié)果為臨床上將RA用于治療鼻咽癌提供了理論依據(jù)與靶點。然而,體外實驗結(jié)果不能完全代表疾病的真實情況,RA是否能對鼻咽癌發(fā)揮治療作用,還需要利用動物模型甚至患者進行深入研究。