張曉威

張曉威, 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 遼寧省錦州市 121000

核心提要: 本實驗創(chuàng)新性的構(gòu)建pcDNA3.1-ARHI質(zhì)粒,通過細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染MKN28細胞株,研究結(jié)果提示:ARHI基因過表達可抑制胃癌細胞MKN28的增殖, 促進細胞凋亡, 這可能與ARHI基因高表達后導(dǎo)致磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路中的血管內(nèi)皮生長因子、磷酸化蛋白激酶B蛋白表達降低有關(guān).這將為臨床治療提供給新的基因靶點.

0 引言

根據(jù)最新2018年全球癌癥統(tǒng)計報告, 胃癌(gastric cancer,GC)的死亡率在中國位居第二, 僅次于肺癌, 達39萬, 占比13.6%[1].較大多數(shù)GC患者確診時已是晚期, 5年生存率不足30%[2,3].目前研究已證實, 腫瘤的發(fā)生發(fā)展與表觀遺傳學(xué)總基因的甲基化修飾密切相關(guān)[4-6].ARHI為Ras超家族中的一員, 現(xiàn)已經(jīng)被證實可以抑制多種腫瘤生長, 其表達缺失與腫瘤的發(fā)生與進展密切相關(guān)[7-9].但是,針對ARHI基因?qū)C是否具有增殖抑制作用, 尚無報道,此次實驗以GC細胞株MKN28為例, 研究ARHI基因?qū)C細胞增殖、侵襲及凋亡的影響, 并探討其機制, 為臨床研究提供基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料 MKN28細胞由錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腦與脊髓實驗室饋贈, RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、二甲亞砜、結(jié)晶紫、及碘化丙啶購買于美國Sigma公司,檢測細胞凋亡所用試劑盒購買于南京凱基生物科技有限公司.ARHI、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)、β-actin抗體、兔Ⅱ抗、鼠Ⅱ抗購買于Santa Cruz公司.

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng): MKN28細胞在含10%濃度胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基內(nèi), 5% CO2、37 ℃溫度的孵箱內(nèi)培養(yǎng), 每36-60 h傳代.取處于對數(shù)生長期的MKN28細胞進行相關(guān)實驗.

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染: 以pcDNA3.1為載體, 由上海舜百生物科技有限公司構(gòu)建pcDNA3.1-ARHI質(zhì)粒并檢測; 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染細胞, 步驟如下: 取處于對數(shù)生長期的MKN28細胞, 以3×105個/mL濃度接種至6 cm培養(yǎng)皿內(nèi), 5%CO2、37 ℃的孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后, 更換新培養(yǎng)基, 將配置好的轉(zhuǎn)染體系(9 μL轉(zhuǎn)染試劑+200 μL培養(yǎng)基+2.4 μg質(zhì)粒)加入6 cm培養(yǎng)皿內(nèi), 混勻后于5% CO2、37 ℃的孵箱內(nèi)培養(yǎng)12 h后更換培養(yǎng)基, 24 h后加入G418(終濃度為500 μg/mL), 每日觀察細胞增殖情況, 每2-3 d更換培養(yǎng)基, 同時加入G418(終濃度為500 μg/mL), 直至細胞為單個群落, 挑取單克隆細胞株至24孔板內(nèi)孵育.逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)與Western blot實驗挑取穩(wěn)定高表達克隆株, 實驗重復(fù)3次.空載體Mock組做陰性對照組.

1.2.3 RT-PCR檢測各克隆細胞株ARHI基因mRNA表達水平: 收集處于對數(shù)生長的各組細胞, 加入Trizol液(每1×107個細胞加入1 mL), 取樣器反復(fù)吹打至混勻; 每1 mL Trizol加入0.2 mL氯仿后震蕩15 s后室溫放置5 min.12000g(4 ℃)下離心5 min, 取上層水相至新EP管內(nèi); 加入等體積的異丙醇, 混勻, -20 ℃放置30 min; 2000 r/min 4 ℃離心10 min, 棄去上清, 加入預(yù)冷的75%乙醇(DEPC水配制); 7500 r/min 4 ℃離心5 min, 棄去上清, 室溫內(nèi)放置晾干后加入DEPC水20 μL; 檢測mRNA濃度, 以最低濃度樣品為標(biāo)準, 配制各實驗組上機樣品并進行檢測,實驗重復(fù)3次.

