李 潺 張 翔 鄭 蘭 常成龍 劉彩霞 鄭 密 由香玲*

(1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040； 2.四平市國有林總場石嶺子落葉松國家良種基地，四平 136000； 3.東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040)

同源異型盒(Homeobox)基因編碼是一個由60個(或61個)保守氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)域，即同源結(jié)構(gòu)域(HD)[1]。Homeobox基因在植物中可以分為14個類群，分別是HD-ZipⅠ、HD-ZipⅡ、HD-ZipⅢ、HD-ZipⅣ、WOX、PLINC、BEL、KNOX、DDT、PINTOX、PHD、LD、NDX及SAWADEE[2]。Homeobox基因幾乎參與了植物生命周期中的全部發(fā)育過程，特別是與激素反應(yīng)有關(guān)的重要途徑。它們決定了植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)并參與莖尖和根尖分生組織的發(fā)育過程，同時還調(diào)控花發(fā)育的啟動并控制胚珠和果實的形成[3～5]，如：KNOX基因的成員通常在莖尖分生組織(SAM)中表達(dá)，并在植物發(fā)育過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和分化間的平衡[6]；WOX類基因是胚胎形成的關(guān)鍵[7]。

HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子是包含同源域(HD)和亮氨酸拉鏈(LZ)基序的一個植物特異性蛋白質(zhì)的大家族[8～10]。根據(jù)編碼基因的結(jié)構(gòu)和DNA的結(jié)合特異性，HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子分為4個亞家族[11]，不同的亞家族成員具有不同的生物學(xué)功能。其中HD-ZipⅠ亞家族在光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、非生物脅迫、葉片發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用[12]；HD-ZipⅡ亞家族響應(yīng)光照條件及生長素的變化[13～14]；HD-ZipⅢ亞家族成員調(diào)節(jié)頂端分生組織和維管束的發(fā)育，并影響生長素運輸[15]；HD-ZipⅣ亞家族基因于植物器官的外細(xì)胞層中特異性表達(dá)，在表皮細(xì)胞分化、根系發(fā)育和花青素積累等方面發(fā)揮作用[8]。

HB22蛋白是HD-ZipⅠ亞家族的成員之一，目前關(guān)于楊樹HB22基因在煙草中異源表達(dá)的研究報道較少。本試驗從小黑楊中克隆PsnHB22基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體，進(jìn)行煙草遺傳轉(zhuǎn)化并分析獲得的轉(zhuǎn)基因植株相關(guān)生物學(xué)特性，為后續(xù)深入研究PsnHB22基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

野生型煙草(Nicotianatabacum)種子，野生型小黑楊(Populussimonii×P.nigra)組培苗均為本實驗室保存。

1.2 菌株及主要試劑

大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)、pEASY-T1 Cloning Vector購自北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司；根瘤農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；植物表達(dá)載體pROKⅡ質(zhì)粒，由山東師范大學(xué)張慧教授惠贈；RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)(BioTeke)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自杭州博日科技(Bioer)有限公司；PCR試劑、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶、DNA Ligation Kit、PrimeScriptTMRT reagent Kit、TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ熒光定量試劑盒等購自TaKaRa公司；其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 小黑楊總RNA提取及PsnHB22基因的克隆

利用BioTeke通用植物總RNA提取試劑盒提取野生型小黑楊組培苗葉片總RNA，并使用PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以小黑楊cDNA為模板，利用特異性引物PsnHB22-F(5′-ATCTCTAGAATGGAAAGTGATAGCACAAATGATC-3′)/PsnHB22-R(5′-ATCGGTACCCTTACTGGGTGGTAAGAGAAGATG-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性20 s，56℃退火20 s，72℃延伸7 s，40個循環(huán)；72℃再延伸5 min，PCR反應(yīng)結(jié)束后將所有PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并使用膠回收試劑盒對目的條帶進(jìn)行切膠回收，將膠回收產(chǎn)物連接pEASY-T1載體后轉(zhuǎn)化Trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布于(50 mg·L-1Kan)LB平板上，37℃培養(yǎng)12～16 h。挑取單克隆菌落進(jìn)行菌液PCR檢測，將陽性單克隆菌液送哈爾濱擎科生物公司測序，保存測序結(jié)果正確的菌液，并命名為pEASY-T1-PsnHB22。

