張永紅,李鳳娟,劉 昀,張德信,李 維,吳媛媛,柯 蕊,孫秀珍

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:doc-ly@sohu.com)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是常見(jiàn)的臨床綜合征,是指心源性以外因素,主要由嚴(yán)重感染、淹溺、重大創(chuàng)傷、吸入有毒氣體和化學(xué)物質(zhì)等導(dǎo)致急性、進(jìn)行性、缺氧性急性呼吸衰竭。長(zhǎng)期以來(lái),國(guó)內(nèi)外研究人員針對(duì)ALI/ARDS的主要發(fā)病機(jī)制炎癥損傷、氧化應(yīng)激損傷、氣血屏障障礙進(jìn)行了大量的研究,但是仍未找到行之有效的治療措施,治療上仍主要以對(duì)癥治療為主,ALI/ARDS患者的病死率高達(dá)30%-40%[1,2]。近20年來(lái),可引起ALI/ARDS的新型病毒不斷被發(fā)現(xiàn),這些病毒嚴(yán)重影響人們的生活,已引起我國(guó)和世界衛(wèi)生組織的高度重視,因此進(jìn)一步明確ALI/ARDS發(fā)病的分子機(jī)制,尋找針對(duì)其發(fā)病機(jī)制的干預(yù)藥物,對(duì)救治ALI/ARDS具有極其重要的意義[3]。研究表明,過(guò)度激活的炎癥反應(yīng)是ALI/ARDS發(fā)病的重要機(jī)制,炎癥反應(yīng)貫穿ALI/ARDS發(fā)病的整個(gè)過(guò)程[4],炎癥因子在ALI/ARDS的發(fā)生以及發(fā)展中起著重要的作用,其中TNF-α,IL-1β和IL-6被認(rèn)為是ALI/ARDS的治療靶標(biāo)[5]。Tristetraprolin(TTP)蛋白為內(nèi)源性炎癥抑制因子,能夠結(jié)合含有ARE元件的mRNA并且靶向介導(dǎo)其快速降解,促進(jìn)各種炎癥因子mRNA衰減[6,7]。體內(nèi)研究表明,β2腎上腺素受體激動(dòng)劑能夠抑制LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng),對(duì)急性肺損傷具有保護(hù)作用[8]。本研究擬探討β2AR激動(dòng)劑沙丁氨醇是否可以上調(diào)TTP蛋白的水平,從而抑制TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá),減輕ALI/ARDS炎癥反應(yīng),從而為臨床ALI/ARDS的治療尋找新的有效治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,沙丁氨醇購(gòu)自于上海禾豐制藥有限公司,兔抗小鼠Tristetraprolin一抗購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司,兔抗大鼠GAPDH購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司,HRP標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司,ELISA測(cè)定試劑盒購(gòu)自于美國(guó)R&D system。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

36只6-8周雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分3組:對(duì)照組(Con)12只,無(wú)菌PBS持續(xù)霧化30 min;LPS組(LPS組)12只,濃度為2.5 mg/ml的LPS霧化液體持續(xù)霧化30 min;沙丁氨醇處理組(LPS+SALB組)12只,一次性腹腔注射5 mg/kg的沙丁氨醇,間隔30 min,再給予濃度為2.5 mg/ml的LPS溶液持續(xù)霧化30 min。

1.3 收集支氣管肺泡灌洗液

霧化結(jié)束后第24小時(shí),腹腔注射10%水合氯醛(0.8 ml/100 g)處死BALB/c小鼠,右側(cè)支氣管插管支氣管肺泡灌洗,用4 ℃預(yù)冷的無(wú)菌PBS溶液0.7 ml灌洗支氣管肺泡,重復(fù)灌洗3次,并收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)。灌洗液的回收率約為80%?；厥盏闹夤芊闻莨嘞匆涸? ℃,1 500 r/min離心10 min沉淀細(xì)胞,將分離后的BALF上清在-80 ℃保存。

