梁 昭 魏凱璐 楊冬梅 彭國全,2*

(1.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)院,金華 321004； 2.秦嶺國家植物園,西安 710061)

木質(zhì)部水分導(dǎo)度是反映植物水分傳輸效率的核心指標(biāo)，與木質(zhì)部導(dǎo)管(管胞)及導(dǎo)管間結(jié)構(gòu)特性有關(guān)，并受植物所處環(huán)境的水分狀況、溫度等環(huán)境因素的影響。準(zhǔn)確測定植物木質(zhì)部的水分導(dǎo)度既可以反映植物的水分運(yùn)輸效率，又是評估植物受脅迫程度和耐脅迫能力的有效途徑，在植物對全球氣候變化響應(yīng)的相關(guān)研究中具有廣闊的應(yīng)用前景[1～2]。

木質(zhì)部水分導(dǎo)度的測定是在木質(zhì)部管道的流體力學(xué)[3～4]、水分運(yùn)輸系統(tǒng)中的阻力分布[5～7]等研究的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。通常用單位壓強(qiáng)下流經(jīng)樣品的溶液流速來定量描述水分導(dǎo)度，并以單位長度或單位橫截面積上的導(dǎo)水率對木質(zhì)部水分導(dǎo)度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以便于不同物種間的比較研究。但這種壓強(qiáng)—流速關(guān)系只反映了植物在自然狀態(tài)下的水分輸導(dǎo)能力，并不能反映植物最大的水分輸導(dǎo)能力和栓塞化程度。Sperry等[1]認(rèn)為用于測水分導(dǎo)度的樣品材料中可能本來就存在一些充氣的導(dǎo)管所形成的自然栓塞，在水分導(dǎo)度測定中，如果不能對這部分自然栓塞進(jìn)行準(zhǔn)確的量化，那么基于水分導(dǎo)度的測定結(jié)果就不能說明太多問題。于是他們提出通過人為方法將充氣導(dǎo)管中的氣體完全排出后所測得的導(dǎo)水率為樣品材料的最大導(dǎo)水率，并將自然導(dǎo)水率與最大導(dǎo)水率進(jìn)行比較來量化栓塞化程度，從而使得不同樣本間的水分傳輸效率和栓塞化程度更具有可比性。Sperry等[1]方法的主要原理是先將一個(gè)沒有分枝的離體莖段材料連接到水分導(dǎo)度測定系統(tǒng)上(見圖1)，通過液面高度差所形成的重力作用在莖的兩端形成1～6 kPa的壓強(qiáng)差來誘導(dǎo)水流穿過樣品莖段，根據(jù)單位時(shí)間通過離體莖段的液體流量與相應(yīng)壓強(qiáng)梯度的比值計(jì)算出木質(zhì)部水分導(dǎo)度，即木質(zhì)部的初始導(dǎo)水率。其計(jì)算公式：

(1)

式中：F是水流速度(kg·s-1)，是單位時(shí)間T內(nèi)流過枝條兩端液體的質(zhì)量差；L是枝條的精確長度(cm)；ΔP是水勢勢差；ΔP/L是水勢梯度(dp/dx,MPa·s-1)。

圖1 枝條水分導(dǎo)度測定裝置示意圖 a.裝有沖洗液的供水罐；b.帶控制閥的空氣壓縮機(jī)；c.過濾器；d.三通旋塞閥；e.二級供水容器；f.莖段；g.放在分析天平上中的水容器 氣體和液體容器之間的連線是抗壓軟管；其他連線表示注滿溶液的干凈管子；天平與計(jì)算機(jī)相連，通過定制的軟件計(jì)算水分導(dǎo)度Fig.1 Schematic representation of the apparatus for measuring hydraulic conductivity in xylem of stem segments a.Supply tank containing perfusing solution; b.Compressed air tank with regulator; c.Filter; d.Three-way stopcock; e.Secondary supply reservoir; f.Stem segments; g.Drain reservoir on electronic balance Line connecting air and solution tank is a pressure hose;Other joining lines represent solution-filled clear tubing;Balance is interfaced with a computer program to calculate hydraulic conductivity

測完初始導(dǎo)水率后，用外部高壓(150～200 kPa)驅(qū)使沖洗液穿過樣品來沖洗木質(zhì)部導(dǎo)管，溶解或替換樣品木質(zhì)部管道中原有的氣泡或其他栓塞子，使木質(zhì)部的水分傳輸能力達(dá)到最大，再用測初始導(dǎo)水率同樣的方法測樣品的最大導(dǎo)水率。根據(jù)初始水分導(dǎo)度占最大水分導(dǎo)度的百分比對枝條的栓塞化程度進(jìn)行量化。這種方法簡單、快捷，可以有效避免栓塞或空穴化因素對測定結(jié)果的影響，并能給出栓塞所導(dǎo)致的最直接的生理性結(jié)果，即水流阻力增加的量。因此，這種方法自發(fā)明以來，在植物水分生理學(xué)領(lǐng)域被廣泛用來測定植物的栓塞化程度和抗栓塞能力，并一直沿用至今。如Atkinson等利用重力自動流動系統(tǒng)(gravity-fed flow system)測定蘋果樹枝條和根系導(dǎo)水率[8]。

