張曉南 朱鴻維 趙善舶 白 晨 石雅楠徐浩朋 尹 戀 胡淑敏 尹 花*

(1.青島啤酒股份有限公司，啤酒生物發(fā)酵工程國家重點實驗室，青島 266071； 2.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，哈爾濱 150036)

拐棗(HoveniadulcisThunb.)為鼠李科(Rhamnaceae)枳椇屬(Hovenia)高大喬木，主要分布于我國華北、西、華東、西南等地區(qū)[1]。嫩枝、幼葉背面、葉柄和花序軸初有短柔毛，后脫落。葉片橢圓狀卵形、寬卵形或心狀卵形；果柄含多量葡萄糖和蘋果酸鉀，經(jīng)霜后甜，俗稱“拐角”[2]，拐棗的成熟種子(又稱枳椇子)[3]呈暗褐色或黑紫色，近扁球形，有光澤，民間常用來泡水喝，可以快速緩解和治療身體的某些不適感覺[4～5]。

過量飲酒會導(dǎo)致乙醇中毒而引發(fā)肝臟受到損傷[6～8]，乙醇進入人體后，大部分在肝臟中代謝，只有少量的乙醇通過胃腸道排出。大量滯留的乙醇代謝最終會造成人體的乙醛中毒現(xiàn)象，長期飲酒會導(dǎo)致酒精性肝病、肝硬化疾病的生成[9～10]。拐棗種子的臨床應(yīng)用主要針對大量飲酒后的癥狀如：頭暈，乏力，煩渴，嘔吐等現(xiàn)象[11]。有文獻報道：拐棗種子中的二氫楊梅素(Dihydromyricetin)(見圖1)是較為特殊的黃酮類化合物[12～13]，它具有解除醇中毒、預(yù)防酒精肝、抑制肝細胞惡化、降低血脂和血糖水平的作用；同時經(jīng)藥理實驗表明，二氫楊梅素對枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、大腸埃希菌、產(chǎn)氣桿菌、啤酒酵母、黏紅酵母、青霉、黑曲霉、黃曲霉、毛霉及根霉均有抑菌作用[14～16]。

圖1 二氫楊梅素的化學結(jié)構(gòu)式Fig.1 The chemical structure of dihydromyricetin

超聲輔助提取是近年來發(fā)展起來的新型提取技術(shù)，超聲波所獨具的物理特性能促使植物細胞組織破壁或變形，使有效成分提取更充分，提取速度快，能耗較低[17～18]。超聲輔助技術(shù)對拐棗種子二氫楊梅素的提取研究也未見報道。因此本文為首次創(chuàng)新，采用超聲法以二氫楊梅素得率為響應(yīng)因子對拐棗種子中的二氫楊梅素進行提取，并采用響應(yīng)面優(yōu)化單因素提取結(jié)果，為規(guī)?；a(chǎn)提供了重要的理論價值和研究意義。

1 材料和方法

1.1 實驗材料、試劑和儀器

拐棗種子采購于哈爾濱三棵樹中藥材市場，經(jīng)東北農(nóng)業(yè)大學食品學院江連洲教授鑒定后備用。原料預(yù)處理、清除機械雜質(zhì)(砂子草棍等)后，粉碎至250～850 μm范圍內(nèi)，含水率為10.3%，備用。色譜純甲醇購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；對照品二氫楊梅素購于上海安譜實驗科技股份有限公司；其他常規(guī)化學試劑為國產(chǎn)分析純。超純水采用(RX-UPT,上海和泰儀器有限公司)流動水凈化儀制得。

KJ-1340AL型臺式超聲波提取裝置(廣東深圳柯潔有限公司)，超聲浴槽尺寸360 mm×180 mm×235 mm；3K30型離心機(SIGMA公司)；美國Waters e 2695-2489高效液相色譜儀，Supelco Discovery C18色譜柱(尺寸：250 mm×4.6 mm,5 μm)。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料脫脂處理

取處理后的拐棗種子粉末100 g置于2 L三角瓶中，加入1 000 mL石油醚(沸程60～90℃)，180 W超聲脫脂，超聲時間1 h，濾出石油醚，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收石油醚，再將回收的石油醚(適當補加新石油醚)1 000 mL再于180 W功率超聲脫脂1 h，如此重復(fù)3次。得到的脫脂原料置于平盤通風櫥中自然放置過夜，徹底揮干石油醚，置于夾鏈袋中保存，作為進一步提取的實驗材料，回收的石油醚留做下次使用。