1.4 BALF中細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)

用1 ml PBS溶液重懸支氣管肺泡灌洗液離心后沉淀細(xì)胞,用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),并將細(xì)胞沉淀涂片,用Wright-Giemsa染色進(jìn)行中性粒細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)。

1.5 肺組織病理HE染色

取左肺下葉肺組織用4%中性緩沖甲醛液固定,石蠟包埋,切片(5 μm),蘇木精-伊紅(HE)染色,觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.6 Western bolt檢測(cè)TTP蛋白水平

將左肺上葉提取的總蛋白用BCA蛋白定量試劑盒定量。取含有等量總蛋白的蛋白樣品加入到上樣孔內(nèi),電泳后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,封閉后分別加TTP及GAPDH一抗溶液,4 ℃孵育過(guò)夜。PBST洗膜,滴加二抗溶液,室溫孵育2 h,PBST洗膜后加入發(fā)光液,曝光,顯影,定影,用Quantity One 4.6.2(美國(guó)Bio-Rad公司)凝膠成像分析儀采集底片圖像并進(jìn)行定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)分析,正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,非正態(tài)分布資料經(jīng)正態(tài)轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,多組間比較應(yīng)用單因素方差分析Tukey post hoc檢驗(yàn),以P<0.05認(rèn)為組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β2AR激動(dòng)劑沙丁氨醇抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥反應(yīng)

本實(shí)驗(yàn)HE結(jié)果顯示,對(duì)照組小鼠肺組織內(nèi)肺泡結(jié)構(gòu)完整,未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);LPS模型組小鼠肺組織內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞被嚴(yán)重破壞,肺水腫、肺出血及以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞在肺組織內(nèi)大量浸潤(rùn),肺部正常的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)消失;而沙丁氨醇預(yù)處理組LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥損傷被顯著抑制(見(jiàn)圖1)。

圖1 β2AR激動(dòng)劑沙丁氨醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI/ARDS小鼠肺部炎癥反應(yīng)的影響 (HE,×100)Figure 1 Effect of β2AR agonist salbutamol on LPS-induced lung inflammation in ALI/ARDS mice (HE,×100)

2.2 β2AR激動(dòng)劑沙丁氨醇對(duì)LPS誘導(dǎo)ALI小鼠支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞影響

對(duì)照組小鼠支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)為(3.02±0.29)×106/ml、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)為(1.73±0.16)×106/ml,LPS組小鼠支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)上升為(12.23±2.46)×106/ml、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)升高為(7.84±1.16)×106/ml,與對(duì)照組比較均明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖2);而沙丁氨醇預(yù)處理后,LPS+SALB組小鼠支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)為(6.13±1.26)×106/ml、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)為(4.12±0.79)×106/ml,與LPS組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖2),提示β2AR激動(dòng)劑沙丁氨醇能夠抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠肺部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

與對(duì)照組比較,*P<0.05;與LPS組比較,#P<0.05圖2 β2AR激動(dòng)劑沙丁氨醇對(duì)LPS誘導(dǎo)ALI/ARDS小鼠支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞的影響 (n=12)Figure 2 Effect of β2AR agonist salbutamol on bronchoalveolar lavage fluid cells in LPS-induced ALI/ARDS mice (n=12)

2.3 β2AR激動(dòng)劑沙丁氨醇對(duì)LPS誘導(dǎo)ALI/ARDS小鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α,IL-1β和IL-6的影響

