余江濤 李凌云 陳秋伶 鐘群 梅雨辰 婁玉霞 金越 明鳳

摘 ?要：?以水稻OsNAC2過表達(dá)、RNAi轉(zhuǎn)基因株系和野生型（日本晴）為材料，分別在苗期和生殖期進(jìn)行干旱和鹽脅迫處理，探索逆境條件下OsNAC2對水稻產(chǎn)量性狀的影響。結(jié)果表明，不論是在苗期還是生殖期，OsNAC2-RNAi株系的葉相對含水量均比野生型更高，對干旱脅迫具有更強(qiáng)的適應(yīng)能力;而OsNAC2過表達(dá)株系則相反。雖然苗期和生殖期遭遇鹽脅迫的OsNAC2-RNAi株系相比野生型具有更高的葉相對含水量，但是OsNAC2的過量表達(dá)與RNAi株系的產(chǎn)量性狀跟野生型相比并沒有明顯不同。生殖期干旱和鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因株系的產(chǎn)量性狀分析顯示：干旱脅迫下，OsNAC2-RNAi株系的結(jié)實(shí)率與野生型相比顯著提高了20.8%～29.2%，千粒重則無明顯差異;而OsNAC2過表達(dá)株系每株粒數(shù)和千粒重相比野生型株系均顯著降低。雖然鹽脅迫下OsNAC2-RNAi株系的分蘗數(shù)和有效穗數(shù)明顯比野生型高，但單株粒數(shù)和千粒重則無明顯差異。上述結(jié)果表明，OsNAC2-RNAi株系具有更強(qiáng)的耐旱性，對于干旱脅迫下水稻的產(chǎn)量有顯著的提高作用。

關(guān)鍵詞：?OsNAC2;?水稻;?干旱;?鹽脅迫;?產(chǎn)量

中圖分類號： Q 945 ???文獻(xiàn)標(biāo)志碼：?A ???文章編號：?1000-5137（2020）05-0581-08

The effects of rice transcription factor OsNAC2?on yield traits under stresses

YU Jiangtao^1，2?， LI Lingyun^1，2?， CHEN Qiuling^1，2， ZHONG Qun^1，2， MEI Yuchen^1，2， LOU Yuxia^1，2， JIN Yue^1，2*， MING Feng^1，2*

（1.College of Life Sciences， Shanghai Normal University， Shanghai 200234， China;2.Development Center of Plant Germplasm Resources， Shanghai Normal University， Shanghai 200234， China）

Abstract：?The OsNAC2-over expression，OsNAC2-RNAi and wild-type （Oryza sativa L.japonica.cv.Nipponbare）plants were used to study the effects of OsNAC2?on rice yield under drought and salt stresses during the seedling stage and reproductive stage respectively.The results showed that leaf relative water content of OsNAC2-RNAi plants was higher after drought stress during both of the seedling and reproductive stages，indicating that OsNAC2-RNAi plants exhibited higher tolerance to drought;meanwhile the performance of OsNAC2-OE plants was precisely in reverse.Although the leaf relative water content of OsNAC2-RNAi plants suffered from salt stress during both of the seedling and reproductive stages was higher than that of the wild-type plants，there was no obvious difference in rice yield among OsNAC2-OE，OsNAC2-RNAi and wild-type plants.The analysis of yield traits of transgenic lines during reproductive stage under drought or salt stresses showed that the seed setting rate of OsNAC2-RNAi lines was increased by 20.8%-29.2% more than that of wild-type plants after drought stress，with no significantly difference in 1 000-grain weight.Further，the total grain number/plant and 1 000-grain weight of OsNAC2-OE lines were significantly decreased compared with that of wild type lines.Although the number of tiller and effective panicle of OsNAC2-RNAi plants were significantly higher than those of wild-type plants under salt stress，there was no significant difference in grain number and 1 000-grain weight per plant.These results suggested that OsNAC2-RNAi transgenic plants had more significant tolerance and higher yield under drought conditions.