1.2.2 實驗條件1.2.2.1 高效液相色譜定量測定條件

采用高效液相色譜法定量測定二氫楊梅素。流動相為甲醇-0.02 moL·L-1硫酸二氫鉀，洗脫流速為1.0 mL·min-1，柱溫25℃，進樣體積10 μL。二氫楊梅素檢測波長為290 nm,運行時間為20 min。

1.2.2.2 標準曲線的繪制

分別精密稱取對照品二氫楊梅素2.5 mg置于25 mL容量瓶中，流動相溶解并定容，得每毫升含二氫楊梅素0.1 mg的對照品儲備液備用。分別精密吸取對照品儲備液0.5、1、2、4和6 mL，置于10 mL容量瓶中，流動相定容，配成不同濃度的對照品溶液。依次取10 μL上述對照品溶液進樣，每個濃度重復(fù)3次。按上述色譜條件測定，繪制標準曲線，計算回歸方程。二氫楊梅素在0.005～0.1 mg·mL-1之間呈良好的線性關(guān)系。其線性回歸方程為y=2 278 019x-610 490，R2=0.999 9。

1.2.2.3 樣品中二氫楊梅素的含量測定

提取液稀釋至適宜的檢測濃度后，過0.45 μm微孔濾膜，取濾出液進行HPLC檢測，每樣重復(fù)進樣3次，將峰面積取平均值，代入回歸方程，依式1計算二氫楊梅素的得率。

Y%=c×V/M

(1)

式中：Y為二氫楊梅素得率%；c為二氫楊梅素的濃度(mg·mL-1)；V為提取液體積(mL)；M為原料重量(g)。

1.2.3 影響提取效果的因素試驗1.2.3.1 單因素試驗

準確稱取0.5 g(絕干計)拐棗種子脫脂干燥粉末原料，置于100 mL錐形瓶中，于超聲波提取器中在多種條件下提取，以確定提取因素變化范圍以及各因素的適宜值。將每次提取液過0.45 μm微孔濾膜，通過公式計算二氫楊梅素得率。

1.2.3.2 工藝優(yōu)化實驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取A料液比，B超聲輻照功率，C超聲輻照時間共3個影響因子進行響應(yīng)面分析，考慮到實驗因素對得率的影響是曲線關(guān)系，故采用響應(yīng)面法尋找最佳工藝條件。根據(jù)響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計原理，以單因素試驗中最佳水平作為響應(yīng)面設(shè)計的0水平，設(shè)計試驗方案，取得試驗結(jié)果后，采用3因子3水平的響應(yīng)面分析法，得到二次回歸方程，并找出最佳工藝參數(shù)(見表1)。

表1 Box-Behnken設(shè)計因素編碼水平

Table 1 Levels of Plackett-Burman design extraction variables

代碼Code因素Factors水平Level-10+1A液料比Liquid-solid ratio(mL·g-1)152025B超聲輻照功率Ultrasound irradiation power(W)108144180C超聲輻照時間Ultrasound irradiation time(min)203040

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對提取效果的影響

因拐棗種子中二氫楊梅素易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑中，乙醇是毒性最低的有機溶劑，且對植物細胞壁有較強的穿透能力，對許多成分溶解性能好，所以本研究采用乙醇溶液為提取溶劑。不同體積分數(shù)的乙醇極性不同，對極性不同的物質(zhì)具有不同的得率。在保持其他條件不變(超聲輻照時間30 min，提取溫度40℃，超聲輻照功率為180 W，液料比20 mL·g-1)，改變提取溶劑乙醇的體積分數(shù)，拐棗種子中二氫楊梅素的提取得率如圖2。由圖2可以看出，二氫楊梅素的得率受乙醇體積分數(shù)的影響較大[19]。隨著乙醇體積分數(shù)的增加，二氫楊梅素得率逐漸增加，當乙醇體積分數(shù)達到60%時，二氫楊梅素得率達到最高。但隨著乙醇體積分數(shù)繼續(xù)增大，二氫楊梅素的得率反而略有降低。因此選擇乙醇體積分數(shù)為60%作為從拐棗種子中提取二氫楊梅素的溶劑。

