徐 瑞,李麗娜,王文娟

(1陜西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)一科,西安 710061;2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:lingyinnancy@163.com)

Hippo信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物器官發(fā)育大小的調(diào)節(jié)及細(xì)胞的增殖和凋亡過程中起著重要的作用[1]。YAP(Yes-associated protein)是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子,是Hippo信號(hào)通路下游的主要效應(yīng)成分[2]。Hippo信號(hào)通路的工作方式是由核心的激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)完成,上游的Mst磷酸化并激活Lats,活化的Lats磷酸化YAP蛋白,使其降解,Hippo信號(hào)通路處于激活;當(dāng)上游分子Mst及Lats失活時(shí),使得YAP蛋白的降解受到抑制從而抑制了Hippo信號(hào)通路[3,4]。近年來對(duì)Hippo信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用的研究表明,其在肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌及前列腺癌等中發(fā)揮著重要作用[5,6]。Hippo信號(hào)通路控制哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞的增殖,肝臟大小的調(diào)節(jié)以及肝癌的發(fā)生[7,8]。通過敲除上游分子Mst1抑制通路的激活使得YAP蛋白表達(dá)上調(diào)顯著增加了肝癌細(xì)胞的增殖能力,同時(shí)發(fā)現(xiàn)S6K磷酸化水平增加[9],然而Hippo信號(hào)通路效應(yīng)分子YAP通過何種途徑促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖能力,成瘤能力及其與PI3K/mTOR之間是否存在通路間的相互調(diào)節(jié)作用目前仍不清楚。

本研究通過在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)Hippo信號(hào)通路的效應(yīng)分子YAP,研究其與mTOR信號(hào)通路之間的關(guān)系,闡述其增加肝癌細(xì)胞增殖能力和成瘤能力的機(jī)制,為靶向Hippo信號(hào)通路及尋找肝癌治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑

細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI1640購(gòu)自Gibco BRL公司;氨卞青霉素鈉、硫酸鏈霉素、雷帕霉素(Rapamycin)和G418試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購(gòu)自Hyclone公司;鼠抗人YAP、mTOR、兔抗人PTEN和AKT及P-AKT多克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司;β-actin單克隆抗體從Santa Cruz公司購(gòu)買;二抗為辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)連接的羊抗鼠、羊抗兔二抗購(gòu)自Sigma公司;24孔板,96孔板及細(xì)胞培養(yǎng)皿購(gòu)自Costar公司;ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自Millipore公司,X感光膠片、定影液和顯影液均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;人類YAP基因干擾載體(pGPU6/YAP/Neo和pGPU6/GFP/Neo)購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司,pcDNA3.1載體由本院實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌BEL7402和HepG2購(gòu)自ATCC(American Type Culture Collection,Manassas,VA,USA),用含10%胎牛血清,1 000 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液,于37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)細(xì)胞,待單層細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%融合時(shí),用胰蛋白酶消化細(xì)胞,收集細(xì)胞備用。

1.3 載體構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

利用YAP過表達(dá)和干擾載體,在肝癌細(xì)胞系中過表達(dá)和干擾YAP,檢測(cè)YAP表達(dá)改變后肝癌細(xì)胞體外增殖及裸鼠體內(nèi)成瘤能力的改變。人類YAP的基因序列(GenBank登陸號(hào):NM-001130145.2)從人肝母細(xì)胞瘤HepG2細(xì)胞中擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性3 min,98 ℃變性10 s,53 ℃退火10 s,72 ℃延伸2 min,30個(gè)循環(huán),72 ℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用EcoRⅠ和XbaⅠ進(jìn)行酶切,通過基因重組將YAP基因鏈接于pcDNA3.1質(zhì)粒CMV啟動(dòng)子之后并測(cè)序鑒定。

