常 盼,朱蕭玲,于 軍,朱肖星,王建榜,王西輝,李 靜*

(1西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中心實驗室,西安 710038;2空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院麻醉科;*通訊作者,E-mail:8683268@qq.com)

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是一種致殘率和復(fù)發(fā)率較高的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,是指原發(fā)性腦實質(zhì)出血,在急性腦血管病中具有最高的病死率[1]。近年來,腦出血的發(fā)病率逐年上升,且呈低齡化趨勢[2],盡管臨床治療取得了顯著進展,但45歲以上腦出血患者的5年死亡率仍超過50%[3],因此,腦出血不僅造成患者較高的發(fā)病率和死亡率,而且給家庭和社會帶來嚴重的負擔。腦出血后的病理機制可引發(fā)一系列不良事件,進而導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷和嚴重的神經(jīng)功能缺損,這是影響腦出血患者生活質(zhì)量和預(yù)后的主要因素之一[4]。因此緩解腦出血后的繼發(fā)性損傷具有重要的意義。腦出血后氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的過度激活是腦出血后繼發(fā)性損傷的主要病理機制[5,6]。鈉尿肽是一組結(jié)構(gòu)相似的多肽家族,在維持機體水鹽平衡、血壓穩(wěn)定等方面具有重要作用,主要包括心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)和C型鈉尿肽(C-type natriuretic peptide,CNP)。血管鈉肽(vasonatrin peptide,VNP)是一種具有ANP和CNP的生理功能人工合成的多肽,我們前期首次發(fā)現(xiàn),VNP降低腦出血后基底節(jié)區(qū)水腫程度[7],但具體的作用機制仍不清楚。因此,本研究主要探究VNP對小鼠腦出血神經(jīng)功能缺損評分與腦水腫程度的影響,以及其對氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

8周齡雄性C57BL/6小鼠,體質(zhì)量18-20 g,購于空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心,將動物隨機分為:假手術(shù)組(sham組)10只,腦出血組(ICH組)24只,腦出血+10 μg/kg血管鈉肽處理組(ICH+10 μg/kg VNP)16只,腦出血+25 μg/kg血管鈉肽處理組(ICH+25 μg/kg VNP)24只及腦出血+50 μg/kg血管鈉肽處理組(ICH+50 μg/kg VNP)16只。腦出血1,3,5,7 d應(yīng)用神經(jīng)功能損傷評分觀察小鼠腦出血的神經(jīng)功能;采用干濕重法檢測腦水腫程度,這兩個指標評估VNP發(fā)揮保護作用的最佳效應(yīng)(腦出血3 d時,25 μg/kg VNP)。因此,后續(xù)實驗分為3組:sham組、ICH組和ICH+25 μg/kg VNP組。動物術(shù)前12 h禁食,但自由進水。

1.2 小鼠腦出血模型的建立

應(yīng)用0.1%戊巴比妥鈉腹腔注射將動物麻醉后,仰臥位固定于立體定位儀(北京眾實迪創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司,中國),備皮碘伏消毒,剝離小鼠右側(cè)顱頂骨膜,將1 μl含0.2 U的膠原酶Ⅶ(Sigma-Aldrich,美國)于5 min內(nèi)緩慢注入右紋狀體內(nèi),留針5 min后,進行縫合,整個手術(shù)過程中,保持動物肛溫在37 ℃。假手術(shù)組以同樣的方法注入1 μl的生理鹽水,造模開始前1 h和腦出血造模結(jié)束后1 h,VNP溶液按照相應(yīng)劑量通過腹腔分別注射入模型鼠。

1.3 神經(jīng)功能的評估

神經(jīng)功能的評估采用神經(jīng)功能缺損評分(NDS)進行檢測,主要測試內(nèi)容包括行走、平衡、感覺、提尾反射等,分別在腦出血1,3,5,7 d后評估小鼠腦出血神經(jīng)功能的損傷情況。

1.4 腦水腫的檢測

采用干濕重法檢測腦組織含水量,評估腦水腫程度,檢測完神經(jīng)功能后,分別在腦出血1,3,5,7 d采用0.1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后斷頭取出腦組織,稱得質(zhì)量即為濕重,在100 ℃干燥箱烘干24 h后,稱其質(zhì)量即為干重,腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.5 二氫乙錠(dihydroethidium,DHE)染液檢測腦組織超氧化物陰離子水平

腦出血3 d后取材,進行冰凍切片切片,將含有5 μmol/L的DHE溶液(碧云天生物科技有限公司,中國)加入到組織切片上,37 ℃避光孵育30 min后,PBS清洗3次,加入DAPI溶液,應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察DHE水平,以評價活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生情況。

