鄧俊杰 ABDUL MAJEED BALOCH 侯雪月 李嘉哲 茶新有 張榮沭

(東北林業(yè)大學園林學院，哈爾濱 150040)

近年來我國的土壤退化現象十分嚴重，相關部門及政策都要求降低化學農藥和肥料的使用量，大力支持和鼓勵生物肥料的開發(fā)和利用，其中就包括木霉菌(Trichodermaspp.)。木霉菌屬真菌門(Eumycota；Mycobionta)，半知菌亞門(Deuteromycotina)，絲孢綱(Hyphomycetes)，絲孢目(Hyphomycetales)，叢梗孢科(Moniliaceae)，木霉屬(Trichoderma)，是自由生活的真菌，常見于各種生態(tài)系統(tǒng)的土壤、腐爛的木材和葉凋落物等分解材料中[1]。木霉菌主要通過寄生作用對植物產生影響。木霉菌有很強的根部定植能力，在植物的根基部位能分泌一些抑制病原真菌的生長或者為植物生長提供養(yǎng)分的物質[2]，還能通過調節(jié)植物體內激素水平[3～4]、固定大氣中的氮[5]、提高植物對磷的吸收[6]以及通過產生鐵載體提高植物對礦物質的吸收[7]，從而促進植物的生長。

月季(Rosachinensis‘Shi-Jie-Mei’)作為一種集觀賞、食用和藥用等多用途的木本花卉植物[8]，具有很高的經濟價值，近年來其栽培面積逐年上升，運用生態(tài)環(huán)保的肥料促進其生長和有效抑制其生長過程中的病害發(fā)生是十分必要的。木霉在月季根部定植后，可以產生抗生素和植物生長調節(jié)劑，抑制或降解根際有害物質、增加養(yǎng)分利用率，從而促進月季生長。筆者將盆栽月季根施哈茨木霉T6，并系統(tǒng)分析月季硬枝出芽率；枝條和葉片性狀；內源激素水平和防御酶活性的變化，以期為月季繁殖提供新的方法，并為研制促進月季生長的生防木霉菌肥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

木霉菌：從黑龍江省牡丹江火山巖臺地生長的蒙古櫟根際土壤樣本中分離純化獲得寒地習居哈茨木霉T6(Trichodermaharzianum)菌株[9]，菌種由東北林業(yè)大學園林植物應用實驗室保存。

月季：月季硬枝條，購于黑龍江省佳木斯市南崗苗木專業(yè)合作社。

1.2 木霉菌分生孢子培養(yǎng)方法

1.3 木霉菌施入方法

2017年2月末將越冬后約15 cm長的月季硬枝條在溫室進行盆土扦插培養(yǎng)，土壤為大田土∶細砂土=3∶1，處理組每盆土壤中拌入100 mL木霉分生孢子懸浮液，以未施用木霉的實驗組為對照，每實驗組5株苗，3個重復。在保持相對濕度高于80%條件下培養(yǎng)，從出芽開始統(tǒng)計出芽數，每天統(tǒng)計1次，第25天統(tǒng)計后計算出芽率(出芽率=總出芽數量/硬枝數量)。

待硬枝條葉腋上發(fā)出嫩芽大于2 cm時(見圖1B)，連同莖段一起剪下埋入盆土中繼續(xù)保濕培養(yǎng)。5月15日將幼芽(見圖1C)移入東北林業(yè)大學園林學院苗圃進行自然條件下盆栽培養(yǎng)，此時處理組不加木霉菌。為了觀察木霉菌對月季生長的影響，暫未作剪枝處理。并于6月15日、7月15日和8月15日，處理組分別施入100 mL木霉分生孢子懸浮液，根據天氣情況進行澆水和除草管理。