由于Sperry等[1]方法是根據(jù)初始水分導(dǎo)度占最大水分導(dǎo)度的百分比的形式來表示植物的栓塞化程度，所以要準(zhǔn)確測定植物的栓塞化程度和抗栓塞能力，首先必須要準(zhǔn)確地測定植物的最大水分導(dǎo)度。在測枝條木質(zhì)部最大水分導(dǎo)度時(shí)，常用的方法是先用高壓(150～200 kPa)驅(qū)使沖洗液沖洗樣品材料來消除木質(zhì)部管道中原有的栓塞，然后利用液面高度差形成的重力差(通常為1～6 kPa)誘導(dǎo)液流(用超純水配制并經(jīng)過孔徑為0.2 μm過濾器過濾的0.1 mol·L-1KCl溶液)流過樣品材料的方法測水分導(dǎo)度，每次加壓沖洗的時(shí)間2～4 min，來回循環(huán)操作，直至前后2次測得的水分導(dǎo)度沒有顯著性差異，或繼續(xù)延長沖洗時(shí)間水分導(dǎo)度恒定或變化很小，此時(shí)的水分導(dǎo)度被認(rèn)為是該樣品材料的最大木質(zhì)部水分導(dǎo)度，并把達(dá)到最大水分導(dǎo)度所用的沖洗時(shí)間認(rèn)為是消除該物種木質(zhì)部栓塞所需要的最佳沖洗時(shí)間，在后續(xù)的測定中直接把該時(shí)間作為樣品材料的沖洗時(shí)間[9]。由此我們可以看出，在用沖洗法測枝條的最大水分導(dǎo)度時(shí)，必須是在相同的壓力和其他測定條件下，前后連續(xù)出現(xiàn)的多個(gè)水分導(dǎo)度測定值之間沒有顯著差異，才能被認(rèn)為是枝條的水分導(dǎo)度達(dá)到了最大值。此時(shí)的最大水分導(dǎo)度值才被認(rèn)為是真實(shí)可靠的，才能被用作測定植物栓塞程度和構(gòu)建植物栓塞脆弱性曲線的基準(zhǔn)值。所以，在實(shí)驗(yàn)過程中，如何做到讓枝條的水分導(dǎo)度達(dá)到最大后能繼續(xù)保持平穩(wěn)就顯得尤為重要。

盡管用上述方法測定枝條最大水分導(dǎo)度的過程非常簡單，但對同一物種不同的人測定的結(jié)果往往會相差很大，其中的一個(gè)主要原因是樣品材料的最大水分導(dǎo)度往往會隨著測定時(shí)間的延長而下降。在很早以前就有多個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察到這種下降會在測定開始的前幾分鐘內(nèi)就會出現(xiàn)[5]，對此的解釋包括從樣品材料內(nèi)部液體中排出的氣泡堵塞了木質(zhì)部導(dǎo)管[10]，周圍組織膨脹導(dǎo)致導(dǎo)管直徑變窄[11]，導(dǎo)管之間的紋孔膜膨脹[5]等。另外，水分導(dǎo)度的下降也可能與所用實(shí)驗(yàn)材料的木質(zhì)化程度有關(guān)，尤其是在春季當(dāng)年生枝條還沒有完全木質(zhì)化之前，在采樣和樣品材料的前期處理過程中，我們經(jīng)?？梢钥吹皆谇锌谔帟幸恍┤榘咨蚝稚姆置谖?，在水分導(dǎo)度測定過程中這些分泌物是否會影響到測定結(jié)果仍未可知。假如這些分泌物在水分導(dǎo)度測定過程中會隨著液流進(jìn)入到木質(zhì)部導(dǎo)管腔內(nèi)，并在導(dǎo)管內(nèi)逐漸累積的話，它們將會堵塞導(dǎo)管，使木質(zhì)部的水分輸導(dǎo)能力下降，那么我們將很難真正測得準(zhǔn)確的木質(zhì)部最大水分導(dǎo)度值，并最終影響到植物栓塞化程度和抗栓塞能力的測定。所以，在本研究中，我們以刺槐(RobiniapseudoacaciaL.)不同年齡的枝條為實(shí)驗(yàn)材料，探討一種可以提高枝條水分導(dǎo)度測定結(jié)果穩(wěn)定性的有效方法。我們利用低壓液流計(jì)(Low Pressure Flow Meter with multi-channels，LPFM)水分導(dǎo)度測定系統(tǒng)，首先按沖洗法的傳統(tǒng)做法，將枝條從室外帶回到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步修剪處理好后，立即用于初始水分導(dǎo)度和最大水分導(dǎo)度相關(guān)測定，檢測枝條的最大水分導(dǎo)度是否會隨沖洗次數(shù)的增加和測定時(shí)間的延長而變化。如果枝條最大水分導(dǎo)度隨測定時(shí)間的延長而下降，我們則進(jìn)一步假設(shè)最大水分導(dǎo)度的下降是由于在沖洗和測定過程中有一些分泌物隨液流被帶入到木質(zhì)部管道中，堵塞了管道引起的。我們假設(shè)，在水分導(dǎo)度測定之前，如果將枝條在超純水中室溫下浸泡過夜，讓分泌物從枝條內(nèi)“吐出”，或者將樣品材料內(nèi)部液體中的氣泡完全逸出，則有可能以提高最大水分導(dǎo)度測定結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 樣地狀況

