宋金鴿 焦宇辰

肝癌是全世界發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，其死亡率在腫瘤中位居第二位[1]。肝癌的腫瘤基因組研究已取得很大進(jìn)展，TERT啟動子、TP53、CTNNB1均為肝癌中的高頻突變基因[2]，而抑癌基因AT豐富結(jié)合域1A(ARID1A)作為染色質(zhì)重塑的相關(guān)基因，在肝癌中也經(jīng)常發(fā)生突變，且肝癌中ARID1A的表達(dá)量遠(yuǎn)低于癌旁組織[3]。但目前尚未發(fā)現(xiàn)其他染色質(zhì)重塑相關(guān)基因?qū)Ω伟┌l(fā)生發(fā)展的作用。多溴蛋白1(PBRM1)基因編碼ATP依賴的SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物的亞單位，該亞單位控制DNA轉(zhuǎn)錄的可接近性[4]。既往研究表明，肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌中也存在17%的PBRM1基因突變[5]。在黃曲霉相關(guān)肝細(xì)胞肝癌中也發(fā)現(xiàn)8.2%的樣本存在PBRM1基因突變[6]。因此，本研究通過應(yīng)用規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)(CRISPR)/CRISPR相關(guān)蛋白9(Cas9)系統(tǒng)基因編輯技術(shù)敲除人肝癌細(xì)胞系Huh7的PBRM1基因,構(gòu)建PBRM1基因敲除的肝癌細(xì)胞模型,以進(jìn)一步探討PBRM1基因敲除后肝癌細(xì)胞的功能變化。

材料與方法

1.材料:人肝癌細(xì)胞株Huh7購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心；Huh7細(xì)胞、Huh7-KO細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞均在添加10%胎牛血清、50 U/ml鏈霉素和青霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

2.方法

(1)構(gòu)建基因PBRM1雙拷貝敲除的Huh7細(xì)胞株：從在線數(shù)據(jù)庫(https://www.addgene.org/crispr/libraries/#geckov2)獲得CRISPR-sgRNA序列,PBRM1-sgRNA上游引物：5’-CACCGAGGTTGTCGAATAACCA-3’，下游引物：5’-AAACTGGTTTTCCGACTCCTC-3’。EcoRI(美國，New England Biolabs公司)將LentiCRISPRv2(美國，Addgene公司)載體截切形成粘性末端，用T4DNA連接酶(美國，New England Biolabs公司)將剪切后的載體與退火后的sgRNAs通過粘性末端連接，得到一個穩(wěn)定的表達(dá)載體。待HEK293細(xì)胞復(fù)蘇后進(jìn)行傳代培養(yǎng)以確保細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，然后按每孔1×105個細(xì)胞傳至六孔板中，培養(yǎng)1 d后，將表達(dá)載體、包裝質(zhì)粒pMD2.G(美國，Addgene公司)和psPAX2(美國，Addgene公司)共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后收集包含病毒的細(xì)胞上清，以1 000 r/min離心10 min后保存于-80 ℃冰箱。病毒感染Huh7細(xì)胞48 h后用4 μg/ml嘌呤霉素篩選陽性克隆。為獲得基因PBRM1雙拷貝敲除克隆，將所選細(xì)胞置于96孔板上，每孔1個細(xì)胞，15 d后提取DNA，而后進(jìn)行Sanger測序鑒定。PBRM1上游引物：5’-GTCTTCAGCCAGCCATA-3’，下游引物：5’-CCAAAGTGGAACCCAGTC-3’；擴(kuò)增條件如下：95 ℃ 10 min共1個循環(huán)；94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 5 min共1個循環(huán)。

(2)蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測PBRM1基因表達(dá)：用1%十二烷基硫酸鈉處理細(xì)胞沉淀，然后在100 ℃下煮沸10 min，以1 2000 r/min離心10min至溶液澄清。布拉德福德蛋白檢測試劑盒(中國，普利萊基因技術(shù)有限公司)用于蛋白質(zhì)濃度定量。隨后，在MES緩沖液(美國，Life Technologies公司)中將50～150 μg蛋白質(zhì)裝載于4%～12%的Bolt Bis Tris Plus凝膠(美國，Life Technologies公司)上。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至0.45 μm硝化纖維素膜(美國，BioRad公司)中。在含5%脫脂奶粉的Tris緩沖鹽水和0.1%吐溫20(TBST)中，室溫下將膜封閉1 h，然后在4 ℃下用一級抗體過夜培養(yǎng)。用TBST清洗膜，并在室溫下用辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合的二級抗體孵育1 h。采用超敏化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行蛋白檢測。應(yīng)用Adobe Photoshop軟件分析印跡。