炎癥因子是ALI/ARDS炎癥反應(yīng)強(qiáng)度的關(guān)鍵指標(biāo)。LPS組小鼠氣管肺泡灌洗液TNF-α濃度為(513.23±75.11)pg/ml,較對(duì)照組[(19.53±2.61)pg/ml]明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖3);應(yīng)用沙丁氨醇預(yù)處理后,LPS+SALB組小鼠支氣管肺泡灌洗液TNF-α濃度下降為(291±52.31)pg/ml,較LPS組明顯減低(P<0.05)。LPS組小鼠氣管肺泡灌洗液的IL-1β為(212.63±37.65)pg/ml,較對(duì)照組[(22.54±3.41)pg/ml]明顯升高(P<0.05),LPS+SALB組小鼠支氣管肺泡灌洗液的IL-1β水平為(83.24±21.34)pg/ml,較LPS組明顯減低(P<0.05,見(jiàn)圖3)。LPS組小鼠氣管肺泡灌洗液的IL-6為(1 127.15±97.65)pg/ml,較對(duì)照組[(21.13±3.11)pg/ml]明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),LPS+SALB組小鼠支氣管肺泡灌洗液的IL-6水平為(614±45.24)pg/ml,較LPS組明顯減低(P<0.05,見(jiàn)圖3)。提示β2AR激動(dòng)劑沙丁氨醇預(yù)處理可以降低LPS誘導(dǎo)小鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α,IL-1β和IL-6的水平。

與對(duì)照組比較,*P<0.05;與LPS組比較,#P<0.05圖3 β2AR激動(dòng)劑沙丁氨醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI/ARDS小鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α,IL-1β和IL-6的影響 (n=12)Figure 3 Effect of β2AR agonist salbutamol on TNF-α,IL-1β and IL-6 in bronchoalveolar lavage fluid in LPS-induced ALI/ARDS mice (n=12)

2.4 激活β2AR激動(dòng)劑對(duì)LPS誘導(dǎo)ALI/ARDS小鼠肺組織TTP蛋白的影響

Western blot結(jié)果顯示,對(duì)照組小鼠肺組織內(nèi)的TTP蛋白表達(dá)水平非常低,LPS組小鼠肺組織內(nèi)TTP蛋白水平明顯增加,是對(duì)照組的1.81倍,與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);沙丁氨醇預(yù)處理后,LPS+SALB組小鼠肺組織內(nèi)TTP蛋白水平進(jìn)一步升高,是對(duì)照組的3.37倍,與LPS組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖4),提示沙丁氨醇預(yù)處理后,可以增加LPS組小鼠肺組織內(nèi)TTP蛋白水平。

與對(duì)照組比較,*P<0.05;與LPS組比較,#P<0.05圖4 沙丁氨醇對(duì)LPS誘導(dǎo)ALI/ARDS小鼠肺組織TTP蛋白表達(dá)的影響 (n=3)Figure 4 Effect of salbutamol on TTP protein levels in lung tissue of LPS-induced ALI/ARDS mice (n=3)

3 討論

本研究探討了β2AR激動(dòng)劑沙丁氨醇在LPS誘導(dǎo)的ALI/ARDS中的作用及其可能的分子機(jī)制。在LPS誘導(dǎo)的ALI/ARDS模型中,小鼠的肺組織內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞被嚴(yán)重破壞,肺水腫、滲出,以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞在肺組織內(nèi)大量浸潤(rùn),肺部正常的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)消失;BALF中細(xì)胞總數(shù),中性粒細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)及支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著升高;提示過(guò)度激活的炎癥反應(yīng)是ALI/ARDS發(fā)病的重要機(jī)制[4]。而應(yīng)用β2AR激動(dòng)劑沙丁氨醇預(yù)處理后,LPS+SALB組小鼠肺組織中TTP蛋白水平顯著升高,伴隨肺部炎癥反應(yīng)減弱,提示β2AR激動(dòng)劑沙丁氨醇能通過(guò)增強(qiáng)TTP蛋白的表達(dá),抑制LPS誘導(dǎo)的ALI/ARDS模型小鼠肺部炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎癥因子的合成,減輕肺部炎癥損傷。

