朱小潔 周翔宇 范 航 高喜鳳 楊 蕾*

(1.上海辰山植物園，中國(guó)科學(xué)院上海辰山植物科學(xué)研究中心，上海市資源植物功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201602； 2.上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200234； 3.中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，中國(guó)科學(xué)院上海植物逆境生物學(xué)研究中心，上海 201602)

圖1 9種唇形科芳香植物 A.百里香；B.鳳梨鼠尾草；C.藿香；D.美國(guó)薄荷；E.迷迭香；F.南歐丹參；G.牛至；H.香蜂花；I.藥用鼠尾草Fig.1 Nine species of aromatic plants of Lamiaceae A.T.mongolicus Ronn.; B.S.elegans Vahl.; C.A.rugosa(Fisch.et Mey.) O.Kuntze.; D.M.didyma L.; E.R.officinalis L.; F.S.sclarea L.; G.O.vulgare L.; H.M.officinalis L.; I.S.officinalis L.

揮發(fā)性萜類普遍存在于植物防御反應(yīng)中，因其具有抗氧化和抗菌的功能，可保護(hù)植物免受病菌的侵害，同時(shí)揮發(fā)性萜類也可通過(guò)吸引害蟲的天敵實(shí)現(xiàn)間接防御反應(yīng)[1]。此外，揮發(fā)性萜類還可以通過(guò)增強(qiáng)花和果實(shí)的香味吸引動(dòng)物促進(jìn)植物的授粉和種子傳播。芳香植物，含有大量的揮發(fā)性萜類成分，因此被廣泛用于食品、化妝品、醫(yī)藥、保健及風(fēng)景園林等各個(gè)行業(yè)[2～5]。

目前全世界已報(bào)道的芳香植物約有3 600余種，但其中僅有300種被開發(fā)[6]，因此，如何更好地開發(fā)和利用芳香植物是一項(xiàng)具有重大經(jīng)濟(jì)效益的研究?jī)?nèi)容。唇形科是芳香植物聚集的一個(gè)大科[7]，許多常見的芳香植物，如百里香(ThymusmongolicusRonn.)、鳳梨鼠尾草(SalviaelegansVahl.)、藿香(Agastacherugosa(Fisch. et Mey.) O.Kuntze.)、美國(guó)薄荷(MonardadidymaL.)、迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)、南歐丹參(SalviasclareaL.)、牛至(OriganumvulgareL.)、香蜂花(MelissaofficinalisL.)和藥用鼠尾草(SalviaofficinalisL.)均屬于唇形科(見圖1)。芳香植物除了被廣泛用作食品調(diào)料外，在臨床上也可用于治療多種疾病，如百里香具有抗菌、鎮(zhèn)咳和祛痰的功效[8]；牛至常用于解表、理氣和化濕[9～10]；藿香被用于治療消化不良、皮膚真菌感染等疾病[11～12]；迷迭香在降低心臟和大腦的脂質(zhì)過(guò)氧化[13]、預(yù)防和治療癌癥[14]、抑郁[15]等均有應(yīng)用。

揮發(fā)性萜類是芳香植物重要的次生代謝產(chǎn)物，來(lái)源于兩條相對(duì)獨(dú)立的生物合成途徑，這兩條途徑分別是定位于質(zhì)體的甲基赤蘚醇-4-磷酸(MEP)途徑和定位于胞質(zhì)的甲羥戊酸(MVA)途徑，其中單萜類化合物主要來(lái)源于MEP途徑，倍半萜類化合物主要來(lái)源于MVA途徑[16]。以往對(duì)芳香植物的研究多集中在精油成分的鑒定、抑菌、抗氧化等活性方面，以及揮發(fā)性萜類成分的分類比較研究，而對(duì)物種間代謝合成的比較研究較少。本研究以9種唇形科芳香植物葉片為材料，采用GC-MS的方法測(cè)定各植物葉片揮發(fā)性萜類成分，通過(guò)對(duì)揮發(fā)性萜類的多角度比較分析，不僅為芳香植物的高效利用、合理開發(fā)提供參考，還為植物萜類的代謝研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