(3)CCK-8法檢測細(xì)胞增殖：以每孔5 000個細(xì)胞(100 μl細(xì)胞懸液)接種至96孔板，將96孔板置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)。避光環(huán)境下，分別于24 h、48 h、72 h、96 h時(shí)間點(diǎn)向每孔加入10 μl的CCK-8溶液(日本，Dojindo公司)，將96孔板在培養(yǎng)箱內(nèi)放置4 h，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度(OD值)。

(4)克隆形成實(shí)驗(yàn)：在96孔細(xì)胞板中按照每孔200個細(xì)胞進(jìn)行鋪板，每組設(shè)置3個復(fù)孔。將96孔板置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期查看，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。，吸出并棄掉各孔的培養(yǎng)基，終止培養(yǎng)。用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫(甲醇配制，PBS稀釋)染色10 min，自來水沖洗后晾干，計(jì)算集落數(shù)(50個細(xì)胞以上)。采用酶聯(lián)斑點(diǎn)圖像自動分析儀進(jìn)行拍照分析。

(5)細(xì)胞周期檢測：10 μmol/L BrdU孵育細(xì)胞30 min，胰酶消化收集細(xì)胞后，用預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞，過夜。2 mol/L鹽酸(含0.1 mg/ml胃蛋白酶)室溫孵育20 min后PBS清洗，用50 μg/ml碘化丙啶(PI，美國，Sigma公司)和2 mg/μl 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，美國，Sigma公司)染色。隨后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

(6)轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA-seq)：分別取Huh7敲除(KO)細(xì)胞株和Huh7野生型(WT)細(xì)胞系的3組細(xì)胞，每組細(xì)胞分別提取RNA，進(jìn)行后續(xù)操作。首先將提取后的RNA通過NanoDropTMOne/OneC檢測純度(OD260/280、OD260/230比值)，經(jīng)過Life Invitrogen Qubit?3.0熒光定量儀精確定量及Agilent 4200 TapeStation系統(tǒng)精確檢測RNA完整性(RIN值)。隨后進(jìn)行文庫構(gòu)建，采用帶Oligo(DT)的磁珠，對具有polyA結(jié)構(gòu)的mRNA進(jìn)行捕獲。合成cDNA第1條鏈需要片段化mRNA(模板)、隨機(jī)寡核苷酸(引物)及M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系。合成cDNA第2條鏈需要先通過RNaseH降解RNA鏈，隨后需要dNTPs(原料)和DNA Polymerase Ⅰ體系。將純化后的cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、連接A尾和測序接頭。使用AMPure XP beads篩選200 bp左右的cDNA，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增后需要再次使用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，以獲得最終的測序文庫。質(zhì)控合格后，按相應(yīng)濃度和需求混合文庫，隨后進(jìn)行Illumina X10測序儀PE150測序。待數(shù)據(jù)下機(jī)質(zhì)控合格后，對兩組樣本的差異表達(dá)基因分別進(jìn)行GO和KEGG功能富集，GO富集主要描述差異基因富集的生物過程(BP)、分子功能(MF)和細(xì)胞組成(CC)。KEGG富集分析主要查看差異基因所集中的信號通路。在GO和KEGG富集結(jié)果中選取校正P值(多重假設(shè)檢驗(yàn)經(jīng)過 BH[7]方法校正后的P值)小于0.05且富集基因數(shù)排名靠前的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步討論。

(7)γ-干擾素(IFN-γ)刺激實(shí)驗(yàn)：將Huh7-WT、Huh7-KO細(xì)胞分組，以每孔5 000個細(xì)胞(100 μl細(xì)胞懸液)接種至96孔板，將96孔板置于37 ℃、5%CO2的條件下預(yù)培養(yǎng)。6 h細(xì)胞貼壁后，吸出并棄掉培養(yǎng)基，按組加入含0 U/ml、10 U/ml、100 U/ml、1 000 U/ml IFN-γ的DMEM培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。避光環(huán)境下，分別向每組的每孔加入10 μl的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板置于37 ℃，5% CO2的條件中培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀檢測在450 nm處的OD值。計(jì)算抑制率，抑制率=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100%[As：實(shí)驗(yàn)孔(含有培養(yǎng)基、CCK-8、IFN-γ)；Ac：對照孔(含有培養(yǎng)基、CCK-8，不含IFN-γ)；Ab：空白孔(不含細(xì)胞和IFN-γ的培養(yǎng)基、CCK-8)]。