圖2 乙醇體積分數(shù)的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on yield of dihydromyricetin

2.1.2 液料比對提取效果的影響

實驗中選擇合適的液料比可減少溶劑的浪費，也會使提取過程工序簡化，同時也減少溶劑回收帶來的麻煩。在保持其他條件不變(乙醇體積分數(shù)60%、提取溫度40℃、超聲輻照功率180 W和超聲輻照時間30 min)，改變液料比，拐棗種子中二氫楊梅素的得率見圖3。由圖3可以看出，得率隨液料比的增大而升高，超過20 mL·g-1后升高緩慢。確定提取的液料比范圍是15～25 mL·g-1。

圖3 液料比的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on yield of dihydromyricetin

圖4 乙醇體積分數(shù)的影響Fig.4 Effect of temperature on yield of dihydromyricetin

圖5 超聲輻照功率的影響Fig.5 Effect of ultrasound irradiation power on yield of dihydromyricetin

圖6 超聲輻照時間的影響Fig.6 Effect of ultrasound irradiation time on yield of dihydromyricetin

2.1.3 超聲溫度對提取率的影響

超聲提取溫度對提取會有影響，在保持其他條件不變(乙醇體積分數(shù)60%、液料比20 mL·g-1、超聲輻照功率180 W和超聲輻照時間30 min)，采用不同溫度(30、40、50和60℃)對拐棗中二氫楊梅素進行提取，結(jié)果如圖4所示：在實驗設(shè)定的溫度范圍(30～60℃)內(nèi)，二氫楊梅素的提取得率相差不大。比較而言，40℃的溫度可以滿足要求。

2.1.4 超聲輻照功率對提取效果的影響

圖5為乙醇體積分數(shù)60%，提取溫度40℃，液料比20 mL·g-1，超聲時間30 min的提取結(jié)果。在實驗過程中，我們把超聲輻照功率分別設(shè)置成72、108、144和180 W 4個輻照功率梯度。由圖5可知：隨著超聲輻照功率的增加，二氫楊梅素的得率逐漸增加，功率在180 W有最大得率。這是因為對于固定頻率的超聲波來說，功率增大，聲強隨著增大。單位時間內(nèi)超聲產(chǎn)生的空化事件增多，從而有利于得率的提高。但是不能無限制的增大超聲功率，功率過大，導(dǎo)致能耗過高，操作噪音增強。為了進一步明確超聲輻照功率對二氫楊梅素得率的影響，選取超聲輻照功率在108～180 W進行優(yōu)化設(shè)計。

2.1.5 超聲輻照時間對提取效果的影響

提取時間決定著生產(chǎn)周期的長短，決定著生產(chǎn)成本和能源的消耗，是生產(chǎn)工藝研究中一個十分重要的影響因素。當溶劑為60%濃度的乙醇、提取溫度40℃、超聲輻照功率180 W、液料比為20 mL·g-1的情況下，不同超聲輻照時間對二氫楊梅素得率的影響見圖6?？梢钥闯鲭S著超聲輻照時間的增加，二氫楊梅素得率逐漸增加，超過30 min后二氫楊梅素得率增加的趨勢有所降低。因此超聲輻照時間在20～40 min作為進一步考察范圍。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken響應(yīng)面分析法進行設(shè)計。實驗具體設(shè)置顯示在表2中，17個實驗中序號13～17為5個中心實驗，用以分析實驗誤差；其余12個為析因?qū)嶒?。以二氫楊梅素得?Y)為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合各影響因子與響應(yīng)值的回歸方程為：

Y=-3.50+1.37A+1.93×10-1B+6.33×10-1C-1.93×10-3AB-7.37×10-3AC-1.04×10-3BC-2.15×10-2A2-4.33×10-4B2-5.63×10-3C2

(1)

表2 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果

Table 2 Box-Behnken experimental design and results

序號No.A:液料比Liquid-solid ratio(mL·g-1)B:超聲輻照功率Ultrasound irradiation power(W)C:超聲輻照時間Ultrasound irradiation time(min)二氫楊梅素得率Yield of dihydromyricetin(mg·g-1)120108200.64220108401.37320180201.42420180400.66515144200.66615144401.36725144201.47825144400.69915108300.701015180301.211125108301.581225180300.701320144302.091420144302.181520144302.111620144302.181720144302.17