1.3.2 植物表達(dá)載體構(gòu)建

利用Bioer公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取pEASY-T1-PsnHB22大腸桿菌質(zhì)粒和pROKⅡ質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、KpnⅠ雙酶切pEASY-T1-PsnHB22質(zhì)粒及pROKⅡ載體質(zhì)粒，利用DNA Ligation Kit試劑盒連接PsnHB22和pROKⅡ片段并轉(zhuǎn)化Trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布于(50 mg·L-1Kan)LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆菌落進(jìn)行菌液PCR檢測，將PCR條帶大小正確的菌液送哈爾濱擎科生物公司測序，保存測序結(jié)果正確的菌液，并命名為pROKⅡ-PsnHB22。提取pROKⅡ-PsnHB22菌液的質(zhì)粒，進(jìn)行GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并利用通用引物pROKⅡ-F(5′-AAGACCGGCAACAGGATTC-3′)/pROKⅡ-R(5′-CGCACAATCCCACTATCCTT-3′)進(jìn)行PCR檢測。

1.3.3 轉(zhuǎn)基因株系的獲得及分子檢測

政府引導(dǎo)基金的發(fā)展模式方面，李洪江和鮑曉燕(2012)通過比較國外政府引導(dǎo)基金的經(jīng)濟(jì)績效和投資結(jié)果，對我國政府引導(dǎo)基金的發(fā)展模式進(jìn)行了評估并指出了國外經(jīng)驗的借鑒意義。蕭端和熊婧(2014)以YOZMA基金為案例，從運行機(jī)制和運作效率等角度對以色列政府引導(dǎo)基金的制度設(shè)計進(jìn)行了觀測，在此基礎(chǔ)上為國內(nèi)政府引導(dǎo)基金的平穩(wěn)發(fā)展提供了政策性建議。燕志雄等(2016)則從代理成本視角入手，指出政府引導(dǎo)基金可能會遭受合謀問題，良好的監(jiān)管和治理機(jī)制成為政府引導(dǎo)基金健康發(fā)展的重要外部條件。

選取組培瓶內(nèi)煙草已展開的綠色大葉片，用無菌手術(shù)刀切除葉片主葉脈，將葉片切成大小約1 cm×1 cm的形狀，將切好的葉片浸入OD600值為0.2～0.4的農(nóng)桿菌侵染液中10 min，侵染結(jié)束后取出葉片，均勻擺放到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2 d。將共培養(yǎng)的煙草葉片脫菌后放入選擇培養(yǎng)基(10 mg·L-1Kan、200 mg·L-1特美汀)培養(yǎng)，1個月后獲得煙草抗性植株。用CTAB法提取煙草抗性植株DNA，利用pROKⅡ載體通用引物進(jìn)行PCR，并通過1%瓊脂糖凝膠檢測。

1.3.4 實時熒光定量PCR檢測

利用TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ熒光定量試劑盒提取煙草轉(zhuǎn)基因株系總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。取20 ng cDNA進(jìn)行定量檢測，定量PCR引物序列為：PsnHB22-RT-F(5′-TCACTTTCCACCCTCCAATG-3′)/PsnHB22-RT-R(5′-TCTTTCCACTCCTTTCACCTG-3′)，以NtActin為內(nèi)參基因，引物序列為：NtActin-RT-F(5′-TGTGTTGGACTCTGGTGATG-3′)/NtActin-RT-R(5′-CGCTCGGTAAGGATCTTCATC-3′)。實時定量反應(yīng)程序如下：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 35 s，40個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。每個樣品重復(fù)3次，并通過2-ΔΔCt法進(jìn)行計算。