Key words：OsNAC2;?rice;?drought;?salt stress;?yield

0 ?引 ?言

水稻是世界上最主要的糧食作物之一，也是單子葉植物的模式物種。研究發(fā)現(xiàn)，作為中國水稻主要種植地的南方和東北等濕潤和半濕潤地區(qū)發(fā)生驟發(fā)性干旱的可能性較大^[1]。此外，鹽分也是影響水稻生長和產(chǎn)量的一個(gè)重要環(huán)境因子，鹽脅迫給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的危害^[2]。因此，探索水稻抗旱耐鹽機(jī)制，培育耐鹽耐旱的優(yōu)良品種是科研工作者的主要目標(biāo)之一。決定水稻產(chǎn)量的3個(gè)主要因素為：單株有效穗數(shù)、每穗結(jié)實(shí)率和粒重。其中，穗數(shù)是水稻產(chǎn)量的基礎(chǔ);結(jié)實(shí)率決定每穗粒數(shù);粒重一般以千粒重表示，與粒長、粒寬、粒厚和籽粒飽滿度密切相關(guān)^[3]。

NAC（NAM，ATAF1/2，CUC2）是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子超家族之一，在植物生長發(fā)育中起著關(guān)鍵作用^[4-5]。目前，在水稻和擬南芥中分別發(fā)現(xiàn)151和117個(gè)NAC家族的成員^[6]。研究表明：NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物次生代謝、激素調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物和非生物脅迫等方面發(fā)揮著重要的作用^[4，7-8]。例如，ANAC019過量表達(dá)會顯著提高擬南芥的耐旱性^[9];OsSNAC1過量表達(dá)會顯著提高水稻干旱和高鹽脅迫下的結(jié)實(shí)率，進(jìn)而增加水稻產(chǎn)量^[10];此外，OsNAC5過量表達(dá)會增大水稻的根系，從而提高植物的耐旱性^[11]。因此，NAC轉(zhuǎn)錄因子可以顯著提高植物對非生物逆境的抗性。

OsNAC2屬于NAC家族成員，由本實(shí)驗(yàn)室的前期工作以及其他研究者的工作發(fā)現(xiàn)OsNAC2可以調(diào)控多種生物學(xué)途徑，例如可以負(fù)調(diào)控分蘗數(shù)量以及分蘗角度^[12]、株高性狀^[13]，提高鹽、干旱等非生物脅迫耐性^[14]，促進(jìn)葉片的衰老^[15]等。最近又發(fā)現(xiàn)OsNAC2的過表達(dá)和RNAi轉(zhuǎn)基因株系有明顯的根長表型特征^[16-18]。為了確定OsNAC2是否參與脅迫下產(chǎn)量的穩(wěn)產(chǎn)，本文作者利用實(shí)驗(yàn)室已獲得的OsNAC2的過表達(dá)和RNAi株系在營養(yǎng)期進(jìn)行20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）PEG6000滲透脅迫（模擬干旱脅迫）和150 mmol?L^-1NaCl處理，觀察并記錄植株的葉相對含水量的變化;通過在水稻生殖期進(jìn)行干旱和鹽脅迫處理，檢測轉(zhuǎn)基因株系和野生型（WT）株系的葉相對含水量、分蘗數(shù)、結(jié)實(shí)率以及千粒重等，共同評價(jià)OsNAC2對水稻產(chǎn)量的影響。

1 ?材料與方法

1.1 植物材料

日本晴水稻種子（Oryza sativa L.japonica. cv. Nipponbare）;OsNAC2過表達(dá)株系（ON7，ON11）;RNAi株系（Ri25，Ri31）水稻種子為本實(shí)驗(yàn)室保存，相關(guān)表達(dá)量參考文獻(xiàn)[18]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子萌發(fā)

選用飽滿的種子，用3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）過氧化氫溶液浸泡30 min，再用滅菌水沖洗5次。30 ℃清水浸泡2 d，37 ℃過夜催芽。挑選露白一致的種子放進(jìn)96孔板，置于培養(yǎng)箱（苗期）或大棚（生殖期處理）中培養(yǎng)，生長條件為28 ℃，16 h光照/22 ℃，8 h黑暗，濕度為70%。

1.2.2 苗期20% PEG6000滲透和鹽脅迫實(shí)驗(yàn)

采用培養(yǎng)2周的野生型和轉(zhuǎn)基因水稻苗作為實(shí)驗(yàn)材料，挑選長勢良好并且一致的苗置于20% PEG6000或150 mmol?L^-1NaCl營養(yǎng)液中進(jìn)行處理，對照組用常規(guī)水稻營養(yǎng)液培養(yǎng)，3次生物學(xué)重復(fù)。20% PEG6000實(shí)驗(yàn)組脅迫處理7 d后，測定各株系的葉相對含水量。鹽處理實(shí)驗(yàn)組用150 mmol?L^-1NaCl處理3 d后，測定各株系的葉相對含水量。

1.2.3 生殖期干旱和鹽脅迫實(shí)驗(yàn)