取樣地點(diǎn)分別位于陜西省楊凌示范區(qū)和浙江省金華市浙江師范大學(xué)校園內(nèi)。楊凌示范區(qū)渭河河岸位于陜西關(guān)中平原中部(34°16′N，108°4′E)，海拔457 m，屬于季風(fēng)氣候半干旱地區(qū)，具有溫暖帶大陸性季風(fēng)氣候，主要土壤類型為塿土。冬季寒冷干燥，夏季高溫多雨，年均氣溫12.9℃，極端最高氣溫42℃，最低氣溫零下19.4℃。其年均降雨量651 mm，年均蒸發(fā)量884 mm，生長季節(jié)(4～9月)的降雨量占全年降雨量的79%[12]。

金華市位于浙江省中部腹地(29°31′N，118°38′E)，海拔50～300 m，屬浙中丘陵盆地，地勢南北高而中間低，氣候?qū)賮啛釒Ъ撅L(fēng)氣候，四季分明，雨量充沛，光照充足。該地區(qū)土壤分布面積最廣為紅壤，占土壤總面積的34.7%，年均氣溫10.9～17.2℃。其年降水量為800～1 500 mm，植物資源十分豐富，地帶性植被主要屬亞熱帶常綠闊葉林[13]。

1.2 樣品采集和處理

本實(shí)驗(yàn)的樣品材料分別來自陜西省楊凌示范區(qū)渭河邊上自然狀態(tài)生長良好的高大(5 m以上)刺槐植株(2017年4～5月)和浙江師范大學(xué)校園內(nèi)健康、成熟并且高度基本一致的幾株刺槐個(gè)體(2019年4～5月)。采樣時(shí)，選取植株樹冠2/3以上向陽處部位的枝條，用高枝剪剪取一段長1.0～1.5 m的枝條(刺槐的最大導(dǎo)管長度約60 cm)[9]，用噴水壺將枝條噴濕后，快速裝入內(nèi)部裝有濕紙球的黑色塑料袋中立即帶回實(shí)驗(yàn)室。樣品枝條帶回實(shí)驗(yàn)室后，在水下用枝剪從基部剪去一段長約5 cm的莖段，以消除采樣過程中因人為引入氣泡而在基部末端形成的栓塞，并在水下用鋒利單面刀片切除枝條上的葉片和多余側(cè)枝，然后按植物枝條水分導(dǎo)度測定的標(biāo)準(zhǔn)取樣方法，選取其中長度274～277 mm，兩端直徑6.5～8.0 mm的當(dāng)年生或二年生莖段作為實(shí)驗(yàn)樣品，并用刀片將莖兩末端修平。使用502快速凝固膠密封枝條側(cè)面的開放切口或傷口，確保在水分導(dǎo)度測定時(shí)水流不會從枝條側(cè)面流出。待凝膠在室溫下自然晾干凝固后，將枝條編號置于超純水中備用。

本實(shí)驗(yàn)分為超純水浸泡樣品莖段過夜(簡稱浸泡過夜)和樣品莖段不經(jīng)浸泡過夜直接測定(簡稱未浸泡過夜)兩組實(shí)驗(yàn)處理。不浸泡過夜組樣品的采集時(shí)間為早晨太陽出來之前(此時(shí)枝條水勢最高)，樣品枝條按上述方法處理好后，立即用于水分導(dǎo)度的測定。浸泡過夜組樣品的采集時(shí)間是在傍晚太陽落山之后，樣品莖段按上述相同方法處理好后，在室溫25℃環(huán)境中用超純水(GYJ1-10L-S超純水系統(tǒng)，重慶華創(chuàng)公司，微粒直徑小于10 nm)浸泡過夜，次日早晨開始枝條水分導(dǎo)度測定。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 枝條水分導(dǎo)度測定

枝條木質(zhì)部水分導(dǎo)度的測定采用“多通道低壓液流計(jì)”技術(shù)(Low pressure flow meter with multi-channels,LPFM)，該方法由Sperry等[1]提出的沖洗法改良而來，實(shí)驗(yàn)裝置示意圖見圖1。沖洗液貯存在兩端帶有PVC管帽的供水罐中(見圖1a)，沖洗液為真空抽濾泵除氣2 h并經(jīng)由0.2 μm微孔過濾的0.1 mol·L-1的KCl溶液。用空壓機(jī)(BB24V，美國BAMBI公司)加壓空氣使沖洗液穿過醫(yī)用過濾器(孔徑0.2 μm)(見圖1c)。溶液經(jīng)過三通旋塞閥(見圖1d)進(jìn)入二級供水容器(帶蓋的干凈試劑瓶)(見圖1e)。調(diào)節(jié)三通旋塞閥將二級供水容器與加壓的溶液隔離，溶液在重力作用下從二級供水容器流過莖段(見圖1f)進(jìn)入分析天平內(nèi)的水容器(見圖1g)中。分析天平連接計(jì)算機(jī)，并通過定制的程序，根據(jù)單位時(shí)間內(nèi)排出溶液的重量變化、二級供水容器與天平內(nèi)的水容器中的液面高度差換算得到的壓力差(P)，以及測定時(shí)溫度等參數(shù)計(jì)算枝條木質(zhì)部的水分導(dǎo)度。