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞,PBS沖洗2次,胰酶消化后計(jì)數(shù),將5×105的細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組:轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組(Mock組)、空載體組(pcDNA3.1組和siRNA-control)、轉(zhuǎn)染組(pcDNA3.1-YAP和siRNA-YAP)。根據(jù)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書,將5 μl轉(zhuǎn)染試劑Lipofectmine2000與2 μg載體或者空載體混合,室溫放置20 min后,緩慢加入培養(yǎng)上清液中,搖晃混勻后繼續(xù)培養(yǎng),24 h后以1:10的比例將每組細(xì)胞傳代,用G418藥物篩選挑取單克隆后,通過Western blot鑒定其表達(dá)。

1.4 Western blot檢測(cè)YAP及PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白

提取細(xì)胞總蛋白,經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)移后加100 ml/L脫脂奶粉封閉60 min,加入抗YAP、PTEN、PI3K P85,AKT(S473)、AKT、mTOR(S2468)、mTOR抗體(1 ∶200稀釋),4 ℃過夜,加入對(duì)應(yīng)的HRP-IgG二抗(1 ∶5 000稀釋)室溫孵育1 h,采用化學(xué)發(fā)光試劑曝光顯影,膠片掃描。

1.5 免疫共沉淀檢測(cè)YAP與PTEN的結(jié)合

提取細(xì)胞蛋白質(zhì)并定量,分成4份,一份做Input,其余的3份分別用抗YAP單克隆抗體、抗PTEN多克隆抗體和兔免疫血清(IgG)沉淀相應(yīng)的抗原,然后用protein A/G-agarose把抗原抗體復(fù)合物吸附,離心并清洗,經(jīng)高溫變性使agarose珠子與蛋白質(zhì)復(fù)合物分離,經(jīng)SDS-PAGE變性膠分離,通過Western blot檢測(cè)相關(guān)抗原的表達(dá)。

1.6 細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞活力檢測(cè)(MTT)

細(xì)胞以5×104濃度接種于6孔板中,利用細(xì)胞計(jì)數(shù)器檢測(cè)1周內(nèi)細(xì)胞數(shù)并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,比較過表達(dá)/干擾YAP組和相應(yīng)對(duì)照組中細(xì)胞增殖能力的差異。將1 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中,連續(xù)7 d采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。細(xì)胞經(jīng)0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液染色4-6 h,加入DMSO溶解在分光光度計(jì)570 nm測(cè)定吸光度并繪制曲線圖。

1.7 異種移植瘤實(shí)驗(yàn)

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的過表達(dá)/干擾YAP組和相應(yīng)對(duì)照組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化成單細(xì)胞懸液,臺(tái)盼藍(lán)染色法觀察活細(xì)胞>95%,調(diào)整濃度使瘤細(xì)胞的終濃度為1×106/ml,將100 μl(1×105)細(xì)胞懸液接種于4-6周齡的BALB/c-nu裸鼠(購(gòu)自上海斯萊克公司)雙側(cè)背部皮下,觀察成瘤情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hippo信號(hào)通路的失活對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖能力和成瘤能力的影響

在肝癌細(xì)胞系BEL7402和HepG2中穩(wěn)定過表達(dá)YAP蛋白抑制Hippo信號(hào)通路,Western blot結(jié)果驗(yàn)證兩個(gè)肝癌細(xì)胞系中的過表達(dá)YAP的細(xì)胞克隆(見圖1A)。為了探討YAP蛋白的過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力和成瘤能力的影響,我們采用細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞增殖能力的改變,采用裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的改變,結(jié)果顯示過表達(dá)YAP蛋白的肝癌細(xì)胞BEL7402-YAP和HepG2-YAP體外增殖能力均較對(duì)照組增強(qiáng),并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖1)。以105數(shù)量級(jí)的BEL7402-YAP/HepG2-YAP和BEL7402-pcDNA3.1/HepG2-pcDNA3.1分別接種于裸鼠皮下,經(jīng)過8周的生長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)成瘤情況并繪制成瘤曲線,結(jié)果顯示兩個(gè)YAP蛋白過表達(dá)的細(xì)胞裸鼠成瘤能力明顯增加,腫瘤生長(zhǎng)曲線及腫瘤大小差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖1)。以上結(jié)果表明Hippo信號(hào)通路的抑制促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的增殖能力和成瘤能力。