1.6 腦組織ROS含量的檢測

腦出血3 d后取材,采用酶消化法制備腦組織單細胞懸液,加入DCFH-DA溶液(南京建成生物工程有限公司,中國),37 ℃避光孵育30 min,熒光光度分度計檢測熒光數(shù)值。

1.7 腦組織丙二醛(malondialdehyde,MDA)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的檢測

應(yīng)用細胞裂解液將腦出血3 d的腦組織進行裂解,12 000g離心10 min取上清,分別應(yīng)用MDA檢測試劑盒(碧云天生物科技有限公司,中國)和SOD活性檢測試劑盒(碧云天生物科技有限公司,中國),按照說明書操作依次檢測腦組織MDA含量和SOD活性。

1.8 Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白

腦出血3 d處理后,提取組織蛋白,檢測蛋白濃度,通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品,采用恒流250 mA,120 min的條件將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,使用5%脫脂牛奶常溫封閉2 h,一抗GRP78(1 ∶1 000)、CHOP(1 ∶1 000)及β-actin(1 ∶1 000)在4 ℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG的二抗(1 ∶3 000)室溫孵育2 h,ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測免疫印跡。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析處理

2 結(jié)果

2.1 血管鈉肽對小鼠腦出血后神經(jīng)功能缺損評分結(jié)果的影響

采用NDS評分評估小鼠腦出血后神經(jīng)功能缺損情況,結(jié)果顯示,與sham組相比,ICH組的小鼠在1,3,5,7 d時神經(jīng)功能缺損評分顯著增加(P<0.01)。與ICH組相比,10 μg/kg VNP處理組腦出血后神經(jīng)功能缺損評分未明顯改變(P>0.05);腦出血1 d或3 d時,25 μg/kg和50 μg/kg VNP處理組神經(jīng)功能缺損評分均降低(P<0.05,見圖1)。

與sham組相比,**P<0.01;與ICH模型組相比,#P<0.05圖1 小鼠腦出血后神經(jīng)功能缺損評分結(jié)果比較Figure 1 Comparison of scores of neurological deficits after cerebral hemorrhage

2.2 血管鈉肽對小鼠腦出血后腦水腫的影響

通過干濕重法檢測腦組織含水量評估腦水腫程度,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與sham組相比,ICH組腦出血小鼠在1,3,5,7 d后腦水腫顯著增加(P<0.01)。與ICH組相比,10 μg/kg VNP處理組腦出血后腦水腫程度未明顯改變(P>0.05);腦出血1 d時,25 μg/kg和50 μg/kgVNP處理組腦水腫程度均降低(P<0.05);腦出血3 d時,25 μg/kgVNP處理組腦水腫程度顯著降低(P<0.01,見圖2)。

與sham組相比,**P<0.01;與ICH模型組相比,#P<0.05,##P<0.01圖2 小鼠腦出血后腦水腫的變化Figure 2 Changes of brain edema after cerebral hemorrhage in mice

2.3 血管鈉肽對小鼠腦出血后氧化應(yīng)激的影響

采用DHE免疫熒光染色后,熒光顯微鏡下觀察超氧化物陰離子情況,評估ROS的產(chǎn)生,結(jié)果見圖3。與sham組相比,ICH組ROS顯著增加(P<0.01)。與ICH組相比,25 μg/kg VNP處理組ROS的產(chǎn)生降低(P<0.05)。利用化學(xué)熒光法檢測腦組織ROS和MDA含量,結(jié)果表明,與sham組相比,ICH組ROS及MDA含量顯著增加(P<0.01,見圖4)。與ICH組相比,25 μg/kg VNP處理組的ROS及MDA含量降低(P<0.05)。檢測腦組織SOD的含量,結(jié)果顯示,與sham組相比,ICH組的SOD含量顯著降低(P<0.01)。與ICH組相比,25 μg/kg VNP處理組的SOD活性增高(P<0.05,見圖4)。以上結(jié)果提示,VNP抑制小鼠腦出血后氧化應(yīng)激的發(fā)生。

圖3 血管鈉肽對小鼠腦出血后DHE熒光強度的影響 (×40)Figure 3 Effect of VNP on DHE fluorescence intensity after cerebral hemorrhage in mice (×40)

與sham組相比,**P<0.01;與ICH模型組相比,#P<0.05,##P<0.01圖4 血管鈉肽對小鼠腦出血后氧化應(yīng)激的影響Figure 4 Effect of VNP on oxidative stress after cerebral hemorrhage in mice

2.4 血管鈉肽對小鼠腦出血后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

利用Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78和CHOP的含量,結(jié)果顯示,與sham組相比,ICH組的腦組織GRP78和CHOP的蛋白表達均顯著增加(P<0.01,見圖5)。與ICH組相比,25 μg/kg VNP處理組的GRP78和CHOP的表達均降低(P<0.05)。以上結(jié)果提示,VNP抑制小鼠腦出血后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。

