薛子可， 畢銀麗,2， 王 義

(1.中國礦業(yè)大學(xué)煤炭資源與安全開采國家重點實驗室(北京)， 北京 100083；2.西安科技大學(xué)中國西部礦區(qū)生態(tài)環(huán)境修復(fù)研究院， 陜西 西安 710054；3.國家能源集團神東煤炭集團, 內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017209)

植物種子在播種前的浸泡，可促進種子充分吸水吸脹，起到一定的“催芽”效果，使幼苗茁壯成長[1]。為促進種子發(fā)芽，探索了如生長調(diào)節(jié)劑浸種[2]，營養(yǎng)液浸種[3]，多胺浸種[4]等，均起到一定的促進作用。然而，不同的浸種濃度和時間，其效果也存在差異。濃度為500 mg/L的GA3浸種大白杜鵑種子，增強種子活力，極顯著提高種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢[5]。劉開力等[6]以不同濃度硝普鈉(SNP)浸泡水稻種子后，受鹽脅迫的水稻幼苗耐鹽比率提高，地上和地下部產(chǎn)量提高。也有研究表明，不同濃度EM(有效微生物群)稀釋液浸種可提高玉米種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢，促進幼苗的生長發(fā)育[7]。

深色有隔內(nèi)生真菌(Dark Septate Endophytes，DSE)具有與菌根真菌類似的生物學(xué)功能，不僅能與植物形成共生體，且不引起植物病變[8]。DSE生態(tài)分布廣泛，在不同生境植物中的定值表明它們很少或沒有宿主特異性，并能與植物建立了互惠互利以及相互調(diào)節(jié)的生理整體，但各自具有其形態(tài)特征[9-10]。研究表明，DSE通過菌絲的生長擴大了植物根系吸收面積，提高了根系吸收能力，在植物生長過程中發(fā)揮著重要的作用[11-12]。然而，DSE液體菌劑浸種的研究較少。

以不同濃度DSE菌液浸種玉米種子，研究DSE菌液浸種對種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，篩選出玉米浸種最適宜的DSE菌液濃度及最佳時間，以期為礦區(qū)微生物修復(fù)過程提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 土壤和種子的準備

土壤選擇沙土，所有土壤121 ℃，0.1 MPa滅菌90 min。玉米品種為中糯1號(認證號：0103006-2000，北京中農(nóng)作科技發(fā)展有限公司)。

1.2 DSE菌液的制備

稱取MMN培養(yǎng)基(Cat#MM 8650,Coolaber science & technology,pH=5.5)21.18 g，加蒸餾水定容至1 L，分裝置于250 mL三角瓶中，每瓶100 mL，121 ℃高壓滅菌30 min備用。取直徑6 mm的DSE菌餅(保藏編號為CGMCC No.17463)，接種至100 mL液體MMN培養(yǎng)基，160 r/min，28 ℃振蕩培養(yǎng)8 d，得到源菌液。

1.3 菌液的稀釋

用無菌水將源菌液進行稀釋，得到5個濃度的稀釋菌液，具體如下：

20%菌液：取源菌液20 mL，用無菌水稀釋至100 mL；

40%菌液：取源菌液40 mL，用無菌水稀釋至100 mL；

60%菌液：取源菌液60 mL，用無菌水稀釋至100 mL；

80%菌液：取源菌液80 mL，用無菌水稀釋至100 mL；

100%菌液：源菌液。

1.4 試驗設(shè)計

選取大小相近，顆粒飽滿的玉米種子，先用75%的酒精浸種5 min，無菌水清洗5遍。隨后用10%次氯酸鈉浸種10 min，無菌水清洗5遍。

以無菌水和MMN液體菌劑為對照組，用不同濃度的菌種浸泡玉米種子，浸泡時間分別為12 h和16 h，共設(shè)置14個組，每組9個重復(fù)。

用鑷子取出玉米種子并播種至塑料杯中(每個塑料杯裝有125 g無菌土)進行培養(yǎng)。培養(yǎng)過程：第1～3天，22 ℃黑暗培養(yǎng)，空氣相對濕度為70%；第4～13天，光暗交替培養(yǎng)(16 h光照/8 h黑暗，光照培養(yǎng)時的光照強度為1 800 lx，光照培養(yǎng)時的溫度為25 ℃，黑暗培養(yǎng)時的溫度為22 ℃)，空氣相對濕度為70%。

1.5 侵染率的測定

第7～13天，每天每組隨機取3株植株幼苗，檢測供試菌株DSE定殖率(又稱為侵染率)。檢測方法：取幼苗的根，采用酸性品紅染色法進行處理后，切成長度約為1 cm的根段，在顯微鏡下進行鏡檢，計算侵染率：

侵染率(%)=(DSE定殖的根段數(shù)/總根段數(shù))×100%。

1.6 DSE貢獻率

以無菌水處理后的植株作為參比植株，計算不同處理的DSE菌液貢獻率。對于株高，菌液貢獻率(%)=[(各組處理后的植株的株高-參比植株的株高)/參比植株的株高]×100%。對于葉綠素含量(SPAD值)，菌液貢獻率(%)=[(各組處理后的植株的SPAD值-參比植株的SPAD值)/參比植株的SPAD值]×100%。對于地上部干重，菌液貢獻率(%)=[(各組處理后的植株的地上部干重-參比植株的地上部干重)/參比植株的地上部干重]×100%。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均在Excel 2016軟件中進行處理，單因素方差分析采用SPSS 19.0軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 對玉米生長的影響