結(jié) 果

1．PBRM1雙拷貝敲除Huh7細(xì)胞株的構(gòu)建：Sanger測序顯示目的區(qū)域被成功敲除(圖1A)，表明設(shè)計(jì)的sgRNA可高效編輯PBRM1基因。Western blot檢測轉(zhuǎn)染后的單克隆細(xì)胞株Huh7-KO，結(jié)果顯示Huh7-KO細(xì)胞株中PBRM1蛋白表達(dá)缺失，而Huh7-WT細(xì)胞系PBRM1蛋白表達(dá)正常，內(nèi)參GAPDH表達(dá)量正常且基本一致(圖1B)，說明本研究在Huh7細(xì)胞系中成功敲除了PBRM1基因。

圖1 PBRM1基因敲除細(xì)胞株的成功構(gòu)建[A：Huh7-KO細(xì)胞株與Huh7-WT細(xì)胞系的DNA在PBRM1基因目的區(qū)域的Sanger測序峰圖比對；B：Western blot檢測Huh7-KO細(xì)胞株和Huh7-WT細(xì)胞系的PBRM1蛋白表達(dá))

2.PBRM1基因的敲除抑制肝癌細(xì)胞增殖：培養(yǎng)48 h后，與Huh7-WT細(xì)胞系比較，Huh7-KO細(xì)胞株增殖活性明顯受到抑制(1.254±0.035比0.843±0.029,P<0.000 1)；72 h后抑制效果更加顯著(1.858±0.050比0.945±0.028,P<0.000 1，圖2A)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Huh7-WT細(xì)胞系比較，Huh7-KO細(xì)胞株的克隆形成數(shù)偏低，克隆形成明顯受到抑制(圖2B)。

圖2 Huh7-KO細(xì)胞株的細(xì)胞增殖情況[A:CCK-8測定的OD值96 h內(nèi)在Huh7-KO細(xì)胞株和Huh7-WT細(xì)胞系中的變化(P<0.000 1)；B：平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果]

3.表達(dá)差異基因的功能富集：Huh7-KO細(xì)胞株與Huh7-WT細(xì)胞系相比共篩選出5 603個差異表達(dá)基因，其中3 303個基因表達(dá)上調(diào)，2 300個基因下調(diào)。GO富集結(jié)果顯示，表達(dá)下調(diào)的相關(guān)BP主要關(guān)于細(xì)胞周期，如DNA復(fù)制(P<0.000 1，富集基因數(shù)=90)、染色體分離(P<0.000 1，富集基因數(shù)=100)、核分裂(P<0.000 1，富集基因數(shù)=96)、細(xì)胞時(shí)相過渡的下調(diào)(P<0.000 1，富集基因數(shù)=98)、核糖體的合成(P<0.000 1，富集基因數(shù)=74)；表達(dá)下調(diào)的CC主要與細(xì)胞分裂有關(guān)，包括中心體(P<0.000 1，富集基因數(shù)=83)、染色體(P<0.000 1，基因富集數(shù)=100)、紡錘絲(P<0.000 1，基因富集數(shù)=77)等；MF出現(xiàn)下調(diào)的通路主要包括核糖體結(jié)構(gòu)組成(P<0.000 1，富集基因數(shù)=67)、微管蛋白的結(jié)合(P<0.000 1，富集基因數(shù)=56)等(圖3A)；而表達(dá)上調(diào)的BP包括適應(yīng)性免疫應(yīng)答(P<0.000 1，富集基因數(shù)=86)及細(xì)胞對IFN-γ的反應(yīng)(P<0.000 1，富集基因數(shù)=45)。KEGG富集結(jié)果顯示，細(xì)胞周期(P<0.000 1，基因富集數(shù)=46)、DNA復(fù)制(P<0.000 1，富集基因數(shù)=28)及核糖體相關(guān)通路(P<0.000 1，富集基因數(shù)=56)明顯下調(diào)；而JAK-STAT相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)(P=0.028，基因富集數(shù)=38)。