百里香(ThymusmongolicusRonn)、鳳梨鼠尾草(SalviaelegansVahl)、藿香(Agastacherugosa(Fisch.et Mey.) O.Ktze.)、美國(guó)薄荷(MonardadidymaL.)、迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)、南歐丹參(SalviasclareaL.)、牛至(OriganumvulgareL.)、香蜂花(MelissaofficinalisL.)和藥用鼠尾草(SalviaofficinalisL.)等植物材料培養(yǎng)于上海辰山植物園園藝苗圃，植物長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)病蟲害。GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀(7890A-5975C，美國(guó)安捷倫公司)；HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，安捷倫科技公司)；BSA 224S型分析天平，賽多利斯(上海)貿(mào)易有限公司。實(shí)驗(yàn)所用正己烷和乙酸壬酯購(gòu)于Sigma-Aldrich公司，C7～C40正構(gòu)烷購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 9種芳香植物揮發(fā)性萜類的提取

分別取9種芳香植物的新鮮葉片，切成小塊后，在液氮中研磨成粉末，精確稱取0.3 g于2 mL離心管中，加入1 mL正己烷(含有10 ng·μL-1的乙酸壬酯)，將樣品粉末過(guò)夜浸提，每種植物設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。提取后的樣品以12 000 r·min-1離心10 min，過(guò)濾收集上清液用于GC-MS檢測(cè)。

1.3 9種芳香植物揮發(fā)性萜類的GC-MS分析

采用安捷倫7890A氣相色譜儀和安捷倫5973A聯(lián)用質(zhì)譜儀。在毛細(xì)管柱HP-5MS上分離，升溫程序：起始溫度60℃保留2 min，以10℃·min-1升溫到260℃，保留10 min。載氣為高純氦氣(99.99%)，流速為1 mL·min-1，無(wú)分流進(jìn)樣。電離方式EI，設(shè)定離子源溫度為230℃，四級(jí)桿溫度為150℃，電子能量70 eV，掃描范圍(m/z)50～550。

1.4 保留指數(shù)RI值的測(cè)定

取正構(gòu)烷烴混合對(duì)照品，按照1.3實(shí)驗(yàn)條件分析，記錄每個(gè)正構(gòu)烷烴的出峰時(shí)間，采用保留指數(shù)的線性升溫公式計(jì)算各組分的RI值，計(jì)算公式為：

RI=100Z+100[RT(x)-RT(z)]/[RT(z+1)-RT(z)]

(1)

式中：RT(x)，RT(z)，RT(z+1)分別代表組分及碳數(shù)為z，z+1正構(gòu)烷的保留時(shí)間，且RT(z)

1.5 統(tǒng)計(jì)與分析

本實(shí)驗(yàn)采用3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差呈現(xiàn)，P<0.05被認(rèn)為是具有顯著性差異，數(shù)據(jù)分析在SPSS 19.0軟件上進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 9種芳香植物葉片揮發(fā)性萜類成分的分析

9種芳香植物葉片共檢測(cè)到77種揮發(fā)性萜類物質(zhì)(見表1)，使用NIST(National Institute of Standards and Technology)數(shù)據(jù)庫(kù)，依據(jù)質(zhì)譜特征和保留指數(shù)并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)9種植物各揮發(fā)性萜類成分進(jìn)行定性分析[17]，以乙酸壬酯作為對(duì)照品，對(duì)揮發(fā)性萜類成分進(jìn)行定量分析。將揮發(fā)性萜類根據(jù)含有的異戊二烯單元的數(shù)目及是否含氧分為4大類：?jiǎn)屋苹衔?7種、單萜氧化物28種、倍半萜化合物22種，以及倍半萜氧化物10種。其中藿香含有的種類最多(46種)，其次是迷迭香(35種)、百里香(33種)、藥用鼠尾草(33種)和美國(guó)薄荷(31種)；牛至(29種)中也含有豐富的種類；鳳梨鼠尾草(18種)、香蜂花(13種)和南歐丹參(9種)中種類相對(duì)較少。