圖1 BEL7402和HepG2細(xì)胞系中YAP蛋白的過表達(dá)能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖能力和成瘤能力Figure 1 The overexpression of YAP protein in BEL7402 and HepG2 increased the hepatocellular carcinoma cell growth and tumor formation

2.2 Hippo信號(hào)通路的激活能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力和成瘤能力

在HepG2干擾YAP的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆中進(jìn)一步檢測(cè)Hippo信號(hào)通路對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響。細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示干擾YAP蛋白后,肝癌細(xì)胞HepG2的增殖能力較YAP干擾前降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。裸鼠成瘤生長(zhǎng)曲線和移植瘤大小也較對(duì)照組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。

圖2 干擾YAP蛋白的表達(dá)能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力和成瘤能力Figure 2 The silencing of YAP protein inhibited the hepatocellular carcinoma cell growth and tumor formation

2.3 YAP蛋白介導(dǎo)PTEN調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路

PTEN作為經(jīng)典的抑癌基因在YAP過表達(dá)細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),而在YAP干擾的肝癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)(見圖3A)。我們進(jìn)一步探索了Hippo信號(hào)通路可能作用的其他信號(hào)通路,結(jié)果顯示Hippo信號(hào)通路失活的細(xì)胞中即YAP過表達(dá)時(shí),PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)上調(diào),Hippo信號(hào)通路激活的肝癌細(xì)胞,PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)下調(diào)(見圖3B)。為了進(jìn)一步證實(shí)PTEN是否介導(dǎo)了這兩個(gè)通路之間的調(diào)節(jié)關(guān)系,我們?cè)贖ippo信號(hào)通路抑制即過表達(dá)YAP蛋白的肝癌細(xì)胞中過表達(dá)PTEN,結(jié)果顯示PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白下調(diào),該通路被顯著抑制;加入PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的抑制劑雷帕霉素結(jié)果也顯示PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路被抑制(見圖3C)。另外,我們?cè)赮AP蛋白過表達(dá)的肝癌細(xì)胞中過表達(dá)PTEN或者加入雷帕霉素均使得肝癌細(xì)胞的增殖能力和成瘤能力受到抑制,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖3D)。以上結(jié)果表明YAP蛋白調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)介導(dǎo)了Hippo信號(hào)通路和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路之前的相互作用從而影響肝癌細(xì)胞的增殖能力。

圖3 YAP蛋白介導(dǎo)PTEN調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路Figure 3 YAP protein regulated PI3K/AKT/mTOR pathway via PTEN

2.4 YAP蛋白結(jié)合PTEN蛋白抑制其活性

YAP蛋白是通過何種途徑介導(dǎo)PTEN來調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路,從而影響肝癌細(xì)胞的增殖能力的,我們通過在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)帶有His標(biāo)簽的YAP和HA標(biāo)簽的PTEN蛋白,結(jié)合免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)用His抗體作為誘餌蛋白沉淀產(chǎn)物中能夠檢測(cè)到PTEN蛋白的表達(dá),反之當(dāng)用HA作為誘餌蛋白時(shí),通過免疫沉淀后western blot檢測(cè)到了YAP蛋白的表達(dá)(見圖4),表明YAP蛋白和PTEN蛋白在肝癌細(xì)胞中存在結(jié)合。

圖4 過表達(dá)His-YAP和HA-PTEN的HepG2細(xì)胞中YAP蛋白與PTEN蛋白的結(jié)合Figure 4 The binding of PTEN and YAP in hepatocellular carcinoma cell line HepG2 with His-YAP and HA-PTEN overexpression