1.3.5 轉(zhuǎn)基因植株的株高和葉片觀察

選取煙草表達(dá)量較高的4個轉(zhuǎn)基因株系及野生型各6株移至溫室，對營養(yǎng)生長旺盛的3月齡煙草測定其株高、葉長、葉寬等物理性狀，并進(jìn)行差異顯著性分析。

1.3.6 轉(zhuǎn)基因植株葉片細(xì)胞形態(tài)分析

為了比較轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草葉片表皮細(xì)胞的差異，分別取轉(zhuǎn)基因及野生型煙草自下而上第七片葉進(jìn)行顯微觀察，取葉片同部位不含葉脈的下表皮，制片并在光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。

1.3.7 轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量的測定

分別取煙草轉(zhuǎn)基因株系和野生型相同部位的葉片進(jìn)行葉綠素含量的測定，采用購自柯尼卡美能達(dá)(中國)投資有限公司的SPAD-502 Plus葉綠素測定儀測定葉綠素SPAD值，每組進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

2 實驗結(jié)果

2.1 小黑楊PsnHB22基因的克隆

利用RNA提取試劑盒提取小黑楊總RNA，濃度測定后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行PsnHB22基因擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序結(jié)束后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示：擴(kuò)增條帶大小和預(yù)期目標(biāo)一致(見圖1A)。膠回收目的條帶后與pEASY-T1載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行菌液PCR驗證(見圖1B)，比對測序結(jié)果，將基因序列正確的菌液命名為pEASY-T1-PsnHB22。

圖1 PsnHB22基因的克隆及鑒定 A.PsnHB22基因的克隆(M. DNA marker DL5000；1. PsnHB22基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)； B.pEASY-T1-PsnHB22的菌液PCR檢測(M. DNA marker DL5000；1～4. pEASY-T1-PsnHB22單菌落)Fig.1 The cloning and identification of PsnHB22 gene A.The cloning of PsnHB22 gene(M. DNA marker DL5000; PCR amplification product of PsnHB22 gene); B. PCR detection of pEASY-T1-PsnHB22(M. DNA marker DL5000; 1-4. The single colonies of pEASY-T1-PsnHB22)

2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

利用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、KpnⅠ雙酶切pEASY-T1-PsnHB22質(zhì)粒及pROKⅡ載體質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(見圖2A)，并膠回收目的片段，使用DNA Ligation Kit連接目的片段后轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行菌液PCR檢測(見圖2B)，PCR擴(kuò)增的特異性條帶與目的條帶大小一致。測序結(jié)果表明連接正確，基因未發(fā)生突變，pROKⅡ-PsnHB22植物表達(dá)載體構(gòu)建成功。提取pROKⅡ-PsnHB22大腸桿菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行PCR檢測(見圖2C)，結(jié)果表明pROKⅡ-PsnHB22植物表達(dá)載體成功導(dǎo)入GV3101農(nóng)桿菌中。

圖2 植物表達(dá)載體pROKⅡ-PsnHB22的構(gòu)建 A.限制性內(nèi)切酶對pEASY-T1-PsnHB22質(zhì)粒的雙酶切電泳圖(M. DNA marker DL5000；1. pEASY-T1-PsnHB22)；B. pROKⅡ-PsnHB22菌液PCR檢測(M. DNA marker DL5000；1～3. pROKⅡ-PsnHB22單菌落)；C.農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)化子的菌液PCR檢測(M. DNA marker DL5000；1～5.GV3101農(nóng)桿菌菌液PCR檢測)Fig.2 Construction of plant expression vector pROKII-PsnHB22 A. Restriction enzyme digestion of pEASY-T1-PsnHB22 plasmid(M. DNA marker DL5000; 1. pEASY-T1-PsnHB22); B. pROKII-PsnHB22 bacterial solution PCR detection(M. DNA marker DL5000; 1-3. pROKII-PsnHB22 single colony); C. Bacterial PCR detection of Agrobacterium GV3101 transformant(M. DNA marker DL5000; 1-5. PCR detection of GV3101 Agrobacterium)