通過表3的方差分析結(jié)果可以看到二氫楊梅素得率回歸方程各變量對指標影響的顯著性。概率P值越小，表明相應(yīng)變量的顯著程度也越高。各因素中平方項A2、B2、C2，交互作用項AB、AC、BC對二氫楊梅素得率的影響均為極顯著(P<0.01)，A對二氫楊梅素得率的影響為顯著(P<0.05)，可見，所涉及的液料比、超聲輻照功率和時間因素對響應(yīng)值二氫楊梅素得率的影響不是簡單的線性關(guān)系，各因素對二氫楊梅素得率影響主要是二次方效應(yīng)和交互效應(yīng)。表3中回歸方程的P值小于0.000 1表明可以利用該模型對拐棗中二氫楊梅素提取效果進行分析。失擬項是用來評估方程可靠性的一個指標，方程分析結(jié)果顯示失擬項F值為6.09，不顯著，說明該回歸方程擬合的比較好，可以很好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系，利用該方程確定拐棗中二氫楊梅素的最佳提取條件[20]。由二次回歸模型得到每2個因素同時對響應(yīng)值的影響結(jié)果如圖7所示。由圖7可以看出，二氫楊梅素得率的響應(yīng)曲面均為開口向下的凸面，且凸面中心在考察區(qū)域之內(nèi)，表明在考察區(qū)域范圍內(nèi)存在響應(yīng)值的最大值。通過Design-expert統(tǒng)計軟件分析，得出拐棗種子中二氫楊梅素超聲輔助提取的最佳條件為：液料比20.42 mL·g-1，超聲輻照功率142.13 W，超聲輻照時間29.78 min，二氫楊梅素理論得率為2.15 mg·g-1。

表3 二氫楊梅素得率回歸方程方差分析

Table 3 Variance analysis of regression equation for dihydromyricetin

方差來源Source平方和Sum of squares自由度Degree of freedom均方Mean squareF值F-valueP值Prob>F顯著性SignificantModel5.9690.66123.62<0.0001**A0.0310.036.020.0439*B0.0110.012.170.1843C0.0010.000.330.5853AB0.4810.4889.73<0.0001**AC0.5410.54101.37<0.0001**BC0.5610.56104.01<0.0001**A21.2211.22227.91<0.0001**B21.3211.32247.09<0.0001**C21.3311.33248.84<0.0001**殘差Residual0.0470.01失擬合Lack of fit0.0330.016.090.0567純誤差Pure error0.0140.00總離差Cor total6.0016

注：*P<0.05；**P<0.01

2.3 最佳工藝條件驗證

據(jù)理論最佳條件，為方便操作，選取各條件臨近整數(shù)值，具體過程為：準確稱取拐棗種子粉末0.5 g，按照液料比20.5 mL·g-1加入體積分數(shù)為60%的乙醇溶液，超聲浴溫度40℃，超聲輻照功率140 W，超聲輻照提取30 min，提取液過濾，過0.45 μm微孔濾膜，HPLC測定并計算二氫楊梅素得率，重復(fù)試驗5次，數(shù)據(jù)取平均值，結(jié)果二氫楊梅素得率為2.14±0.09 mg·g-1，與理論預(yù)測值非常接近，誤差小于5%，說明該最佳工藝條件合理可行，在該工藝下，得率最佳。從而驗證了模型的正確性。

圖7 各因素對二氫楊梅素得率的響應(yīng)曲面圖Fig.7 Effects of different factors on the yield of dihydromyricetin

3 結(jié)論

本實驗采用超聲輔助提取法從拐棗種子中提取二氫楊梅素，通過單因素實驗探討了乙醇體積分數(shù)、液料比、提取溫度、超聲輻照功率和時間對提取工藝的影響進行了考察，采用響應(yīng)面法進行工藝優(yōu)化，得到了滿意的提取率[21]。得到的最優(yōu)工藝條件為：乙醇體積分數(shù)60%；提取溫度40℃；超聲輻照時間30 min；超聲輻照功率140 W，液料比20.5 mL·g-1。最佳工藝條件下拐棗種子中二氫楊梅素提取得率為2.14±0.09 mg·g-1，為實現(xiàn)拐棗資源高附加值的綜合加工利用奠定了基礎(chǔ)。