1.4 月季枝條數量和長度測量方法

9月15日記錄每株月季苗的枝條數，并用卷尺測量枝條長度。

1.5 月季莖和葉片生物量測量方法

摘取每株月季最高枝條頂端第3節(jié)間的葉片，稱重后置于液氮中速凍，帶回實驗室，-80℃保存，用于酶活性和激素水平測定。在距土表面15 cm處，將月季苗所有枝條剪下，放入冰盒中帶回實驗室。將采集的月季樣本的枝條和葉片分開，用電子秤分別稱量，得出鮮重。再將枝條和葉片用烘干箱105℃殺青30 min，然后80℃烘干至恒重，再次稱量得出干重。

1.6 月季葉片防御酶活性檢測方法

酶液提?。喝〕蜏乇４娴脑录救~片0.5 g，按照李合生的方法制備防御酶粗提液。參照李合生等[10]的氮藍四唑(NBT)法測定超氧化物歧化酶(SOD)的活性、愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶(POD)的活性、紫外吸收法測定過氧化氫酶(CAT)的活性。

1.7 月季葉片內源激素水平檢測方法

(1)內源激素提取方法：根本Zhai T T等的方法[11]提取月季內源激素。

(2)LC-MS條件：色譜條件：流速：1 mL·min-1；柱溫25℃；進樣量10 μL；進樣延遲5 min。流動相由甲醇(A)和0.1%甲酸水溶液(B)組成，梯度洗脫條件參照文獻Zhang等[12～14]和Zhai等進行。質譜條件：采用API3000三重四極桿質譜儀在負離子模式下進行操作。電噴霧離子源(ESI)條件及CID-MS/MS參數優(yōu)化結果與文獻Zhang等和Zhai等相同(見表1)。用Analyst software(1.4版本)進行數據處理。

1.8 數據處理方法

采用Microsoft office excel 2007軟件進行繪制圖表，利用SPSS對不同處理間的差異顯著性進行ANOVA分析，在P=0.05下比較差異性。

圖1 哈茨木霉對月季生長的影響 A.月季發(fā)芽率；B.硬枝幼芽；C.月季幼苗；D.采樣前的生長狀態(tài)；E.月季枝條數量和長度Fig.1 Effect of T.harzianum T6 on rose growth A.Germination rate of rose; B.Hard branches budlet; C.Rose seedlings of CK and T group; D.Growth status before harvest; E.The number and length of rose branches

表1 用于激素檢測的質譜參數

2 試驗結果

2.1 哈茨木霉T6對月季苗生長的影響

由圖1A～B可見：木霉菌處理有利于硬枝幼芽的發(fā)育，扦插的月季硬枝在第10天開始出芽，處理組3個，對照組2個；統(tǒng)計到第25天時硬枝不再出芽。結果發(fā)現木霉菌處理的硬枝出芽快、數量多，是對照組出芽率的1.4倍(P<0.05)。并且，月季硬枝早期接種木霉菌有利于幼苗后期的生長(見圖1C)。月季枝條長度和數量測量結果表明，與對照組(CK)相比，處理組(T6)月季苗的平均長度為71.7 cm，比CK組增加81.84%，生長速度顯著提高(P<0.05)；此外，T6組月季苗平均新生枝條數為1.4條，比CK組增加7.69%，但差異不顯著(P>0.05)(見圖1D～E)。生物量測量的結果表明，與CK組相比，T6組月季苗枝條的平均鮮重為15.3 g，增加了41.67%(P<0.05)；平均干重為7.5 g，增加了33.93%(P<0.05)。T6組葉片的平均鮮重為18.0 g，增加了59.29%(P<0.05)；

1.3.3 加強田間管理 發(fā)病初期及時拔除病株，并在田外銷毀。施足有機肥，增施磷、鉀肥，提高植株自身的抗病性，減輕病害；栽培前期及時供水，澆水后及時松土，提高地溫，促進發(fā)根；栽培中期注意通風，防止徒長，促花保果。

表2 哈茨木霉菌對月季苗生物量的影響

Table 2 Effects ofT.harzianumT6 on the biomass in branches and leaves of rose

鮮重Fresh weight(g)干重Dry weight(g)枝條Branch葉Leaf枝條Branch葉LeafCK10.8±1.4b11.3±2.1b5.6±0.6b5.5±0.9bT615.3±2.6a18.0±3.2a7.5±1.2a7.8±1.4a