我們共檢測(cè)到24種萜類物質(zhì)是特異存在于單一植物中(見表1)。其中藿香和迷迭香中特異性萜類種數(shù)最多，都為7種，而南歐丹參和牛至中沒有其物種特異的萜類。百里香中特異存在反式-α-香柑油烯，在部分文獻(xiàn)中沒有檢測(cè)到該物質(zhì)[18～19]；鳳梨鼠尾草中特異存在別香橙烯和Bicyclogermacrene，但含量較低；藿香中特異存在檸檬烯、順式氧化檸檬烯、(-)-(E)-氧化檸檬烯、(+)-二氫香芹酮、葛縷醇、反式氧化香芹酮和優(yōu)葛縷酮，其中檸檬烯在不同產(chǎn)地藿香中均有報(bào)道[20～22]，而其他成分未見報(bào)道；反式-橙花叔醇特異存在于美國(guó)薄荷中，但在部分文獻(xiàn)中未見報(bào)道[23～24]；迷迭香中有7種特異存在的化合物，分別是3-蒈烯、龍腦烯醛、異胡薄荷醇、馬鞭草烯酮、香茅醇、β-姜黃烯和α-紅沒藥醇，其中異胡薄荷醇、香茅醇在滇產(chǎn)迷迭香中有報(bào)道[25]，3-蒈烯、馬鞭草烯酮、α-紅沒藥醇也被檢測(cè)到[26]，而龍腦烯醛、β-姜黃烯并未見報(bào)道；trans-Chrysanthemal、橙花醇和檸檬醛特異存在于香蜂花，其中檸檬醛在香蜂花中普遍存在且含量極高[27～28]，因此可以作為鑒定香蜂花品質(zhì)的標(biāo)志化合物；側(cè)柏酮、喇叭菜萜醇、葎草烯環(huán)氧化物Ⅱ特異存在于藥用鼠尾草中，與目前已報(bào)道的藥用鼠尾草的檢測(cè)成分一致，但并不是所有報(bào)道的藥用鼠尾草均顯示同時(shí)存在這3種成分，大部分的藥用鼠尾草均含有側(cè)柏酮，部分藥用鼠尾草檢測(cè)到喇叭菜萜醇或葎草烯環(huán)氧化物Ⅱ[29]。