按上述方法測定枝條的初始導(dǎo)水率(即未經(jīng)加壓沖洗液沖洗過的枝條導(dǎo)水率)作為沖洗0 min的實(shí)驗(yàn)對照。接著在150 kPa左右的壓力下，用0.1 mol·L-1的KCl溶液沖洗莖段2 min，再測定枝條木質(zhì)部的導(dǎo)水率。同樣壓力再沖洗莖段2 min(與上次沖洗的2 min相加，累計(jì)沖洗4 min)并測導(dǎo)水率，據(jù)此循環(huán)依次檢測枝條在沖洗4、6、8和12 min后的導(dǎo)水率，并記錄每次測得的枝條導(dǎo)水率值。

1.3.2 枝條兩端木質(zhì)部面積比例測定

枝條測定導(dǎo)水率后在超純水中浸泡至飽和狀態(tài)，去除樹皮和韌皮部，截取枝條兩端各3 cm莖段，用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(HistoCore BIOCUT，德國徠卡)切片(厚度為15～20 μm)，用1%的甲苯胺藍(lán)酒精溶液染色制片，在顯微鏡(DM6B，德國徠卡)下拍攝100X圖片保存，用Image-Pro Plus軟件中測定莖段兩端的橫截面面積和木質(zhì)部面積，計(jì)算木質(zhì)部面積占莖橫截面面積的比例。

1.3.3 莖木質(zhì)密度測定

完成導(dǎo)水率測定的枝條去除兩端用于木質(zhì)部面積比例測定部分的3 cm莖段后，剩余部分參考Oliva Carrasco L.[14]的排水法測定莖木質(zhì)密度(ρ)。將一個(gè)裝有去離子水的量筒放置在精度為0.001 g的電子天平上，樣品莖段去除表皮后，用一個(gè)1 mL注射器針頭插入莖的一端，然后將莖段插入量筒中直至整個(gè)莖段被淹沒，且莖段不接觸量筒壁，記錄天平數(shù)值的變化即為莖段的體積(V)。將莖段放入70℃烘箱內(nèi)烘48 h至恒重，用精度為0.001 g的電子天平稱量莖段干重(M)，根據(jù)ρ=M/V計(jì)算莖段木質(zhì)密度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

對每個(gè)枝條加壓沖洗不同時(shí)間所測得的導(dǎo)水率進(jìn)行比較分析，每延長一次沖洗時(shí)間測得的導(dǎo)水率與上一沖洗時(shí)間測定的導(dǎo)水率連續(xù)進(jìn)行獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，以確定導(dǎo)水率的最大值，以及達(dá)到最大值后繼續(xù)延長沖洗時(shí)間，導(dǎo)水率是否與上一次沖洗時(shí)間測得的數(shù)值有差異；同時(shí)不同年齡枝條木質(zhì)密度和木質(zhì)部占橫切面比例亦采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。不同樣品組的數(shù)據(jù)隨沖洗時(shí)間延長，導(dǎo)水率下降幅度間的比較采用單因素方差分析。所有數(shù)據(jù)分析均采用SPSS 21.0(SPSS,Chicago,USA)進(jìn)行，并用OriginPro作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 未浸泡過夜處理組不同年齡枝條最大導(dǎo)水率與沖洗時(shí)間的關(guān)系

結(jié)果顯示：①晴天早晨采樣未浸泡過夜的枝條，無論是來自金華樣地還是來自楊凌樣地，其當(dāng)年生枝條在150 kPa壓力沖洗2 min后導(dǎo)水率均達(dá)到最大值(見圖2a～b，實(shí)心符號及表1中加粗的數(shù)值)，極顯著高于自然導(dǎo)水率(即沖洗0 min的導(dǎo)水率，P<0.01)；而雨天早晨采樣時(shí)，來自金華樣地的當(dāng)年生枝條自然導(dǎo)水率已達(dá)最大值(見圖2c,表1)。結(jié)果表明，在晴天采樣時(shí)，即便是在早晨植株水勢最高時(shí)采樣，枝條也會有一定程度的自然栓塞，在測定最大導(dǎo)水率之前需要對樣品枝條進(jìn)行沖洗。②枝條達(dá)到最大導(dǎo)水率后，來自楊凌和金華兩地樣品的當(dāng)年生枝條，無論是晴天采樣還是雨天采樣，導(dǎo)水率均隨沖洗時(shí)間的延長而顯著下降(見圖2a～c，表1)。與最大導(dǎo)水率相比，繼續(xù)延長2 min沖洗時(shí)間后，晴天金華、雨天金華及晴天楊凌當(dāng)年生枝條導(dǎo)水率平均下降幅度分別為10.69%±2.35%、9.26%±2.49%和11.60%±4.19%，且不同天氣及不同地域間無顯著差異(P>0.05);沖洗時(shí)間由4 min延長至8 min后，晴天金華、雨天金華及晴天楊凌當(dāng)年枝條平均下降幅度分別為15.02%±3.05%、12.40%±1.86%和16.38%±4.53%，且不同天氣及不同地域間無顯著差異(P>0.05);繼續(xù)延長沖洗時(shí)間，下降幅度明顯減小，部分枝條下降至沖洗10 min后，繼續(xù)延長沖洗時(shí)間導(dǎo)水率不再發(fā)生變化；與最大導(dǎo)水率相比，沖洗10 min后，3組未浸泡處理的當(dāng)年生枝條導(dǎo)水率平均下降幅度分別為30.63%±4.08%、23.54%±3.34%和33.09%±9.30%，且不同天氣及不同地域間無顯著差異(P>0.05)(見圖2a～c，表1)。結(jié)果表明，刺槐當(dāng)年生枝條在未經(jīng)超純水浸泡過夜，直接用來測最大導(dǎo)水率時(shí)，測定結(jié)果會隨著沖洗時(shí)間的延長而明顯低于真實(shí)最大導(dǎo)水率值，即沖洗過程中引入了人為栓塞。③來自金華樣地的二年生枝條，在同樣的壓力沖洗下，其導(dǎo)水率均需在沖洗8 min后才達(dá)到最大值，且沖洗8 min后繼續(xù)延長沖洗時(shí)間，最大導(dǎo)水率基本維持穩(wěn)定(見圖1d，表1，P>0.05)。結(jié)果表明，二年生枝條的自然栓塞程度明顯比當(dāng)年生枝條嚴(yán)重，但達(dá)到最大導(dǎo)水率后，沖洗過程導(dǎo)致二年生枝條導(dǎo)水率下降的可能性很小。