4.PBRM1基因的敲除使Huh7肝癌細(xì)胞出現(xiàn)G1/S阻滯：Huh7-WT細(xì)胞系中處于G1期細(xì)胞的平均比例為(57.23±1.71)%，而Huh7-KO細(xì)胞株為(74.9±1.61)%，明顯高于Huh7-WT細(xì)胞系(P=0.016 6)。Huh7-WT細(xì)胞系中處于S期細(xì)胞的平均比例為(36.5±1.36)%，而Huh7-KO細(xì)胞株為(19.8±1.58)%，明顯低于Huh7-WT細(xì)胞系(P=0.000 2)。Huh7-WT細(xì)胞系和Huh7-KO細(xì)胞株處于G2/M期細(xì)胞的平均占比分別為(6.27±0.37)%和(5.26±0.59)%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 Huh7-WT細(xì)胞系和Huh7-KO細(xì)胞株在細(xì)胞周期中各時(shí)期細(xì)胞所占比例

5.PBRM1敲除可增強(qiáng)Huh7細(xì)胞對IFN-γ治療的敏感性：與此同時(shí)，在GO通路富集中，表達(dá)上調(diào)的BP還包括細(xì)胞對IFN-γ的反應(yīng)(P<0.000 1)。并且在KEGG分析中，我們發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因富集于JAK-STAT通路，而該通路為IFN-γ介導(dǎo)的信號通路[8]，因此將Huh7-WT細(xì)胞系和Huh7-KO細(xì)胞株分別在不同濃度梯度的IFN-γ中進(jìn)行培養(yǎng)，驗(yàn)證GO和KEGG功能富集的結(jié)果。結(jié)果顯示，1 000 U/ml IFN-γ對Huh7-KO細(xì)胞株組的細(xì)胞抑制作用明顯高于Huh7-WT細(xì)胞系組[抑制率分別為(58.32±3.28)%和(48.67±1.32)%，P=0.009 1]；未加IFN-γ的Huh-WT細(xì)胞系組的增殖率明顯高于Huh7-KO組[增殖率分別為(23.53±4.75)%和(45.88±5.46)%，P=0.005 9]。見圖4。

圖4 不同濃度IFN-γ對Huh7-WT和Huh7-KO的抑制作用(y軸中負(fù)值表示細(xì)胞生長未受到抑制，依舊處于增殖階段，對應(yīng)數(shù)值為增殖率)

討 論

本研究首次在肝癌細(xì)胞株中敲除PBRM1基因，并發(fā)現(xiàn)該基因的敲除可以導(dǎo)致細(xì)胞G1/S期阻滯從而抑制細(xì)胞株增殖。而PBRM1基因通常作為抑癌基因參與染色質(zhì)重塑在腎透明細(xì)胞癌中具有較高的突變頻率[9-10]，有研究報(bào)道，約40%的腎透明細(xì)胞癌患者存在PBRM1基因突變[11]，且PBRM1和BAP1的缺失與患者較差的預(yù)后相關(guān)[12]。在腎透明細(xì)胞癌的治療方面，PBRM1基因的功能缺失性突變與程序性死亡受體1(PD-1)治療有效顯著相關(guān)[13]。在腎透明細(xì)胞癌中進(jìn)行PBRM1基因的敲除可以導(dǎo)致80%腎癌細(xì)胞增殖顯著增加[11]，與本研究的結(jié)果相反。這可能由于PBRM1基因在不同腫瘤中的功能存在差異。且PBRM1基因的表達(dá)量和預(yù)后關(guān)系在不同類型腫瘤中也不盡相同，在腎透明細(xì)胞癌、結(jié)腸癌中PBRM1基因表達(dá)量較低的患者預(yù)后較差[14-15]，但在子宮內(nèi)膜癌中，PBRM1表達(dá)量的陽性率隨病理分級和臨床分期的增高而增加[16]。從網(wǎng)站The Human Protein Atlas中的PBRM1蛋白免疫組化染色結(jié)果也可以發(fā)現(xiàn)，肝癌中PBRM1基因的表達(dá)量高于正常肝臟組織。而PBRM1基因的表達(dá)量與肝癌的預(yù)后相關(guān)性研究尚有待開展。