圖3 轉(zhuǎn)基因株系的DNA分子檢測 M. DNA marker DL5000；1,13.陽性對照；2～12、14-23.PsnHB22轉(zhuǎn)基因煙草驗證；24.野生型對照Fig.3 DNA molecular detection of transgenic lines M. DNA marker DL5000; 1,13. Positive control; 2-12,14-23. Validation of PsnHB22 transgenic tobacco; 24. Wild type control

圖5 轉(zhuǎn)基因煙草表型觀察 A.轉(zhuǎn)基因煙草株高觀察；B.轉(zhuǎn)基因煙草葉片觀察；C.轉(zhuǎn)基因煙草第6片葉的表型觀察Fig.5 Phenotypic observation of transgenic tobacco A.Plant height observation of transgenic tobacco; B.Leaf observation of transgenic tobacco; C.Phenotypic observation on the 6th leaf of transgenic tobacco

圖4 轉(zhuǎn)基因株系的qRT-PCR檢測Fig.4 qRT-PCR detection of transgenic lines

圖6 轉(zhuǎn)基因煙草葉長、葉寬的統(tǒng)計分析 *顯著相關(guān)水平(P<0.05)；***極顯著相關(guān)水平(P<0.001)Fig.6 Statistical analysis of leaf length and leaf width of transgenic tobacco * means correlation is significant at the 0.05 level; *** means correlation is significant at the 0.001 level

2.3 轉(zhuǎn)基因株系的獲得及分子檢測

利用已轉(zhuǎn)化pROKⅡ-PsnHB22質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101菌液侵染煙草葉片，經(jīng)4～6周的選擇培養(yǎng)后獲得抗性芽，并進(jìn)行生根培養(yǎng)，共獲得17個煙草轉(zhuǎn)基因株系。提取轉(zhuǎn)基因煙草及野生型基因組DNA，利用pROKⅡ通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(見圖3)，結(jié)果顯示PsnHB22基因已經(jīng)整合入煙草基因組中。

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的實時熒光定量PCR檢測

提取轉(zhuǎn)基因煙草總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測(見圖4)，以表達(dá)量最低的轉(zhuǎn)基因株系L1為參照，各轉(zhuǎn)基因株系相對表達(dá)量如圖所示。其中L4、L6、L7、L10、L11、L17轉(zhuǎn)基因株系表達(dá)量最高；L3、L5、L8、L13、L14、L15、L16表達(dá)量低于以上株系；L2、L9、L12轉(zhuǎn)基因株系表達(dá)量最低。

2.5 轉(zhuǎn)基因植株的株高和葉片觀察

選取目的基因表達(dá)量高的4個轉(zhuǎn)基因株系(L4、L6、L10、L17)及野生型煙草移至溫室后觀察3月齡煙草土培苗表型，結(jié)果顯示，在營養(yǎng)生長旺盛的時期，轉(zhuǎn)基因煙草株高明顯低于野生型(見圖5A)，并且相較于野生型煙草，轉(zhuǎn)基因煙草相同部位的葉片出現(xiàn)性狀差異(見圖5B,C)，分別測量煙草不同株系第6、9、10、11、12片葉的葉長和葉寬，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果如圖6所示，轉(zhuǎn)基因煙草株系葉長與野生型煙草相比無明顯差異，L6、L10葉寬在第6片葉具有顯著差異，L17葉寬在第9片葉具有顯著差異。

2.6 轉(zhuǎn)基因煙草葉片細(xì)胞形態(tài)分析

光學(xué)顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因煙草及野生型相同部位的葉片表皮細(xì)胞，結(jié)果如圖7，相較野生型煙草葉片表皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因煙草L6、L10葉片表皮細(xì)胞變小，L4、L17表皮細(xì)胞與野生型植株差異不大。