表1 9種芳香植物揮發(fā)性萜類成分

續(xù)表1 Continued table 1

化學(xué)成分Component分子式Formula分子量Molecule保留指數(shù)Relentin index百里香T.mongolicus鳳梨鼠尾草S.elegans藿香A.rugosa美國(guó)薄荷M.didyma迷迭香R.officinalis南歐丹參S.sclarea牛至O.vulgare香蜂花M.officinalis藥用鼠尾草S.officinalis(+)-二氫香芹酮 DihydrocarvoneC10H16O1521199--+*------馬鞭草烯酮VerbenoneC10H14O1501215----+*----反式—葛縷醇trans-CarveolC10H16O1521220--+++---+香茅醇CitronellolC10H20O1561225----+*----橙花醇NerolC10H18O1541227-------+*-葛縷醇CarveolC10H16O1521232--+*-----+右旋香芹酮D-CarvoneC10H14O1501248--+-+---+香葉醇GeraniolC10H18O1541252----+--+-百里醌ThymoquinoneC10H12O21641254+--+-----反式氧化香芹酮 trans-Carvone oxideC10H14O21661268--+*------檸檬醛CitralC10H16O1521276-------+*-百里香酚ThymolC10H14O1501300+---+-+--優(yōu)葛縷酮EucarvoneC10H14O1501346--+*------丁子香酚EugenolC10H12O21641359++++-++++合計(jì)Total921681614613倍半萜化合物Sesquiterpeneγ-欖香烯 γ-ElemeneC15H242041342-++--++--α-古巴烯 α-CopaeneC15H242041382--++-++-+β-波旁烯 (-)-beta-BourboneneC15H242041393--++--+--(-)-β-欖香烯 (-)-β-ElemeneC15H242041396--++--+--(-)-α-古蕓烯 (-)-α-GurjuneneC15H242041418-++------β-依蘭烯 β-ylangeneC15H242041427+-++-++--石竹烯CaryophylleneC15H242041429+++++++++bata-古巴西烯 β-copaeneC15H242041438++++-++++γ-依蘭油烯 γ-MuuroleneC15H242041453++++--+--蛇麻烯 HumuleneC15H242041463+++++++++別香橙烯 AlloaromadendreneC15H242041471-+*-------(+)-表二環(huán)倍半水芹烯(+)-epi-BicyclosesquiphellandreneC15H242041472+-++--+-+右旋大根香葉烯Germacrene DC15H242041490+-++-++--BicyclogermacreneC15H242041504-+*-------α-金合歡烯 α-FarneseneC15H242041505+-----+--β-沒藥烯 β-BisaboleneC15H242041510+---+----β-姜黃烯 β-CurcumeneC15H242041512----+*----異喇叭烯 IsoledeneC15H242041521-++---+-+cis-β-金合歡烯 cis-β-FarneseneC15H242041526+---+----d-杜松烯 d-CadineneC15H242041529-+++--+--反式-α-香柑油烯 trans-α-BergamoteneC15H242041543+*--------α-依蘭油烯 α-MuuroleneC15H242041545-++------合計(jì) Total11111511571436倍半萜氧化物Sesquiterpene oxide反式—橙花叔醇 trans-Nerolidol 2C15H26O2221562---+*-----表藍(lán)桉醇EpiglobulolC15H26O2221585+-++--++-(-)-桉油烯醇 (-)-SpathulenolC15H26O2221588-++---+-+丁香烯氧化物 Caryophyllene oxideC15H24O2201596-+----+++喇叭菜萜醇LedolC15H26O2221605--------+*葎草烯環(huán)氧化物ⅡHumulene epoxide ⅡC15H24O2201623--------+*CubedolC15H24O2201626--+---+--杜松醇α-CadinolC15H26O2221666--+---+--α-紅沒藥醇 α-BisabololC15H26O2221691----+*----喇叭烯氧化物 Ledene oxide-(Ⅱ)C15H24O2201700--+---+--合計(jì)Total125210624總計(jì) Total33184631359291333

注：“+”代表這種物質(zhì)在該植物中有檢測(cè)到；“-”代表這種物質(zhì)在該植物中未檢測(cè)到；*表示該化合物在這一植物種特異存在

Note:“+” indicates that this compound was detected in the plant; “-” indicates that this compound was not detected in the plant;*indicates that the compound was specific to this plant species

圖2 9種芳香植物揮發(fā)性萜類總量 不同小寫字母表示9種芳香植物揮發(fā)性萜類含量存在顯著差異(P<0.05)Fig.2 Total volatile terpenes of nine aromatic plantsDifferent lowercase letters indicate that there are significant differences in volatile terpenes of nine aromatic plants(P<0.05)

利用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，9種芳香植物間揮發(fā)性萜類總含量存在顯著差異。結(jié)果如圖2所示，迷迭香和藥用鼠尾草含量較高，均高于2 000 μg·g-1FW；藿香、美國(guó)薄荷、百里香和香蜂花揮發(fā)性萜類總含量在900～2 000 μg·g-1FW，且百里香與美國(guó)薄荷含量無(wú)顯著差異；牛至和鳳梨鼠尾草揮發(fā)性萜類總含量較低且無(wú)顯著差異；南歐丹參含量最低，僅為迷迭香總量的1%。依據(jù)本次檢測(cè)結(jié)果，我們認(rèn)為牛至、鳳梨鼠尾草和南歐丹參因其揮發(fā)性萜類總量較低，不適宜作為提取揮發(fā)性萜類的材料。