2.2 超純水浸泡過夜不同年齡枝條最大導(dǎo)水率與沖洗時(shí)間的關(guān)系

枝條在前一天傍晚采回實(shí)驗(yàn)室處理好后，在室溫25℃條件下超純水中浸泡一晚上，第二天早上連接到LPFM水分導(dǎo)度測定系統(tǒng)上測枝條木質(zhì)部導(dǎo)水率，檢測經(jīng)超純水浸泡過夜后枝條導(dǎo)水率隨沖洗時(shí)間的變化。結(jié)果顯示：①來自金華與楊凌兩地的刺槐當(dāng)年生枝條經(jīng)超純水浸泡過夜后再進(jìn)行水分導(dǎo)度測定時(shí)，90%以上的枝條在150 kPa壓力下沖洗2～4 min內(nèi)導(dǎo)水率可達(dá)到最大值，且繼續(xù)延長沖洗時(shí)間導(dǎo)水率沒有顯著變化，基本維持

表1 未經(jīng)浸泡過夜的刺槐枝條不同沖洗時(shí)間的枝條導(dǎo)水率(Kh)

注：顯著水平P為隨著沖洗時(shí)間延長，前后2次沖洗時(shí)間下的導(dǎo)水率t檢驗(yàn)的比較結(jié)果。S.金華晴天當(dāng)年生枝條；Y.楊凌當(dāng)年生枝條；R.金華雨天當(dāng)年生枝條；D.金華二年生枝條

Note:The significant levelPis the comparison result oft-test of hydraulic conductivity with the extension of flushing time. S.Current-year stems collected on the sunny day in Jinhua; Y.Current-year stems collected in Yangling; R.Current-year stems collected on the rainy day in Jinhua; D.Two-year-old stems collected in Jinhua

表2 超純水浸泡過夜刺槐枝條不同沖洗時(shí)間下的枝條導(dǎo)水率(Kh)

注：顯著水平P為隨著沖洗時(shí)間延長，后一時(shí)間與前一沖洗時(shí)間下的導(dǎo)水率t檢驗(yàn)的比較結(jié)果。s.金華晴天當(dāng)年生枝條；y.楊凌當(dāng)年生枝條；r.金華雨天當(dāng)年生枝條；d.金華二年生枝條

Note:The significant levelPis the comparison result oft-test of hydraulic conductivity with the extension of flushing time. S.Current-year stems collected on the sunny day in Jinhua; Y.Current-year stems collected in Yangling; R.Current-year stems collected on the rainy day in Jinhua; D.Two-year-old stems collected in Jinhua

圖2 未浸泡過夜的刺槐枝條導(dǎo)水率隨著沖洗時(shí)間的變化(實(shí)心符號表示最大導(dǎo)水率) a.金華晴天當(dāng)年生枝條(S1～6.晴天采樣的6個(gè)樣品枝條重復(fù));b.楊凌當(dāng)年生枝條(Y1～4.來自楊凌樣地的4個(gè)樣品枝條重復(fù))；c.金華雨天當(dāng)年生枝條(R1～6.雨天采樣的6個(gè)樣品枝條重復(fù))；d.金華二年生枝條(D1～6.來自金華樣地的6個(gè)二年生樣品枝條重復(fù))Fig.2 The change of hydraulic conductivity of R.pseudoacacia L.stems without soaked overnight in the deionized water with increasing flushing time(Solid symbols indicate the maximum hydraulic conductivity) a.Current-year stems collectedon the sunny day in Jinhua; b.Current-year stems collectedin Yangling; c.Current-year stems collectedon the rainy day in Jinhua; d.Two-year-oldstems collected in Jinhua