1.2.4 Western Blot檢測蛋白表達: 收集對數(shù)期的MKN28細胞及各實驗組細胞, 加入適量蛋白裂解緩沖液, 震蕩, 于冰上裂解10 min, 然后13000g4 ℃溫度離心10 min.取上清, 棄去沉淀.以標(biāo)準BCA試劑確定蛋白濃度定量.通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同大小蛋白分離, 然后轉(zhuǎn)印蛋白至PVDF膜, 通過濃度為5%的脫脂牛奶封閉膜內(nèi)非特異性抗體.通過加入相應(yīng)一抗后與PVDF膜上的目的蛋白相反應(yīng), 4 ℃環(huán)境孵育12 h.洗滌PVDF膜后與相應(yīng)二抗在室溫環(huán)境下孵育1 h, 洗滌PVDF膜3次.在PVDF膜上滴加化學(xué)發(fā)光試劑, 后通過X射線片曝光、顯像, 記錄.內(nèi)參對照選β-actin, 觀察ARHI、VEGF、Bcl-2、AKT、p-AKT、β-actin蛋白的表達情況.實驗重復(fù)3次.

1.2.5 MTT比色法檢測細胞增殖: 取生長處于對數(shù)期的MKN28細胞及各實驗組細胞株接種于96孔板, 每空接種細胞約8×103個, 每組設(shè)5個重復(fù)孔, 5% CO2、37 ℃溫度的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)24 h、48 h及72 h后, 在96孔板內(nèi)每孔加入20 μL MTT, 繼續(xù)孵育4 h, 棄去上清, 每孔加入150 μL二甲亞砜, 震蕩混勻, 通過酶標(biāo)儀測定96孔板中每孔在490 nm波長處的吸光度值, 取平均值, 繪制生長曲線, 計算各組細胞增殖率.實驗重復(fù)3次.

1.2.6 細胞劃痕實驗檢測各組細胞株遷移能力: 將MKN28細胞、Mock組及clone4細胞株接種于6孔板5×105個/孔, 培養(yǎng)至單層鋪滿, PBS液沖洗1次, 10 μL槍頭尖端分別在6孔板細胞上垂直劃痕, 后用PBS液再清洗2次, 加入含1%胎牛血清的1640培育基中, 余為對照組, 均設(shè)2個復(fù)孔.分別于0 h、48 h倒置相差顯微鏡(×400)下觀測劃痕細胞遷徙狀況并照相, 測定劃痕間距,計算遷移率并進行統(tǒng)計學(xué)分析.實驗重復(fù)3次.

1.2.7 Transwell實驗檢測各組細胞株侵襲能力: 分別將處于對數(shù)生長期的MKN28細胞、Mock組及clone4細胞株, 制成細胞密度為1×105個/mL的細胞懸液, 取200 μL滴入Transwell上小室6孔板, 下室加500 μL含10%FBS的1640培育基, 均設(shè)2個復(fù)孔.于7 ℃培育48 h 后, 棉簽去掉小室內(nèi)表面殘存細胞, 4%多聚甲醛固定后通過0.1%結(jié)晶紫染色, PBS液清洗, 生物顯微鏡進行拍照并計數(shù).實驗重復(fù)3次.

1.2.8 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡: 培養(yǎng)MKN28細胞、Mock組及clone4細胞株至對數(shù)生長期, 更換培養(yǎng)基為無胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)24 h后, 5% CO2、37 ℃溫度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后, 收集不同處理組細胞, 4 ℃PBS洗滌3次, 調(diào)整每組樣品中細胞濃度約為1.5×109/L ,分別按Annexin V FITC及PI試劑盒操作步驟及周期試劑盒操作步驟進行實驗, 檢測各組細胞凋亡率, 其中Annexin V FITC+/PI-的細胞百分率即為早期凋亡細胞率, Annexin V FITC+/PI+的細胞百分率即晚期細胞凋亡率, 二者之和為總凋亡率.實驗重復(fù)3次.

統(tǒng)計學(xué)處理以SPSS 20.0進行統(tǒng)計學(xué)分析, 通過t檢驗分析比較數(shù)據(jù),P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測MKN28細胞株及各克隆細胞株中ARHI基因mRNA表達水平 與MKN28細胞株相比, Mock組ARHI基因mRNA表達量1.003±0.073(P＞0.05); clone1細胞株ARHI基因mRNA表達量0.899±0.056(P＞0.05); clone2細胞株ARHI基因mRNA表達量1.995±0.0127(P＜0.05);clone4細胞株ARHI基因mRNA表達量4.383±0.329(P＜0.05)(圖1、表1).

2.2 Western Blot實驗檢測MKN28細胞株及各克隆細胞株中ARHI蛋白表達水平 與MKN28細胞株相比, Mock組ARHI蛋白表達量0.252±0.007(P＞0.05); clone1細胞株ARHI蛋白表達量0.254±0.004(P＞0.05); clone2細胞株ARHI蛋白表達量0.524±0.001(P＜0.05); clone4細胞株ARHI蛋白表達量0.997±0.012(P＜0.05)(圖2、表2).結(jié)合RT-PCR結(jié)果, clone4細胞株內(nèi)ARHI基因轉(zhuǎn)錄mRNA水平及ARHI蛋白水平均較高, 故選取clone4高表達株作實驗組.