2.2 9種芳香植物共有揮發(fā)性成分的比較

石竹烯和蛇麻烯是9種芳香植物的共有揮發(fā)性萜類(見圖3)。石竹烯也叫β-石竹烯，蛇麻烯也叫ɑ-石竹烯，石竹烯和蛇麻烯是同分異構(gòu)體，石竹烯含量除在鳳梨鼠尾草(34.96%)和香蜂花(17.42%)中比例較高外，其余7種芳香植物中其比例均小于3%。蛇麻烯在9種植物中相對(duì)含量普遍較低，均小于6%，在藥用鼠尾草中絕對(duì)含量明顯高于其他幾種植物。

圖3 9種植物的共有揮發(fā)性萜類成分的含量Fig.3 The content of common volatile terpenoids in nine plants

2.3 9種芳香植物的主要揮發(fā)性萜類成分的比較

9種芳香植物的主要揮發(fā)性萜類成分見表2，百里香中含量最高的化合物是γ-松油烯，為410.99±38.72 μg·g-1，占揮發(fā)性萜類總量的28.04%，其次是2-蒈烯、α-蒎烯、β-沒藥烯和百里醌。這些主要成分與馬莉等[18]報(bào)道的百里香精油中主要揮發(fā)性成分差異較大，可能是不同的提取方式和不同的提取時(shí)間導(dǎo)致的差異。

鳳梨鼠尾草的主要揮發(fā)性萜類成分是石竹烯、羅勒烯和芳樟醇。石竹烯已被證實(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用，廣泛存在于多種芳香植物中[30]。迷迭香和藥用鼠尾草中含量最高的萜類均為桉樹醇，同時(shí)含有較多的α-蒎烯和莰烯。樟腦是藥用鼠尾草中含量第二高的成分，具有通竅、除濕、殺蟲止痛等功能[31]；α-蒎烯有抗腫瘤抗真菌等多種活性[32]；莰烯又稱樟腦萜，是合成樟腦和龍腦的原料，也可以用于合成殺蟲劑和防腐劑[33]。

牛至和南歐丹參中含量最高的化合物均為右旋大根香葉烯，除此之外牛至中還含有較多的反式—羅勒烯和別羅勒烯。右旋大根香葉烯被報(bào)道對(duì)蚊子、扁虱和蚜蟲等具有毒性[34]。

藿香中含量最高的化合物是D-檸檬烯，為(915.2±66.2) μg·g-1，占揮發(fā)性萜類成分的47.63%，其次是β-蒎烯和右旋香芹酮。3種萜類成分占總揮發(fā)性萜類的60%以上。D-檸檬烯在預(yù)防和治療癌癥方面具有明顯的活性[35]，因此近年引起了人們的廣泛關(guān)注。

美國(guó)薄荷中含量最高的化合物為2-蒈烯，其次是α-蒎烯和β-月桂烯。2-蒈烯、α-蒎烯和β-月桂烯均有較高的抗菌作用，因此也被廣泛利用。

香蜂花中含量最高的化合物是檸檬醛，為(665.65±5.02) μg·g-1，占揮發(fā)性萜類成分的69.80%，其次是石竹烯和香葉醇，3種成分占總揮發(fā)性萜類的93.05%。檸檬醛又名香葉醛，特異存在于香蜂花中，具有抗菌活性[36]和檸檬香味，作為食品香料廣泛用于需要檸檬香氣的各個(gè)方面。

表2 9種芳香植物的主要揮發(fā)性萜類成分

2.4 9種芳香植物的不同類型萜類組分的比較

9種芳香植物不同類型的揮發(fā)性萜類組分比例及含量有所不同。如圖4所示，所有測(cè)定的芳香植物中，倍半萜氧化物含量所占比例普遍較低。每種植物都具有優(yōu)勢(shì)成分，其中百里香、藿香、美國(guó)薄荷和迷迭香等4種植物的優(yōu)勢(shì)萜類組分是單萜化合物，鳳梨鼠尾草和南歐丹的優(yōu)勢(shì)萜類組分是倍半萜化合物，香蜂花和藥用鼠尾草的優(yōu)勢(shì)萜類組分是單萜氧化物。牛至中含有的單萜化合物和倍半萜化合物含量相近，單萜氧化物和倍半萜氧化物所占比例較低。