眾所周知，肝臟切除和肝臟移植是早期肝癌的主要治療手段，對于不適合肝臟切除、肝臟移植或局部治療的患者，主要選擇索拉菲尼和樂伐替尼進(jìn)行多靶點(diǎn)分子治療[17]。即使這些治療可以提高患者生存期，但較大程度的細(xì)胞抑制和治療耐藥也是患者長期生存的重大限制。因此，有研究對晚期肝癌患者采用免疫檢查點(diǎn)阻斷治療。曲美母單抗是首次用于晚期丙型肝炎病毒(HCV)相關(guān)的肝細(xì)胞肝癌患者的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(CTLA-4)單抗，其治療應(yīng)答率適中(17%),應(yīng)答持續(xù)中位時(shí)間為6.5個月[18]。也有在亞洲地區(qū)進(jìn)行的臨床試驗(yàn)采用PD-1抗體納武利尤單抗治療索拉菲尼經(jīng)治的晚期肝癌患者，客觀應(yīng)答率為15%[19]。本研究結(jié)果顯示，敲除PBRM1基因的細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)的基因主要富集于免疫應(yīng)答，提示PBRM1基因敲除可能有助于免疫系統(tǒng)的活化，免疫治療的有效性可能會由于PBRM1的缺失得到進(jìn)一步提升。在其他類型腫瘤中，也有證據(jù)表明PBRM1缺失與免疫治療獲益相關(guān)。PBRM1基因中的功能缺失性突變使黑色素瘤模型小鼠對免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的聯(lián)合用藥反應(yīng)更加敏感，若無該突變，則會產(chǎn)生對免疫治療的耐藥[20]。在腎透明細(xì)胞癌中也發(fā)現(xiàn)，PBRM1缺失與免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的臨床獲益相關(guān)[13]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，Huh7-KO細(xì)胞株對IFN-γ的抑制作用更敏感，且IFN-γ介導(dǎo)的JAK-STAT通路相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。曾有研究表明JAK2的缺失會使PD-L1及主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類分子(MHC-Ⅰ)表達(dá)下調(diào)從而產(chǎn)生免疫阻斷治療耐受[21]，本研究的RNA-seq結(jié)果顯示，Huh7-KO細(xì)胞株JAK2表達(dá)上調(diào)，提示PBRM1基因的敲除可能通過促進(jìn)免疫應(yīng)答從而影響免疫檢查點(diǎn)阻斷對肝癌治療的療效。IFN-γ的體外治療可通過與受體結(jié)合并激活JAK-STAT信號通路，直接抑制腫瘤細(xì)胞生長并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[22]。隨后有研究表明，在非小細(xì)胞肺癌中，不同濃度IFN-γ對腫瘤細(xì)胞的作用不盡相同，低濃度IFN-γ優(yōu)先激活I(lǐng)CAM1-磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)-Notch1通路誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，高濃度IFN-γ優(yōu)先激活JAK-STAT通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[23]。我們通過IFN-γ刺激實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)低濃度IFN-γ促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、高濃度抑制增殖的現(xiàn)象。同時(shí)，IFN-γ信號通路還可以在抗腫瘤免疫中發(fā)揮免疫調(diào)控作用，可能會使免疫治療產(chǎn)生原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥[24-25]。IFN-γ信號通路的功能喪失會使腫瘤對CTLA4阻斷治療產(chǎn)生原發(fā)性耐藥導(dǎo)致治療無效。而長期的IFN-γ暴露會使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫逃逸，對免疫檢查點(diǎn)治療產(chǎn)生獲得性耐受，通過JAK抑制劑關(guān)閉干擾素途徑，可以改善免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的耐受問題[24]。還有研究表明，RIG-I表達(dá)量高的肝癌患者對于IFN-α治療更加有效[26]。但是在肝癌細(xì)胞株中PBRM1基因的敲除與免疫治療的相關(guān)性還有待探索。

綜上所述，在人肝癌細(xì)胞系Huh7中敲除PBRM1基因可以通過G1/S期阻滯抑制細(xì)胞增殖，且IFN-γ的殺傷作用在敲除PBRM1基因后的Huh7細(xì)胞株中更加顯著。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探討PBRM1基因在肝癌中的功能和作用奠定基礎(chǔ)，為肝癌的治療提供了新的思路。