采用正常培養(yǎng)4周（花序原基剛剛形成）的野生型和轉(zhuǎn)基因水稻苗作為實(shí)驗(yàn)材料。對照組用去離子水澆灌處理，干旱組做不澆灌處理，每日測量水稻的土壤含水量，大約1周后，土壤水分含量降至30%左右時(shí)，將其維持在該水平1周;鹽處理實(shí)驗(yàn)組做150 mmol?L^-1NaCl水溶液澆灌處理，脅迫2周后觀察轉(zhuǎn)基因株系和野生型的表型，測定各株系的葉相對含水量，成熟時(shí)統(tǒng)計(jì)分蘗數(shù)、千粒重、結(jié)實(shí)率等指標(biāo)。3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.4 葉相對含水量測量方法

取水稻相同部位的一片葉子，在分析天平中稱量鮮重，再進(jìn)行烘干稱量干重，葉相對含水量=（鮮重-干重）/鮮重。

1.2.5 分蘗數(shù)測量方法

分蘗是禾本科植物在地面以下或接近地面處所發(fā)生的分枝。直接從主莖基部分蘗節(jié)上發(fā)出的稱一級分蘗，在一級分蘗基部又可產(chǎn)生新的分蘗芽和不定根。本研究中只測量一級分蘗，也就是在主莖基部分蘗節(jié)上發(fā)出的分蘗。

1.2.6 千粒重測量方法

千粒重是以g為單位的1 000粒種子的質(zhì)量，是體現(xiàn)種子大小與飽滿程度的一項(xiàng)指標(biāo)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 滲透和鹽脅迫對苗期OsNAC2轉(zhuǎn)基因株系的影響

所用的OsNAC2過表達(dá)株系（ON7和ON11）和RNAi株系（Ri25和Ri31）均是本實(shí)驗(yàn)已構(gòu)建成功的轉(zhuǎn)基因株系^[18]。選用正常培養(yǎng)2周的水稻苗，用20% PEG6000滲透脅迫模擬干旱脅迫;用150 mmol?L^-1NaCl進(jìn)行鹽脅迫處理，處理3 d后測定相關(guān)生理指標(biāo)。在正常生長條件下，OsNAC2轉(zhuǎn)基因株系和野生型的葉相對含水量均一致，如圖1（a）所示;干旱脅迫條件下，Ri25和Ri31的葉相對含水量比野生型分別增加6.6%和5.0%，如圖1（b）所示;OsNAC2過表達(dá)株系ON7和ON11的葉相對含水量則與野生型相比分別降低7.3%和6.7%。這些數(shù)據(jù)說明苗期的OsNAC2過表達(dá)株系耐旱能力較弱，而OsNAC2-RNAi株系有較強(qiáng)的耐旱能力。

鹽處理?xiàng)l件下，Ri25和Ri31的葉相對含水量比野生型分別增加14.7%和14.9%，而OsNAC2過表達(dá)株系ON7和ON11的葉相對含水量則分別降低19.0%和14.2%，如圖1（c）所示。結(jié)果說明苗期時(shí)的OsNAC2-RNAi株系對鹽脅迫有一定的適應(yīng)能力。

2.2 干旱和鹽脅迫對生殖期OsNAC2轉(zhuǎn)基因株系的影響

將正常培養(yǎng)4周的OsNAC2過表達(dá)（ON7和ON11），RNAi（Ri25和Ri31）和野生型株系進(jìn)行干旱處理2周（見方法1.2.3）。干旱脅迫條件下，葉相對含水量最高的是RNAi株系，其次是野生型，最低的是OsNAC2過表達(dá)株系;RNAi株系Ri25和Ri31的葉相對含水量比野生型分別增加了12.0%和13.5%;OsNAC2過表達(dá)株系ON7和ON11的葉相對含水量比野生型分別降低了16.9%和9.6%，如圖2（b）所示。這些數(shù)據(jù)說明，OsNAC2過表達(dá)株系對干旱脅迫較為敏感，而RNAi株系對干旱脅迫有更強(qiáng)的適應(yīng)性。

將正常培養(yǎng)4周的ON7，ON11，Ri25，Ri31和野生型株系進(jìn)行鹽脅迫處理，由圖2（c）可知：鹽脅迫條件下，OsNAC2-RNAi株系Ri25和Ri31的葉相對含水量比野生型分別增加11.6%和11.7%，OsNAC2過表達(dá)株系ON7和ON11的葉相對含水量分別降低10.8%和7.2%。這些數(shù)據(jù)表明，OsNAC2過表達(dá)株系對鹽脅迫比較敏感，而RNAi株系有更強(qiáng)的耐鹽性。