平均干重為7.8 g，增加了41.82%(P<0.05)。說明施用木霉菌能顯著提高月季苗枝條和葉片的生物量產量(見表2)。

2.2 哈茨木霉T6對月季苗防御酶活性的影響

分析結果表明，T6組SOD活性比CK組提高了24.44%(P<0.05)(見圖2A)；T6組葉片中POD活性比CK組提高了76.23%(P<0.05)(見圖2B)；T6組葉片中SOD活性比CK組提高了19.95%(P<0.05)(見圖2C)。因此，施用木霉菌能使月季苗葉片中SOD、POD和CAT的活性均顯著提升。

圖2 月季苗的防御性酶活性Fig.2 Defense enzyme activity of rose

圖3 月季葉片中激素水平Fig.3 Hormon levels in the leaves of rose

2.3 哈茨木霉T6對月季葉片內源激素水平的影響

分析結果表明，T6組月季苗葉中IAA，GA3和ZT的水平均有增高。IAA水平提高最顯著，為220.0 ng·g-1FW，與CK相比增加了135.47%(P<0.05)(見圖3A)。GA3和ZT的激素水平分別為16.4 ng·g-1FW和0.9 ng·g-1FW，與CK組相比分別提高26.51%和45.24%(見圖3B～C)。T6組月季苗葉中ABA含量為2 709.1 ng·g-1FW，比CK組提高了78.08%(見圖3D)(P<0.05)。JA和SA的含量分別為465.1 ng·g-1FW和5 845.0 ng·g-1FW，分別比CK提高了44.64%和53.51%(見圖3E～F)(P<0.05)。說明施用哈茨木霉T6能提高月季苗葉中激素的含量，從而促進月季的生長。

3 討論

本研究結果發(fā)現，哈茨木霉T6顯著提高了月季硬枝的發(fā)芽率，能夠使獲得的月季幼苗比未接種木霉菌的長勢強壯。將獲得的月季苗從溫室移至自然條件下生長4個月，發(fā)現木霉菌誘導能顯著提高月季幼苗的枝條長度和枝條數目，并且對枝條和葉片的生物量的積累及葉片的保水能力也有促進作用。其中月季葉片生物量受哈茨木霉影響最顯著，葉片鮮重與CK組相比增加了59.29%(P<0.05)。此外，處理組月季苗葉片中的防御酶活性也顯著提高，其中POD的活性增加最大，提升了76.23%，其次為SOD，最后為CAT。而且，處理組的月季葉片中內源激素IAA、GA3、ZT、ABA、JA、SA的水平均有提高，其中IAA的水平比CK增加最顯著，提升了135.47%(P<0.05)。

木霉菌是一種能夠促進植物生長，誘導植物提高抗性，同時抑制病原菌生長的環(huán)境友好型生防真菌，具有改良土壤和預防植物病害發(fā)生的作用[2～7]。近代植物病理學認為，利用生物或理化因子處理植株后所產生的抗病性稱為誘導抗病性[15]，改變植物對病害的反應產生局部或系統(tǒng)的抗性，能誘導植物產生抗性的物質稱為激發(fā)子[16]。Bailey和Lumsden的研究[17]揭示了木霉菌的木聚糖酶或其他的激發(fā)子能夠誘導植物的抗病性，Elad[18]等利用哈茨木霉接種根部或葉子后，認為木霉菌促進植物生長的重要機制之一是誘導植物產生系統(tǒng)抗性。Windham[19]在固定的悉生環(huán)境下，進行了哈茨木霉和康寧木霉刺激植物生長的實驗，在玉米、馬鈴薯、煙草和紅蘿卜上均表現出了高發(fā)芽率、高出苗率及植物干重增加的結果。這與本研究的結果：哈茨木霉T6能提高月季硬枝發(fā)芽率、促進月季生長、提高月季對有機物質的積累結果一致。