培養(yǎng)第13天，每組隨機取3株植株，檢測株高、根長、SPAD值和地上部干重。結(jié)果如圖1所示，20%菌液浸種12 h的幼苗株高最高并顯著高于對照組，16 h浸種的各處理株高無顯著差異。20%和100%菌液浸種12 h的幼苗地上部干重最高，20%和40%菌液浸種16 h的幼苗地上部干重顯著增高。20%菌液浸種12 h的幼苗SPAD值顯著最高，16 h浸種的各處理幼苗SPAD值無顯著差異。40%菌液浸種12 h的幼苗根長最長，但與20%菌液浸種12 h的無顯著差異。研究表明，菌液浸種能夠顯著促進玉米幼苗的生長，其中20%低濃度的菌液效果最顯著。同時，DSE菌液浸種玉米種子顯著提高幼苗葉綠素含量，表明DSE菌液浸種能夠促進玉米苗期的光合作用。

圖1 接種DSE對玉米生長的影響Fig.1 Effect of inoculation with DSE on growth

2.2 DSE菌液貢獻率

菌液貢獻率的結(jié)果見表1。菌液浸種的玉米植株的株高、葉綠素含量和地上部干重均高于無菌水浸種的玉米植株。20%菌液浸種12 h對玉米植株綜合指標(biāo)的貢獻率明顯高于其他各組。結(jié)果表明，種子依靠自身的胚乳提供營養(yǎng)，使用DSE菌液浸種過程中，玉米種子吸收菌液中的養(yǎng)分及其他活性物質(zhì)，促進了玉米的生長。

表1 不同菌液處理對植物促生長的貢獻率Table 1 Contribution rate of different concentrations of DSE treatment to plant growth promotion

2.3 DSE侵染

從種子發(fā)芽開始(第7～13天)，檢測結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加定植率不斷上升，到第13天時，定植率均達到80%以上(圖2)。結(jié)果表明，低濃度的DSE菌液浸種對植物的定植影響效果與高濃度相似。

圖2 不同處理下玉米根系侵染率 Fig.2 Infection rate of corn root under different treatments

3 結(jié)論與討論

玉米種子從萌發(fā)到生長都依賴土壤，然而，土壤環(huán)境的不斷變化對種子的萌發(fā)是不利的，加快種子的出土?xí)r間，能夠顯著增強種子在不利環(huán)境中的生長[13-14]。

大量的研究與實踐證明，種子活力是可以通過若干處理而獲得恢復(fù)和提高的[15]。播種前適當(dāng)?shù)奶幚?，可以提高種子發(fā)芽出苗率，減輕病蟲害，有利于植物的生長，是提高作物產(chǎn)量的有效措施之一[16]。

黃艷勝[3]在研究營養(yǎng)液浸種時發(fā)現(xiàn)，用2～3倍營養(yǎng)液浸種12 h，顯著提高玉米種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率，促進幼苗茁壯生長。DSE菌液使用MMN培養(yǎng)基，含有大量的營養(yǎng)元素，DSE菌液浸種促進玉米幼苗和根系發(fā)育，與之前浸種處理的研究結(jié)果一致[17-18]。同時，DSE菌液中含有多種營養(yǎng)物質(zhì)及微量元素，包括有機質(zhì)、N、P、K、Fe2+、Mg2+和維生素等，浸種后，這些營養(yǎng)物質(zhì)為幼苗生長提供了必要的養(yǎng)分，促進幼苗的生長。

此外，DSE作為與植物共生的根內(nèi)生真菌，自身也能分泌活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)也可能在菌液中發(fā)揮著積極的作用。例如，赤霉素作為廣泛存在的植物激素，其促進種子發(fā)芽的功能在多種植物上已得到證實[19-20]，適宜濃度的赤霉素浸種可明顯提高玉米種子胚乳中的α-淀粉酶活性[21]，促進種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)以及幼芽根系的活力。也有研究發(fā)現(xiàn)，低濃度(<1 mg/L)的三氟吲哚丁酸同系物促進玉米種子萌發(fā)及幼苗生長，提高α-淀粉酶活性、葉綠素含量及根系活力，且隨著濃度的增加促進效果逐漸增強，在濃度為1 mg/L時效果最顯著[22]。而高濃度水楊酸處理限制部分可溶性糖含量和酶的活性，不利于植株和根系的生長[23]。本研究中高濃度的DSE菌液處理的玉米根長最低，DSE分泌活性物質(zhì)可能與植物激素具有類似的功能，其濃度影響了玉米種子的生長發(fā)育。

綜上所述，在生產(chǎn)中可通過一定濃度的DSE菌液浸種促進玉米萌發(fā)及幼苗生長，提高植物對逆境的抗性。其中：DSE菌液中含有大量農(nóng)作物生長所需的多種微量元素和水溶性養(yǎng)分，在浸種過程中，種子充分吸收菌液中的各種營養(yǎng)與活性物質(zhì)，從而顯著提高玉米的生長；DSE菌液浸種對玉米株高，地上部干重和根長有一定的刺激作用，但浸泡時間不宜過長，且浸泡濃度不宜過大，以20%濃度、浸種12 h時綜合效果最佳。