與sham組相比,**P<0.01;與ICH模型組相比,##P<0.01圖5 血管鈉肽小鼠腦出血后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的影響Figure 5 Effect of VNP on endoplasmic reticulum stress-related proteins after intracerebral hemorrhage in mice

3 討論

有報道稱腦出血后,血清BNP含量明顯升高,且與腦水腫程度及預(yù)后效果密切相關(guān)[8,9]。外源性的BNP作用于腦出血小鼠后,可改善小鼠神經(jīng)功能[10]。此外,ANP可以降低腦出血和腦外傷后的腦水腫程度[11]。以上研究表明,鈉尿肽家族與腦出血的發(fā)生及預(yù)后密切相關(guān),但是具體的作用機制仍不清楚。VNP是由ANP和CNP嵌合而成的由人工合成的新型鈉尿肽,我們前期研究將腦組織分為5部分,檢測VNP對5部分腦組織水腫程度的影響,結(jié)果顯示VNP可以降低腦出血后腦基底節(jié)區(qū)水腫程度[7],具體作用機制不清楚。繼發(fā)性腦損傷程度取決于腦水腫的大小[5]。本次研究應(yīng)用不同濃度的VNP依次檢測其對神經(jīng)功能和腦水腫程度的影響,結(jié)果顯示,25 μg/kgVNP作用于腦出血3 d的小鼠后,可降低神經(jīng)功能缺損評分和腦水腫程度,以上結(jié)果表明,VNP對腦出血損傷具有神經(jīng)保護作用。

氧化應(yīng)激是指機體對各種有害刺激作出反應(yīng),并產(chǎn)生過量ROS的狀態(tài)。氧化應(yīng)激反映了活性氧的系統(tǒng)表現(xiàn),是機體氧化和抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)。在腦出血繼發(fā)性損傷中,氧化應(yīng)激發(fā)揮重要的作用[12],抑制腦出血后氧化應(yīng)激的發(fā)生是治療腦出血的重要靶點之一[5],ROS作為機體氧化應(yīng)激的主要因素,體內(nèi)或細胞內(nèi)ROS的積累,造成細胞毒性,最終可導(dǎo)致組織損傷,抑制ROS的產(chǎn)生對于腦出血的防治具有重要意義。為了進一步探究VNP發(fā)揮神經(jīng)保護的機制,本部分采用DHE染色法觀察超氧化物陰離子情況評估ROS的情況、化學(xué)熒光檢測ROS含量以及試劑盒檢測MDA和SOD活性,以評價氧化應(yīng)激情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦出血后ROS的生成明顯增加,而VNP緩解此現(xiàn)象,為了更進一步探究VNP對腦出血氧化應(yīng)激的影響,分別檢測腦組織ROS生成、MDA含量及SOD活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)VNP抑制腦出血后ROS的產(chǎn)生,降低MDA含量,提高SOD活性。以上結(jié)果提示,VNP對腦出血損傷的保護作用與氧化應(yīng)激有關(guān)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞中重要的細胞器,主要參與蛋白質(zhì)折疊、脂質(zhì)合成、細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的維持等作用,缺氧、低血糖、溫度過高和鈣動態(tài)失衡等均可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[13]。腦出血發(fā)生后,其病理狀態(tài)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊能力與容量之間的不平衡,導(dǎo)致未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔中積聚,從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生[14]。氧化應(yīng)激與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生密切相關(guān),氧化應(yīng)激發(fā)生后,未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)的適度激活可能是保護細胞功能和存活的適應(yīng)機制,但過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可引起ROS積累,進一步加重氧化應(yīng)激的發(fā)生[15]。腦出血發(fā)生時,氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的水平增強[16,17],因此抑制氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能是腦出血新的治療靶點。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號主要由3種跨膜蛋白介導(dǎo),即蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶、需要肌醇的蛋白1和活化轉(zhuǎn)錄因子6。這3種跨膜蛋白與GRP78結(jié)合,通常處于失活狀態(tài),當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的時候,GRP78與跨膜蛋白結(jié)合發(fā)生解離,從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下游信號的激活。在本次研究中,我們檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦出血后GRP78的表達升高,VNP處理后顯著降低GRP78的表達。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的3種跨膜蛋白不僅可以介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生,而且還可以引發(fā)促凋亡信號。CHOP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。本研究中檢測CHOP的蛋白含量變化,結(jié)果顯示,腦出血后CHOP蛋白表達顯著增加,而VNP降低CHOP的表達。以上結(jié)果表明,VNP對腦出血的保護作用可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的降低有關(guān),且與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的凋亡有關(guān)。

綜上所述,VNP能夠降低小鼠腦出血后神經(jīng)功能缺損評分,緩解腦水腫程度,對腦出血后神經(jīng)損傷可能具有重要的神經(jīng)保護作用,且這種保護作用與氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切有關(guān)。