2.3 干旱和鹽脅迫對OsNAC2轉(zhuǎn)基因株系的株高、分蘗數(shù)和穗數(shù)指標(biāo)的影響

將生殖期干旱和鹽脅迫的植株脅迫后進(jìn)行復(fù)水和正常管理，種子成熟后分別測定各株系的株高、分蘗數(shù)以及穗數(shù)（圖3），不論是對照組還是實(shí)驗(yàn)組，OsNAC2過表達(dá)株系的株高顯著低于野生型與RNAi株系，而RNAi與野生型株系的株高相對持平，如圖3（a）所示，這與文獻(xiàn)[13-14]的結(jié)果一致。RNAi株系的分蘗數(shù)在干旱和鹽處理下均比其他株系顯著增加，如圖3（b）所示。但是，所有株系的有效穗數(shù)并無顯著差異，而且在鹽脅迫下，所有株系的穗數(shù)均降低，如圖3（c）和3（d）所示。

2.4 干旱和鹽脅迫對OsNAC2轉(zhuǎn)基因株系產(chǎn)量性狀的影響

將生殖期干旱和鹽脅迫的植株脅迫后進(jìn)行復(fù)水和正常管理，種子成熟后分別測定各株系的結(jié)實(shí)率、粒數(shù)和千粒重等產(chǎn)量性狀指標(biāo)（圖4）。RNAi株系的結(jié)實(shí)率比野生型分別增加29.2%和20.8%;而OsNAC2過表達(dá)株系ON7和ON11的結(jié)實(shí)率則分別降低27.1%和12.5%，如圖4（a）和4（b）所示。而在鹽脅迫條件下，所有株系的結(jié)實(shí)率和粒數(shù)都比較低，并且各株系之間并無顯著差異，如圖4（a）～4（c）所示。在正常生長條件下，OsNAC2過表達(dá)株系每株粒數(shù)和千粒重均顯著低于野生型，野生型與RNAi株系持平;在干旱脅迫條件下，RNAi株系的總粒數(shù)均顯著高于野生型，如圖4（c）和4（d）所示。根據(jù)上述數(shù)據(jù)可得，RNAi株系在干旱脅迫下，通過增加水稻的結(jié)實(shí)率進(jìn)而增加每株的水稻粒數(shù)。

3 ?討論及結(jié)論

NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子之一，目前，對于NAC家族下游基因的研究已經(jīng)有了較大的進(jìn)展，尤其是關(guān)于植物生長發(fā)育、脅迫應(yīng)答和激素調(diào)節(jié)等方面^[19-20]。相信隨著分子生物技術(shù)和生物工程的發(fā)展，與NAC轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)的一些良好的生物學(xué)指標(biāo)能夠得到定向改良，而其中最重要性狀之一就是產(chǎn)量。

干旱和鹽脅迫是限制水稻產(chǎn)量的重要因素，而目前沒有報(bào)道OsNAC2在水稻干旱和鹽脅迫下對產(chǎn)量性狀的具體分析。本研究選用OsNAC2過表達(dá)和RNAi株系，分別在苗期和生殖期進(jìn)行干旱和鹽脅迫處理，通過測量葉片相對水含量和產(chǎn)量性狀的指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)RNAi株系雖然在鹽脅迫下的葉相對水含量比野生型和過量表達(dá)株系均高，但是RNAi株系的穗數(shù)、結(jié)實(shí)率、粒數(shù)和千粒重與野生型相比均未有明顯差異，說明在鹽脅迫條件下，OsNAC2的缺失可以增強(qiáng)營養(yǎng)器官的耐鹽性，但是對于產(chǎn)量性狀并無明顯影響。

OsNAC2-RNAi株系在干旱脅迫下比野生型和過表達(dá)株系的葉相對含水量均高，可能與葉片失水導(dǎo)致氣孔關(guān)閉、降低蒸騰、減少植株體內(nèi)水分的散失有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)：在干旱脅迫條件下，ONAC022過表達(dá)使植株的失水速率、蒸騰速率和氣孔開放率降低，脯氨酸和可溶性糖含量增加，顯著提高植物的耐旱性^[21]。另外，RNAi株系的分蘗數(shù)在干旱和鹽處理下均比其他株系顯著增加，但是所有株系的有效穗數(shù)并沒有明顯差異，這可能由于干旱脅迫影響水稻生長，無法保障后期進(jìn)行有效的灌漿和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)造成的。此外，在干旱脅迫下各株系的分蘗數(shù)最多，可能是因?yàn)樗驹诟珊禇l件下分蘗期需水量相對最少^[22]。并且，RNAi株系的結(jié)實(shí)率比野生型顯著提高20.8%～29.2%，進(jìn)而顯著提高水稻的產(chǎn)量。綜上所述，OsNAC2功能敲除株系可以應(yīng)用于水稻耐旱品種的育種工作中，是耐旱穩(wěn)產(chǎn)的育種材料。

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（責(zé)任編輯：顧浩然）