劉佳琦，宋逸欣，成星川，王 慶，金冬雪，姜 靜

(東北林業(yè)大學 林木遺傳育種國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

Golden2-like(GLK)轉(zhuǎn)錄因子，是一類植物中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，屬于GARP轉(zhuǎn)錄因子家族，GLK主要調(diào)控植物的葉綠體發(fā)育、影響果實品質(zhì)，同時也參與植物生物脅迫和非生物脅迫、植物衰老和激素信號轉(zhuǎn)導等[1-3]。研究證明，不同植物中GLK家族成員功能不盡相同，例如，擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtGLK1蛋白可以直接結(jié)合到一些天線蛋白和葉綠素合成酶等基因的啟動子上并促使其表達量在轉(zhuǎn)錄水平上提高[4]。有些植物的GLK成員則在不同組織中起作用，例如，玉米(ZeamaysL.)ZmGLK1和ZmGLK2基因分別特異性地在束鞘和葉肉細胞中起作用，調(diào)控束鞘和葉肉細胞中的二型葉綠體的發(fā)育[4]。番茄(Solanumlycopersicum)和辣椒(Capsicumfrutescens)的SlGLK1和CaGLK1主要在葉片中表達；SlGLK2和CaGLK2在果實中起重要作用[2，5]。有研究證明：SlGLK2基因能夠明顯增強番茄未成熟果實葉綠體的功能, 提高果實葉綠素的含量，從而通過過表達SlGLKs基因能夠在一定程度上提高番茄果實的可溶性固形物含量[6]。白樺(BetulaplatypHyllaSuk.)基因組中GLK成員僅有1個(BpGLK1)[7，8]。研究團隊已證明，白樺BpGLK1基因的缺失突變株及BpGLK1干擾表達轉(zhuǎn)基因株系均表現(xiàn)出葉片葉綠素含量降低，葉片呈現(xiàn)黃綠色[8，9]，將銀中楊(Populusalba×P.berolinensis)PaGLK1基因干擾表達后，轉(zhuǎn)基因株系同樣呈現(xiàn)亮黃綠葉色，上述研究證明，GLK基因是創(chuàng)制黃葉植物的首選基因。

白樺做為園林綠化的觀賞樹種，被廣泛應用于城市的道路、公園、庭院及小區(qū)綠化[10]。白樺BpGLK1干擾表達株系的葉色在春、夏、秋季節(jié)持續(xù)呈現(xiàn)醒目的亮黃綠色，提升了白樺的觀賞價值，其應用前景更加廣闊。然而，BpGLK1干擾表達株系葉片葉綠素含量的降低對其生長是否產(chǎn)生影響，目前尚未研究。為此，在獲批轉(zhuǎn)BpGLK1基因白樺中間試驗行政許可的基礎(chǔ)上(林技許準字[2017]12號)，本試驗以前期獲得的7個BpGLK1干擾表達株系、3個BpGLK1過表達株系為材料，測定了葉綠素相對含量與葉色的時序變異規(guī)律，分析了轉(zhuǎn)基因白樺的生長特性，旨在為后續(xù)轉(zhuǎn)BpGLK1白樺的生產(chǎn)性試驗提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：2年生的轉(zhuǎn)BpGLK1基因白樺(Betulaplatyphylla×B.pendula)，包括BpGLK1過表達株系(OE1、OE2、OE3)、BpGLK1干擾表達株系(RE1、RE2、RE3、RE4、RE5、RE6、RE7)、非轉(zhuǎn)基因野生型白樺(WT)，每個株系30株，種植于30 cm×20 cm花盆中，置于白樺育種基地。

主要質(zhì)粒載體：過表達載體p35S::GLK，干擾表達載體p35S::GLK-RNAi，由研究團隊保存。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)基因白樺的分子檢測BpGLK1過表達株系的PCR檢測：分別提取參試株系的總DNA，以其為模板，以p35S::GLK質(zhì)粒為陽性對照，以WT白樺的總DNA為陰性對照，進行BpGLK1基因的PCR擴增，引物分別為：BpGLK-F：5′-ATGCTTGCTGTGTCAGCTTTG-3′；BpGLK-R：5′-AAGCATAAGAGGGTGGTATTTTCC-3′。PCR反應體系及擴增程序參照文獻[11]，PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測。