2.3 MTT實驗檢測MKN28細胞株、MOCK組及Clone4細胞株增殖水平 與MKN28細胞株相比, Mock組細胞增殖能力無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05); clone4細胞株48 h增殖能力為0.826±0.005(P＜0.05), 72 h增殖能力為1.589±0.006(P＜0.05)(圖3、表3).

2.4 細胞劃痕實驗檢測MKN28細胞株、MOCK組及Clone4細胞株遷移水平 與MKN28細胞株遷移率(19.92%±0.23%)相比, Mock組細胞遷移率(18.30%±0.53%)無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05); clone4細胞株48 h遷移率為4.30%±1.57%(P＜0.05)(圖4、表4).

2.5 Transwell實驗檢測MKN28細胞株、Mock組及Clone4細胞株侵襲水平 與MKN28細胞株48 h侵襲(234±3.61)相比, Mock組細胞侵襲能力(235±4.51),無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05); clone4細胞株侵襲能力為93.3±2.08(P＜0.05)(圖5、表5).

2.6 流式細胞術(shù)檢測MKN28細胞株、Mock組及Clone4細胞株凋亡水平 流式細胞術(shù)檢測各組細胞48 h總凋亡率顯示, 與MKN28細胞株總凋亡率(3.51%±0.02%)相比, Mock組細胞總凋亡率為(3.60%±0.03%), 無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05); clone4細胞株總凋亡率為14.13%±0.03%(P＜0.05)(圖6、表6).

2.7 Western blot檢測MKN28細胞株、Mock組及Clone4細胞株內(nèi)各蛋白表達水平 Western blot檢測各組細胞蛋白表達顯示, 與MKN28細胞株相比, Mock組細胞內(nèi)各蛋白表達無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05); clone4細胞株內(nèi)ARHI、VEGF、Bcl-2、p-AKT蛋白表達具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05), AKT蛋白表達無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)(圖7、表7).

3 討論

眾所周知, 腫瘤的發(fā)生發(fā)展與癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相關(guān)[10-12].ARHI基因, 作為Ras家族中的一員,長度大約為8 kb, 包含2個外顯子及1個內(nèi)含子.相關(guān)研究證實: 其編碼蛋白已經(jīng)證實在人乳腺、卵巢內(nèi)表達, 結(jié)腸癌、胰腺癌、宮頸癌、肝細胞癌、卵巢癌及喉鱗癌內(nèi)ARHI蛋白表達降低[13-16].

本實驗以GC細胞株MKN28為例, 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ARHI質(zhì)粒,通過RT-PCR及Western blot篩選高表達細胞克隆株作為實驗組, 空載體MOCK組做陰性對照組, 結(jié)果提示ARHI過表達后可抑制GC細胞株MKN28增殖, 降低其侵襲和遷移能力, 并促進其凋亡,這與多數(shù)研究相一致, 為此, 我們進一步檢測了相關(guān)蛋白, 進一步明確相關(guān)機制.大量研究顯示Ras基因相關(guān)的信號通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[17], 而Ras啟動的下游信號通路, 目前公認的主要有兩個, 一個是Ras-Raf-MAPKK-MAPK通路, 另外一個則是磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)/AKT通路.針對PI3K/AKT通路, PI3Ks蛋白家族參與細胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運等多種細胞功能的調(diào)節(jié), 活化的p-AKT可下調(diào)上皮型鈣黏蛋白及β-連環(huán)蛋白和上調(diào)間充質(zhì)細胞中的波形蛋白表達, 促進細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化, 進而降低了細胞黏附力, 促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[18], 這與本實驗結(jié)果相一致,ARHI高表達克隆株細胞遷移能力降低, 侵襲能力降低, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義, 提示ARHI高表達可抑制腫瘤細胞遷移及侵襲能力.活化的AKT通過磷酸化多種酶、激酶和轉(zhuǎn)錄因子等, 在調(diào)節(jié)細胞凋亡中起著至關(guān)重要的作用.研究證實: PI3K/AKT通路在被激活后, 會導(dǎo)致細胞周期蛋白D1的降解減少, 推動細胞周期進行, 促進腫瘤細胞增殖.陸英等[19]報道顯示ARHI基因表達增高可以抑制細胞周期內(nèi)G2期向M期進展,進而抑制細胞分裂; 此外, Li[20]報道稱ARHI基因過表達可導(dǎo)致乳腺癌細胞周期內(nèi)G1期向S期進展抑制細胞分裂, 這可能與細胞類型不同有關(guān).