超氧化物歧化酶SOD是生物體內重要的抗氧化酶，廣泛分布于各種生物體內，如動物、植物、微生物等[20]。SOD具有特殊的生理活性，是生物體內清除自由基的首要物質。SOD在生物體內的水平高低意味著衰老與死亡的直觀指標；它可對抗與阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，并及時修復受損細胞，復原因自由基造成的對細胞的傷害。過氧化物酶POD具有氧濃度的調節(jié)作用，同時能使毒性物質失活。過氧化氫酶CAT是一種重要的保護酶類，它能促使過氧化氫分解為分子氧和水，清除體內的過氧化氫，從而使細胞免于遭受過氧化氫的毒害，是生物防御體系的關鍵酶之一。我們的研究結果表明木霉T6能提高月季苗中SOD、POD和CAT的活性，增強對自然條件下不良環(huán)境的抵抗能力，從而促進月季的生長。

激素在植物的生長發(fā)育中起著重要的調控作用，它作為信號分子在時間和空間上調控植物發(fā)育的許多過程。IAA為促生長類激素，對植物的生長發(fā)育主要起促進作用[21]。王進等[22]在梨樹上的研究表明，IAA的含量多少與新梢抽發(fā)和快速生長存在一定的相關性，本研究發(fā)現T6組月季葉片中IAA的水平較CK組顯著提高(P<0.05)，T6組較快的生長量和較大的生物量可能與高水平的IAA相關。現在多數研究表明GA有促進破眠的作用。閆海霞等[23]發(fā)現，把低溫層積處理的月季種子置于100 mg·L-1GA3中浸蘸，可有效提高其萌發(fā)率。ZT可以促進細胞分裂，抑制不定根和側根生長，延緩葉片衰老，與植物抗逆性密切相關[24]。湯章城[25]認為ZT可以降低根系對水分的透性，減少氣孔阻力，因此脅迫期間ZT含量的降低，減少了細胞分裂，不利于葉片的伸長，但有利于植物保持較高的水分狀態(tài)，是一種保護性的生理反應[26]。盡管檢測的GA3和ZT水平均高于CK組，但都沒有達到顯著差異，木霉處理提高了葉片含水率是否與ZT調控有關，其機理有待于進一步研究。ABA在種子的發(fā)育、休眠、萌發(fā)以及植物的營養(yǎng)生長、環(huán)境脅迫響應等過程中具有重要作用，ABA和JA是植物應答生物脅迫與非生物脅迫的重要信號分子，許多逆境條件下植物體內ABA或JA含量升高，植物的抗逆性增強[27～28]。SA是植物體內自身合成的酚類化合物，它能夠激活植物過敏反應和系統(tǒng)獲得性抗性[29]。本研究發(fā)現T6組月季葉片中ABA、JA和SA水平均顯著高于CK組，并且與抗性相關的活性酶含量均顯著高于對照組，這些或許與處理組較快的生長速度使其強壯，從而增強了對生長過程中自然條件下的各種脅迫的抵抗能力。

姚志紅等[30]認為山新楊根際接種木霉菌能降低葉片上侵染病原菌對植株的危害，通過調整植物內源激素水平使之趨于未受病原菌侵染時的狀態(tài)，以此來維持植物正常生長。Ying[31]等人在土壤中篩選出58株木霉，用它們分別培養(yǎng)番茄植株發(fā)現，木霉顯示出促進植物生長的作用，包括提高IAA的激素水平。Christmann結論得出[32]，木霉菌增加了激素對植物內部防御的反應水平。由于本研究材料是硬枝扦插獲得的幼芽長大的月季苗，自然條件下生長的第一年并沒有開花，木霉菌對月季開花的影響有待于進一步驗證。

化肥和農藥在增加作物產量的同時，也同樣帶來了負面影響，因此，微生物菌肥得到了人們的青睞。如今國內有關于生防菌肥對月季生長促進的相關研究較少，實驗結果說明木霉菌具有促進月季生長、提高其防御酶活性和激素水平的作用，研究結果為研制促進月季生長的生物菌肥以及針對木霉對月季開花的促進作用的研究提供理論依據。