圖3 經(jīng)浸泡過夜的刺槐枝條導(dǎo)水率隨著沖洗時(shí)間的變化(實(shí)心符號表示最大導(dǎo)水率) a.金華晴天當(dāng)年生枝條(s1～5.晴天采樣的5個(gè)樣品枝條重復(fù))；b.楊凌晴天當(dāng)年生枝條(y1～5.來自楊凌樣地的5個(gè)樣品枝條重復(fù))；c.金華雨天當(dāng)年生枝條(r1～5.雨天采樣的5個(gè)樣品枝條重復(fù))；d.金華二年生枝條(d1～5.來自金華樣地的5個(gè)二年生樣品枝條重復(fù))Fig.3 The change of hydraulic conductivity of R.pseudoacacia L. stems soaked overnight in deionized water with flushing time(Solid symbols stand for maximum hydraulic conductivity) a.Current-year stems collected on the sunny day in Jinhua; b.Current-year stems collected in Yangling; c.Current-year stems collected on the rainy day in Jinhua; d.Two-year-old stems collected in Jinhua

穩(wěn)定(P>0.05)(見圖3a～c,表2)。僅有2個(gè)來自楊凌樣地的當(dāng)年生枝條，y4和y5在沖洗8 min后的導(dǎo)水率顯著低于沖洗4 min后的導(dǎo)水率，但與未浸泡過夜的枝條相比，其導(dǎo)水率下降的幅度很小(分別下降了2.37%和2.23%)。結(jié)果表明，超純水浸泡枝條過夜可顯著降低當(dāng)年生枝條沖洗過程中引入人為栓塞的可能性，提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。②來自金華樣地的二年生枝條經(jīng)超純水浸泡過夜后，在同樣的壓力下沖洗2 min導(dǎo)水率即可達(dá)到最大值，且繼續(xù)延長沖洗時(shí)間導(dǎo)水率也基本維持穩(wěn)定，與同樣處理的當(dāng)年生枝條相比波動性更小(見圖3d，表1，P>0.05)。結(jié)果表明，二年生枝條在沖洗過程中引入人為栓塞的可能性很小。

2.3 未經(jīng)超純水浸泡的與經(jīng)過超純水浸泡的2個(gè)處理間最大水分導(dǎo)度間的比較

來自金華樣地所有未經(jīng)超純水浸泡的12個(gè)當(dāng)年生枝條(即6個(gè)晴天樣品枝條和6個(gè)雨天樣品枝條)的平均比導(dǎo)率(即單位莖橫截面積上的最大水分導(dǎo)度)為4.349 2±1.149 kg·s-1·m-1MPa-1·cm-2，金華樣地所有經(jīng)超純水浸泡過夜的10個(gè)當(dāng)年生枝條(即5個(gè)晴天樣品枝條和5個(gè)雨天樣品枝條)的平均比導(dǎo)率為3.821 9±1.498 1 kg·s-1·m-1MPa-1·cm-2。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，2個(gè)不同處理組的比導(dǎo)率之間沒有顯著性差異(P>0.05)。

圖4 刺槐枝條兩端木質(zhì)部面積比例Fig.4 The proportion of xylem area of R.pseudoacacia L. stemsends to the cross-sectional area

圖5 刺槐枝條平均密度和基部2 cm密度Fig.5 The meandensity and density of 2 cm in base of R.pseudoacacia L. stems

2.4 枝條兩端木質(zhì)部面積比例

本研究采用植物解剖學(xué)方法和顯微鏡觀察測定了來自金華樣地的所有刺槐當(dāng)年生(共22個(gè)枝條)和二年生(共11枝條)樣品的基部和頂部橫截面面積以及莖橫截面上的木質(zhì)部面積百分比。結(jié)果顯示，當(dāng)年生樣品枝條基部木質(zhì)部面積占整個(gè)莖橫截面的面積比例為88.21%±3.1%，頂部為79.36%±4.4%，頂部木質(zhì)部面積比例顯著小于基部(P<0.01)；二年生樣品枝條基部為92.09%±3.0%，頂部為86.07%±2.4%，頂部木質(zhì)部面積比例顯著小于基部(P<0.01)(見圖4)。結(jié)果表明，完全發(fā)育成熟的刺槐枝條木質(zhì)部面積比例在90%左右，實(shí)驗(yàn)期間(4～5份)當(dāng)年生刺槐樣品枝條基部已基本發(fā)育成熟，而中上部仍處在進(jìn)一步發(fā)育過程中。