ALI/ARDS表現(xiàn)為肺部炎癥呈級(jí)聯(lián)放大并繼發(fā)彌漫性肺損害,炎癥細(xì)胞和炎癥因子在ALI/ARDS的發(fā)生以及發(fā)展中起著重要的作用[9]。肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞源性TNF-α、IL-1β、IL-6被認(rèn)為是ALI/ARDS的治療靶點(diǎn),阻止上述因子的表達(dá)對(duì)ALI/ARDS具有顯著保護(hù)作用。研究表明轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)是炎癥因子重要的調(diào)節(jié)方式,炎癥因子轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)主要依賴(lài)其mRNA 3′UTR區(qū)的ARE特殊元件介導(dǎo)其降解,其決定著mRNA半衰期,進(jìn)而負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)[10]。TTP蛋白是一種ARE結(jié)合蛋白,調(diào)節(jié)富含ARE mRNA的不穩(wěn)定性,其促進(jìn)許多炎癥因子和趨化因子(TNF-α、GM-CSF、IL-2、IL-3、IL-6、CCL2、CCL3和COX2)mRNA的降解,從而抑制其表達(dá)[11,12]。研究發(fā)現(xiàn)TTP蛋白參與調(diào)節(jié)單核巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá),以及炎癥細(xì)胞的活化,在炎癥性疾病如結(jié)腸炎[13]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[14]、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[15]、動(dòng)脈粥樣硬化[16]、內(nèi)毒素血癥[17]、急性肺損傷[18]等起著重要的作用。

在LPS誘導(dǎo)的ALI模型中,吸入低劑量一氧化碳,可以上調(diào)TTP蛋白的表達(dá),抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá),對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI/ARDS起顯著的保護(hù)作用[18],提示TTP蛋白參與ALI/ARDS發(fā)生發(fā)展,可能是ALI/ARDS的治療靶點(diǎn)。人類(lèi)TTP蛋白的編碼基因ZFP36位于染色體19q13.1,由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子組成。人類(lèi)ZFP36啟動(dòng)子區(qū)域含有多個(gè)高度保守的調(diào)節(jié)元件,與轉(zhuǎn)錄因子EGR-1(early growth response-1),TPE1(TTP promoter element 1),AP-2(activator protein-2)和SP-1(specificity protein-1)結(jié)合調(diào)節(jié)TTP基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[11]。研究表明β2腎上腺素受體(β2 adrenergic receptor,β2AR)激動(dòng)劑、cAMP類(lèi)似物、內(nèi)毒素、TGF-β、糖皮質(zhì)激素、綠茶和肉桂均可以上調(diào)TTP mRNA的轉(zhuǎn)錄以及表達(dá)[19]。體內(nèi)研究表明,β2AR激動(dòng)劑能夠抑制LPS誘導(dǎo)的ALI/ARDS肺部炎癥反應(yīng),對(duì)急性肺損傷具有保護(hù)作用[20]。體外研究表明β2AR激動(dòng)劑以及cAMP類(lèi)似物可能通過(guò)上調(diào)AP-2轉(zhuǎn)錄因子增加單核巨噬細(xì)胞TTP mRNA和蛋白表達(dá)[21];β2AR激動(dòng)劑亦可以上調(diào)TTP蛋白表達(dá),抑制脂肪細(xì)胞IL-6的表達(dá)[22]。本研究結(jié)果提示,在LPS誘導(dǎo)的ALI/ARDS小鼠模型中,BALF中性粒細(xì)胞和炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6升高,肺組織組織結(jié)構(gòu)破壞,肺組織TTP蛋白水平升高,LPS在激活炎癥炎癥反應(yīng)的同時(shí),亦激活TTP蛋白的表達(dá),提示TTP是一個(gè)廣泛參與炎癥因子轉(zhuǎn)錄后負(fù)性控制的調(diào)節(jié)因子[6],上調(diào)內(nèi)源性TTP活性抑制炎癥因子表達(dá),可能對(duì)ALI/ARDS發(fā)揮保護(hù)作用。沙丁氨醇處理組小鼠肺組織中的TTP蛋白進(jìn)一步升高伴隨肺部炎癥細(xì)胞和炎癥因子下降,提示沙丁氨醇可能通過(guò)提高內(nèi)源性TTP蛋白水平抑制LPS誘導(dǎo)的ALI/ARDS肺部炎癥反應(yīng),從而發(fā)揮保護(hù)作用,其機(jī)制可能為沙丁氨醇上調(diào)AP-2轉(zhuǎn)錄因子增加TTP mRNA轉(zhuǎn)錄和TTP蛋白表達(dá)[21]。