從絕對(duì)含量上看，如圖5所示，測(cè)定的芳香植物中揮發(fā)性萜類多集中在單萜化合物及氧化物，倍半萜氧化物含量最少?？傮w來(lái)看，除鳳梨鼠尾草、南歐丹參和香蜂花外，其他6種植物單萜類的含量明顯高于倍半萜類的含量。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出迷迭香、藥用鼠尾草、藿香、百里香和美國(guó)薄荷在萜類種類和含量上都相對(duì)較高，因此較適宜作為提取揮發(fā)性萜類的材料，而牛至、鳳梨鼠尾草和南歐丹參中揮發(fā)性萜類種類較少、含量較低，因此不適宜作為提取揮發(fā)性萜類的材料。雖然檢測(cè)到24種萜類成分特異存在于單一植物中，但是通過(guò)文獻(xiàn)比較并不是所有化合物都能在已報(bào)道的文獻(xiàn)中找到或同時(shí)找到，揮發(fā)性萜類化合物，作為次生代謝產(chǎn)物，其生物合成及代謝受外界環(huán)境的影響而變化，所以在不同生境下的同種植物很可能合成不同的次生代謝產(chǎn)物。因此，導(dǎo)致我們研究結(jié)果中部分物種的特異化合物與文獻(xiàn)報(bào)道有所差異，原因可能是由不同采集時(shí)間、不同采集地點(diǎn)以及對(duì)揮發(fā)性成分的不同提取方式等多種因素所導(dǎo)致的[37]。

圖4 9種芳香植物萜類組分比較Fig.4 Comparison of terpenoids in nine aromatic plants

9種植物的共有萜類成分是石竹烯和蛇麻烯，石竹烯和蛇麻烯常常同時(shí)出現(xiàn)在植物中，比如有報(bào)道在雪松松針和杜鵑葉中同時(shí)檢測(cè)到了石竹烯和蛇麻烯[37～38]。而9種芳香植物的主要成分存在明顯差異，相較而言迷迭香和藥用鼠尾草的主要成分相近，都含有桉樹醇，α-蒎烯，兩種植物的主要揮發(fā)性氣味相近，這與實(shí)際兩種植物在氣味上相近一致。

將9種芳香植物揮發(fā)性萜類成分，按照單萜類和倍半萜類分組后，我們發(fā)現(xiàn)，百里香、藿香、美國(guó)薄荷、迷迭香、香蜂花和藥用鼠尾草等6種植物的單萜類成分明顯高于倍半萜類。一般認(rèn)為，植物萜類代謝途徑中單萜類成分是通過(guò)定位于質(zhì)體中的MEP途徑合成，倍半萜類成分是通過(guò)定位于胞質(zhì)的甲羥戊酸MVA途徑合成[39]。MEP途徑中提供牻牛兒基二磷酸GPP(C10)，被單萜合酶催化生成單萜類化合物；MVA途徑中提供法尼基二磷酸FPP(C15)，在倍半萜合成酶催化下生成倍半萜類化合物[16]。萜類合酶的數(shù)量、單個(gè)萜類合酶產(chǎn)生多種萜類化合物的能力以及萜類合酶對(duì)底物的親和力等都是造成植物揮發(fā)性萜類成分種類繁多豐富的原因[40]，因此上述芳香植物在正常環(huán)境中生成單萜類化合物的能力高于生成倍半萜類化合物的能力，可能與其含有的萜類合酶有關(guān)，我們的研究結(jié)果為芳香植物萜類生物合成途徑的解析，以及萜類合酶功能的鑒定提供了重要參考。

揮發(fā)性萜類物質(zhì)是芳香植物的主要活性物質(zhì)，也是重要的次生代謝產(chǎn)物。不同的芳香植物在萜類種類、含量及組分上存在一定的差異，通過(guò)對(duì)9種芳香植物萜類組分的分類比較和分析，不僅為芳香植物的合理開發(fā)和高效利用提供參考，同時(shí)也為植物萜類次生代謝研究提供依據(jù)。