2.5 枝條木質(zhì)密度

本研究采用排水法測定了來自金華樣地的所有刺槐當(dāng)年生(共22個(gè)枝條)和二年生(共11枝條)樣品的木質(zhì)密度。結(jié)果顯示，當(dāng)年生枝條的基部2 cm莖段的木質(zhì)密度為0.343 1±0.03 g·cm-3，整枝平均木質(zhì)密度為0.338 6±0.03 g·cm-3；二年生枝條的基部2 cm莖段木質(zhì)密度為0.444 2±0.07 g·cm-3，整枝平均木質(zhì)密度為0.433 5±0.08 g·cm-3，兩者均顯著大于當(dāng)年生枝條(P<0.01)(見圖5)。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)期間當(dāng)年生枝條的木質(zhì)化程度還沒有達(dá)到最大值。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，來自金華與楊凌兩地的刺槐當(dāng)年生枝條采集后立即用于枝條水分導(dǎo)度測定時(shí)，在150 kPa壓力下沖洗2 min左右就可以達(dá)到最大水分導(dǎo)度，金華雨天當(dāng)年生枝條則未經(jīng)沖洗已到最大導(dǎo)水率，二年生枝條需要沖洗8 min，說明雨天枝條的自然栓塞程度較少，二年生枝條自然栓塞程度大于當(dāng)年生枝條；繼續(xù)延長沖洗時(shí)間，所有當(dāng)年生枝條的導(dǎo)水率均會隨著沖洗時(shí)間的延長而下降。達(dá)到最大導(dǎo)水率后，再沖洗8 min，下降的幅度高達(dá)30%左右。之后繼續(xù)延長沖洗時(shí)間導(dǎo)水率不再有顯著變化。與此不同的是，枝條經(jīng)超純水浸泡過夜后，當(dāng)年生枝條的導(dǎo)水率在達(dá)到最大值后，繼續(xù)延長沖洗時(shí)間也能基本保持穩(wěn)定，即使有下降，幅度也不足1%，顯著低于未浸泡過夜枝條的下降幅度。同時(shí)，二年生枝條無論是否經(jīng)過浸泡過夜，在達(dá)到最大導(dǎo)水率后，延長沖洗時(shí)間導(dǎo)水率都基本保持穩(wěn)定。由此說明，沖洗過程本身不是引起莖木質(zhì)部導(dǎo)水率下降的主要原因，未浸泡過夜的當(dāng)年生枝條的導(dǎo)水率隨沖洗時(shí)間的延長而下降是由于枝條自身的一些變化所引起的，超純水浸泡枝條過夜可以有效緩解當(dāng)年生枝條在沖洗過程中導(dǎo)水率下降的問題，提高測定結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。

很早以前就有科研人員發(fā)現(xiàn)在恒定的壓力梯度下，木材中的液體流速隨著時(shí)間的延長而下降的問題[15～16]。在開始時(shí)流速很快，但在30～120 min后趨于平穩(wěn)，漸漸流速接近0。也有研究人員遇到的另一個(gè)現(xiàn)象是，當(dāng)壓力增加時(shí)，木材中的液體流速并不是成比例的增加，表明在壓力增加之前，流速是隨著時(shí)間的延長而下降的[15～16]。有人把這種現(xiàn)象歸因于紋孔膜的膨脹[11]，從而增加了液體流過的毛細(xì)管的大小。然而，Anderson等[15]根據(jù)Poiseuille方程原理推導(dǎo)認(rèn)為，要解釋增加的流速所需的拉伸程度在物理學(xué)上是不可能達(dá)到的。他們認(rèn)為是紋孔膜上的纖維結(jié)構(gòu)隨著壓力的增加而發(fā)生橫向移動，從而以一種較小的代價(jià)來增大毛細(xì)管的大小，導(dǎo)致流速下降。Krier[17]用紅楓作為實(shí)驗(yàn)材料，使用新鮮并經(jīng)多孔玻璃過濾器過濾的蒸餾水作為液體，測得的流速雖然是平衡流速，但它僅占樣品最大速率的1/5～1/8。Krier通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在流速降低到低水平之后，通過刮削樣品流入端的表面，流速再次升高。這表明閉塞區(qū)域主要位于流入表面處或附近。從該相同區(qū)域截取的切片顯微照片顯示細(xì)胞中有一些外來物質(zhì)。因此，他得出結(jié)論，通過木材的液體流速降低的基本原因是導(dǎo)管分子被一種與木材和液體都能有機(jī)結(jié)合的不知名的復(fù)合物顆粒堵塞了。從我們現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯然更支持Krier的觀點(diǎn)，因?yàn)槿绻y孔膜的膨脹或者纖維結(jié)構(gòu)的位移導(dǎo)致毛細(xì)管大小的改變是引起液流速率下降的原因的話，那么經(jīng)超純水浸泡過夜的當(dāng)年生枝條的流速也應(yīng)該是隨著沖洗時(shí)間的延長而下降，二年生枝條也存在同樣的情況。但事實(shí)上我們的當(dāng)年生枝條經(jīng)超純水浸泡過夜后，二年生枝條無論是否經(jīng)浸泡，它們的導(dǎo)水率在經(jīng)沖洗達(dá)到最大值后都基本保持穩(wěn)定。我們推斷未經(jīng)浸泡過夜的枝條出現(xiàn)水分導(dǎo)度下降是由于在沖洗和測定水分導(dǎo)度過程中，可能有一些其他物質(zhì)被引入到木質(zhì)部管道中，堵塞了管道，導(dǎo)致水分導(dǎo)度下降。

在本研究中，用來測水分導(dǎo)度的樣品材料都是離體枝條，當(dāng)枝條從活體植株下剪下的那一刻，就相當(dāng)于人為地給枝條一個(gè)外部機(jī)械性損傷。面對這種突然的機(jī)械性損傷，作為一種應(yīng)激反應(yīng)，植物通常會通過改變生理生化代謝途徑增加體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物，形成大量的萜烯類、酚類和生物堿等分泌物，增加自身的化學(xué)防御能力[18]。例如，有研究表明植物組織的勻漿和線粒體等細(xì)胞器在受到傷害時(shí)能同時(shí)產(chǎn)生乙烯和乙烷[19～21]。而乙烯是誘導(dǎo)形成創(chuàng)傷性分泌道的信號分子，并在創(chuàng)傷性分泌道中形成含有大量的萜類、酚類、脂類及多糖類物質(zhì)的分泌物，用于封閉傷口，抵御昆蟲、病原微生物入侵和阻止水分的散失[22]。在水分導(dǎo)度測定之前，如果沒有將這些分泌物排除干凈，那么在測定過程中，它們就有可能隨水流通過紋孔進(jìn)入導(dǎo)管腔內(nèi)形成片狀、團(tuán)體或結(jié)晶狀的侵填體。侵填體的形成和逐漸積累，導(dǎo)致導(dǎo)管輸導(dǎo)功能逐漸降低，并最終喪失水分傳輸功能成為閉塞導(dǎo)管[23]。