2.7 轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量的測定

測定轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草相同部位葉片的葉綠素含量，結(jié)果顯示：L4、L6、L10、L17等4個轉(zhuǎn)基因煙草株系中葉綠素含量均高于野生型，如圖8所示。

3 討論

HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能可分為4個亞家族，HD-ZipⅠ亞家族在光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、 非

圖7 轉(zhuǎn)基因煙草葉片表皮細(xì)胞的觀察 A.野生型煙草葉片表皮細(xì)胞；B～E.分別為轉(zhuǎn)基因煙草L4、L6、L10、L17葉片表皮細(xì)胞Fig.7 Observation of epidermal cells in transgenic tobacco leaves A.Leaf epidermal cells of wild type tobacco; B-E.Leaf epidermal cells of transgenic tobacco L4,L6,L10 and L17

圖8 轉(zhuǎn)基因煙草葉綠素含量的測定Fig.8 Determination of chlorophyll content in transgenic tobacco

生物脅迫、葉片發(fā)育等方面具有重要作用。HB22轉(zhuǎn)錄因子作為HD-ZipⅠ家族的成員之一，具有重要作用。有研究表明，在擬南芥中，HB22基因可能通過赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來延長種子壽命[22]，也可能與CRY1基因互作介導(dǎo)藍(lán)光響應(yīng)[23]。

葉片是植物中的主要光合器官，具有很高的發(fā)育可塑性[24]。盡管葉片大小和形狀的改變對于植物存活極其重要，但是植物調(diào)控葉片發(fā)育的分子機(jī)制尚未完全清楚。有報道指出，如I類KNOX家族蛋白、ASYMMETRIC LEAVES1(AS1)、AS2、III類同源域—亮氨酸拉鏈蛋白、AUXIN RESPONSE FACTOR3(ARF3)、ARF4，KANADI、YABBY家族蛋白及ANGUSTIFOLIA3蛋白等均參與調(diào)節(jié)了葉片發(fā)育的不同階段[25]。

HD-ZipⅠ亞家族中，ATHB13在轉(zhuǎn)基因植物中的組成型高水平表達(dá)導(dǎo)致子葉和葉片發(fā)育發(fā)生改變，與野生型相比，特別是在含有可代謝糖的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因植物的子葉和葉片更狹窄，提示ATHB13是蔗糖信號通路的組成部分[26]；煙草中ATHB1異位表達(dá)的影響已被解釋為ATHB1可能參與了葉片發(fā)育的控制過程[27]；ATHB7在轉(zhuǎn)基因擬南芥中組成型高水平表達(dá)時，會成為缺水條件下充當(dāng)花序和葉細(xì)胞伸長的負(fù)調(diào)節(jié)劑，導(dǎo)致植物表型的改變[28]。關(guān)于HD-ZipⅠ類3個基因的已知功能注釋表明，這些基因在生長過程中控制了特定細(xì)胞類型的發(fā)育。結(jié)合本試驗數(shù)據(jù)顯示，PsnHB22基因可能在植物發(fā)育中充當(dāng)了伸長葉片的調(diào)節(jié)劑。

本試驗為探究PsnHB22基因的功能，從小黑楊中克隆得到PsnHB22基因，遺傳轉(zhuǎn)化煙草并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的生物學(xué)特性研究。研究表明，在營養(yǎng)生長旺盛時期，轉(zhuǎn)基因煙草長勢較弱，株高明顯低于野生型；部分轉(zhuǎn)基因株系葉片狹窄，與野生型相比具有顯著差異，且這些轉(zhuǎn)基因株系葉片表皮細(xì)胞相較野生型表皮細(xì)胞變小；轉(zhuǎn)基因煙草葉綠素含量顯著高于野生型，這與前人研究結(jié)果相一致[29]。由此推測PsnHB22基因在植株株高生長、光合作用及葉片的形態(tài)建成等過程中起著重要的作用，我們將在后續(xù)實驗中對PsnHB22基因行使功能的具體機(jī)制進(jìn)行更加深入的研究。