3 討論

Hippo信號(hào)通路是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與調(diào)控器官大小的發(fā)育,干細(xì)胞自我更新及組織再生[10,11],與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)[6]。YAP是Hippo信號(hào)通路下游的效應(yīng)因子,從果蠅到哺乳動(dòng)物高度保守。正常情況下Hippo信號(hào)激活時(shí),YAP被降解。當(dāng)Hippo信號(hào)失活時(shí),YAP能夠進(jìn)入細(xì)胞核,與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子相互結(jié)合,啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)器官生長(zhǎng)和腫瘤的發(fā)生,然而目前對(duì)于這一調(diào)控的分子機(jī)制還不是很清楚[12]。本研究中,我們利用過表達(dá)或者干擾YAP蛋白的方式抑制或者激活Hippo信號(hào)同理進(jìn)而研究其在肝癌細(xì)胞增殖和異種移植瘤中發(fā)揮的作用及分子機(jī)制。

Hippo信號(hào)通路在腫瘤的研究中,Auer[13]首次報(bào)道了在淋巴瘤中Hippo信號(hào)通路的異常調(diào)節(jié),指出Hippo信號(hào)通路被作為一條新的有潛在參與發(fā)病機(jī)制的通路。果蠅或小鼠中Hippo信號(hào)通路中的抑癌基因失活或癌基因YAP的活化導(dǎo)致組織過度生長(zhǎng),特征性的表現(xiàn)為細(xì)胞分化增加而凋亡受抑制[14]。YAP轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟出現(xiàn)驚人的生長(zhǎng),并最終導(dǎo)致肝腫瘤的生長(zhǎng)[15,16]。YAP作為一種候選的癌基因,在多種類型的人類腫瘤中,其表達(dá)以及在細(xì)胞核的定位都明顯增加[17]。本研究中通過肝癌細(xì)胞中過表達(dá)和干擾YAP對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和成瘤能力的影響,證實(shí)了作為Hippo信號(hào)通路中關(guān)鍵分子,YAP蛋白能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖能力和成瘤能力,發(fā)揮癌基因的作用。

Hippo信號(hào)通路與人類癌癥的發(fā)生密切相關(guān),但是其與其他信號(hào)通路的相互作用機(jī)制以及YAP在體內(nèi)對(duì)癌癥發(fā)生的調(diào)節(jié)機(jī)制等方面還需要進(jìn)一步的研究,以闡明其在腫瘤發(fā)生中的作用。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)于器官大小的調(diào)節(jié)和干細(xì)胞的發(fā)育起著關(guān)鍵作用,在腫瘤中也發(fā)揮著重要的作用[1,18]。最近的研究表明在果蠅中,Hippo信號(hào)通路和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路之間存著相互調(diào)節(jié)作用[19-21]。在果蠅中,Hippo信號(hào)通路能夠通過負(fù)性調(diào)節(jié)AKT的活性抑制增長(zhǎng)[22]。然而,兩條信號(hào)通路在腫瘤中的相互作用及其分子機(jī)制仍不清楚。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)YAP過表達(dá)的肝癌細(xì)胞激活了細(xì)胞生長(zhǎng)的重要調(diào)控因子哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號(hào)通路。PTEN作為PI3K/AKT/mTOR的負(fù)調(diào)控因子,可以抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路。在肝癌細(xì)胞中,YAP與PTEN具有相互作用并可以抑制PTEN轉(zhuǎn)錄,下調(diào)PTEN蛋白的表達(dá),而PI3K/AKT/mTOR信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)控機(jī)制受到抑制,PI3K/AKT/mTOR信號(hào)途徑激活。因此肝癌細(xì)胞中YAP過表達(dá)激活了mTOR信號(hào)通路。我們還證實(shí)YAP通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號(hào)控制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和腫瘤形成。

綜上,本研究揭示了Hippo信號(hào)通路與PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路之間的相互作用與功能相關(guān)性,闡述了YAP蛋白作為Hippo信號(hào)通路關(guān)鍵分子作為癌基因參與肝癌細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制,為肝癌病因、診斷和治療的研究提供了新的分子基礎(chǔ)。