盡管植物組織在正常情況下都能產(chǎn)生微量的乙烯作為內(nèi)源激素調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，但已有很多研究都發(fā)現(xiàn)植物組織遭受機(jī)械傷害時(shí)，乙烯的排放量會顯著增加，但增生高峰期一般都有一段后滯期。根據(jù)植物種類、組織年齡、生理狀態(tài)以及溫度等不同，后滯期可以是十幾分鐘、幾十分鐘、幾小時(shí)甚至更長[24～26]。劉愚等[27]用綠豆幼苗和小麥黃化苗作實(shí)驗(yàn)材料，檢測植物組織受傷后乙烯產(chǎn)生的時(shí)間進(jìn)程時(shí)發(fā)現(xiàn)，植物組織在受到機(jī)械傷害后，乙烯的增生有2個(gè)高峰期，第一個(gè)是傷害乙烯峰，它在受傷后立即出現(xiàn)，達(dá)到最大值的時(shí)間約為7 min，這部分乙烯主要來自受傷當(dāng)時(shí)釋放的乙烯加上組織間隙中原來積聚而在組織破壞時(shí)釋放出來的乙烯。另一個(gè)為傷害誘導(dǎo)乙烯峰，它經(jīng)過一定的后滯期(約25 min)才開始增加，約1 h達(dá)到最大值。這部分乙烯主要來自沒有破壞的鄰近細(xì)胞受到影響(直接的或間接的)后誘導(dǎo)形成的[26]。而Saltveit和Dilley[28]的研究結(jié)果也表明，豌豆除了在受傷后56 min有一個(gè)乙烯峰外，在131 min時(shí)還有另一個(gè)峰。本研究使用的實(shí)驗(yàn)材料刺槐與綠豆和豌豆同屬于豆科植物，如果它們在受到機(jī)械性損傷后的乙烯增生高峰期相似的話，那么當(dāng)我們把刺槐枝條帶回實(shí)驗(yàn)室處理好后立即用于測水分導(dǎo)度時(shí)，水分導(dǎo)度的測定過程中可能正處于傷害誘導(dǎo)乙烯形成的高峰期。在乙烯的誘導(dǎo)下，枝條內(nèi)形成含有大量的萜類、酚類、脂類及多糖類物質(zhì)的分泌物，這些物質(zhì)隨測定水分導(dǎo)度的液流進(jìn)入導(dǎo)管，并在導(dǎo)管腔內(nèi)的逐漸積累導(dǎo)致木質(zhì)部導(dǎo)管的輸導(dǎo)能力逐漸下降，使得我們測得的枝條最大水分導(dǎo)度隨著測定時(shí)間的延長而逐漸下降。而當(dāng)我們把枝條采回來，在超純水中室溫下浸泡過夜后，從枝條中排放的乙烯則可能被及時(shí)地溶解于水中，不能進(jìn)一步誘導(dǎo)分泌物的形成。當(dāng)我們第二天做水分導(dǎo)度測定時(shí)，分泌物形成的量大大降低，對導(dǎo)管造成堵塞的可能性也就大大減小，從而使水分導(dǎo)度測定值保持基本穩(wěn)定。此外，我們通過對當(dāng)年生枝條與二年生枝條的比較實(shí)驗(yàn)，以及莖橫截面上木質(zhì)部面積所占百分比和木質(zhì)密度的分析發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)化程度更高的二年生枝條經(jīng)過高壓將導(dǎo)管內(nèi)原有的自然栓塞氣泡沖出后，其最大導(dǎo)水率基本能保持穩(wěn)定，這可能是由于木質(zhì)化程度更高的老枝在遭受機(jī)械損傷后所產(chǎn)生的分泌物較少，所以無論是否浸泡過夜都不會出現(xiàn)導(dǎo)水率隨沖洗時(shí)間的延長而下降的現(xiàn)象。這也從側(cè)面證實(shí)木質(zhì)化程度更低的當(dāng)年生幼嫩枝條中可能具有更多的分泌物，所以需要更長的浸泡時(shí)間將分泌物排出。

總之，盡管沖洗法是用來測定植物的栓塞化程度和抗栓塞能力比較成熟的方法，但所用實(shí)驗(yàn)材料的木質(zhì)化程度或采樣時(shí)間的差異都有可能會影響到最大水分導(dǎo)度測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，特別是當(dāng)采用木質(zhì)化程度較低的嫩枝進(jìn)行植物最大導(dǎo)水率測定時(shí)，樣品材料從室外采回來后，在超純水中浸泡一段時(shí)間后再測，可以提高水測定結(jié)果的穩(wěn)定性。