表1 RT-PCR檢測MKN28細胞株及各克隆細胞株內(nèi)ARHI基因mRNA表達量

表2 MKN28細胞株及各克隆細胞株內(nèi)中ARHI蛋白表達灰度值測量

表3 MTT檢測MKN28、Mock組及clone4細胞株增殖率

表4 細胞劃痕檢測MKN28、Mock組及clone4細胞株遷移率

表5 細胞Transwell實驗檢測MKN28、Mock組及clone4細胞株侵襲率

表6 MKN28、Mock組及clone4細胞株總凋亡率統(tǒng)計

表7 MKN28、Mock組及clone4細胞株內(nèi)蛋白表達灰度值測量

Bcl-2基因是公認的癌基因, 可通過阻止細胞色素c從線粒體釋放至細胞質(zhì), 從而抑制腫瘤細胞凋亡, 促進增殖.AKT作為Bcl-2的上游蛋白, 當(dāng)AKT磷酸化水平降低后, 引起B(yǎng)cl-2蛋白表達降低, 進而導(dǎo)致細胞增殖能力降低, 凋亡率增加, 這與本實驗凋亡結(jié)果相一致, 提示ARHI蛋白可以通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路進而調(diào)節(jié)細胞凋亡.

總之, 本實驗結(jié)果表明ARHI基因過表達可抑制GC細胞MKN28的增殖, 促進細胞凋亡, 這可能與ARHI高表達后導(dǎo)致PI3K/AKT通路中的VEGF、p-AKT蛋白表達降低有關(guān), 這也可能為GC的治療提供新的基因靶點.

文章亮點

實驗背景

胃癌(gastric cancer, GC)作為消化道最常見的腫瘤之一,在診斷時往往伴有腹腔內(nèi)廣泛轉(zhuǎn)移, 因此進一步明確GC侵襲轉(zhuǎn)移的機制至關(guān)重要,ARHI基因已經(jīng)被證實對多種腫瘤細胞具有抑制作用.進一步明確ARHI基因高表達對GC細胞的影響, 可為GC的診斷提供新思路.

實驗動機

本研究擬明確:ARHI基因是否抑制GC細胞株增殖能力、遷移能力、侵襲能力; 是否可促進GC細胞株凋亡.實驗結(jié)果將為GC患者的治療提供新的基因靶點.

實驗?zāi)繕?biāo)

本研究結(jié)果顯示ARHI基因可以抑制GC細胞株增殖能力、遷移能力、侵襲能力; 并促進GC細胞株MKN28的凋亡, 進一步明確了ARHI基因的功能, 為動物實驗、臨床實驗提供了基礎(chǔ).

實驗方法

實驗首選通過構(gòu)建pcDNA3.1-ARHI質(zhì)粒, 后轉(zhuǎn)染至MKN28細胞內(nèi), 為進一步明確轉(zhuǎn)然后單克隆細胞內(nèi)ARHI基因及蛋白表達情況, 后進行了RT-PCR及Western blot實驗; 篩選出高表達克隆株clone4后, 通過MTT實驗檢測細胞增殖能力; 細胞劃痕實驗檢驗細胞遷移能力;流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡能力; Western blot實驗檢測細胞內(nèi)蛋白表達情況.

圖4 細胞劃痕檢測MKN28、Mock組及clone4細胞株遷移能力.比例尺: 1:100 μm.

圖5 Transwell實驗檢測MKN28、Mock組及clone4細胞株侵襲能力.

圖6 流式細胞術(shù)檢測MKN28、Mock組及clone4細胞株凋亡率.

實驗結(jié)果

本項實驗達到預(yù)期實驗結(jié)果,ARHI基因可以抑制GC細胞株增殖能力、遷移能力、侵襲能力; 并促進GC細胞株MKN28的凋亡.為接下來動物實驗及臨床實驗提供基礎(chǔ)及指導(dǎo).

實驗結(jié)論

圖7 Western blot檢測MKN28、Mock組及clone4細胞株內(nèi)蛋白表達.

ARHI基因過表達可抑制GC細胞MKN28的增殖, 促進細胞凋亡, 這可能與ARHI基因高表達后導(dǎo)致PI3K/AKT通路中的VEGF、p-AKT蛋白表達降低有關(guān).通過此次實驗, 有望將ARHI基因作為新的基因靶點, 為GC患者的治療提供新方案, 同時有望成為GC是否發(fā)生轉(zhuǎn)移的監(jiān)測指標(biāo).

展望前景

實驗未來研究的方向, 主要是: (1)構(gòu)建動物模型, 進行組織學(xué)水平實驗; (2)收集臨床標(biāo)本, 通過免疫組化、組織芯片等技術(shù)進一步提高說服力.