BpGLK1干擾表達株系的PCR檢測：分別提取參試株系的總DNA，以其為模板，以p35S:: GLK-RNAi質(zhì)粒為陽性對照，以WT白樺的總DNA為陰性對照，采用引物RNAi_Cis-F：5′-CATGCCATGGGCACAGAAGGTTTGTGCAAG -3′；RNAi_Cis-R：5′-TTGGCGCGCCCCATACATCTGCCTTCTCTGG -3′，擴增靶基因的正向序列及部分載體序列，擴增片段長度為414 bp。采用引物RNAi_Anti-F：5′-GCTCTAGAGCACAGAAGGTTTGTGCAAG -3′；RNAi_Anti-R：5′-CGCGGATCCCCATACATCTGCCTTC TCTGG -3′，擴增靶基因的互補序列及部分載體序列，擴增片段長度為429 bp。PCR反應體系及擴增程序參照文獻[12]，PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測。

qRT-PCR檢測：分別提取參試株系的總RNA，經(jīng)DNaseI(RNase free)消化后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將其稀釋10倍后用作定量PCR的模板，上游引物為：5′-CACAACATAGCCAGCCACCTTC -3′，下游引物為：5′- GTCGGTGCTACCCAAGGACTC -3′。同時以18S rRNA為內(nèi)參基因，對BpGLK1基因進行qRT-PCR分析，PCR反應體系及擴增程序參照文獻[12]。

1.2.2 葉色調(diào)查 RHS比色：用RHS標準比色卡(英國皇家園藝學會)與參試株系葉片近軸面進行對比并記錄。

色差儀比色：采用分光色差儀(KONICA MINOLTA CR-400)測定參試株系葉片的中部，每個株系測定30個不同單株，每株1個葉片，取其平均值。測定于5月15日開始，9月1日結(jié)束，每15 d測定1次，每次每個株系測定3株樹葉片。測量結(jié)果用CIELAB表色系統(tǒng)進行色度分析[13]，其中，L*代表從黑色到白色中間的位置，即明亮度(Lumination)，范圍是 0～100；a*代表紅(+a)綠(-a)色軸飽和度；b*代表黃(+b)藍(-b)色軸飽和度。

1.2.3 葉片葉綠素含量的測定 采用便攜式葉綠素測定儀(SPAD-502 PLUS，KONICA MINOLTA)測定參試11個株系健康的第5葉片的SPAD值，測定于5月15日開始，9月1日結(jié)束，每15 d測定1次，每次每個株系測定30株樹葉片。

1.2.4 生長性狀調(diào)查 用米尺測量參試株系苗高，于5月15日開始，9月1日結(jié)束，每15 d調(diào)查1次，共調(diào)查8次(以1月1日為生長起始日，則5月15日為第136天，即最后調(diào)查的日期9月1日為第241天)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 利用MATLAB Compiler Runtime 8.3對苗高的生長規(guī)律進行Logistic方程擬合[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)BpGLK1基因白樺的分子檢測

分別以BpGLK1過表達株系葉片的總DNA為模板，用BpGLK1基因ORF兩端序列為引物進行PCR擴增，結(jié)果顯示：陽性質(zhì)粒及3個過表達株系在1200 bp處擴增出單一譜帶，與BpGLK1基因序列1284 bp長度吻合；而WT株系未見擴增譜帶(圖1)。

分別以BpGLK1干擾表達株系葉片的總DNA為模板， PCR 擴增BpGLK1靶基因的正向序列及互補序列，結(jié)果顯示：7個干擾表達株系插入的靶基因正向序列及反向互補序列均有擴增譜帶，且分別與預期的414 bp及429 bp長度吻合(圖2)，PCR 擴增結(jié)果證明，目標基因仍然整合于2年生的轉(zhuǎn)基因株系基因組中。

M.DL2000(2 kb、1 kb、0.75 kb、0.50 kb、0.20 kb、0.10 kb)；1.陽性質(zhì)粒；2.WT；3.去離子水；4～6.OE1、OE2、OE3株系 。

a.引物為RNAi_Cis-F、RNAi_Cis-R；1.陽性質(zhì)粒；2.WT；3.去離子水；4～10.干擾表達株系。b.引物為RNAi_Anti-F、RNAi_Anti-R；1.陽性質(zhì)粒；2.WT；3. 去離子水；4～10.干擾表達株系。M.DL2000(2 kb、1 kb、0.75 kb、0.50 kb、0.20 kb、0.10 kb)。

分別對參試株系進行qRT-PCR檢測，結(jié)果顯示：與WT株系比較，BpGLK1表達量在3個過表達株系中均呈現(xiàn)上調(diào)表達，差異達到顯著水平(P<0.01)，其中，OE1株系的BpGLK1相對表達量最高；BpGLK1在7個干擾表達株系中均顯著下調(diào)表達，其中RE5株系的BpGLK1相對表達量最低，較WT株系低77.96%，而RE4株系的BpGLK1下調(diào)幅度最小，僅較WT株系低36.09%(圖3)。

圖3 轉(zhuǎn)基因白樺BpGLK1基因的相對表達量

2.2 轉(zhuǎn)BpGLK1白樺葉色變異

RHS比色卡測定結(jié)果顯示，BpGLK1過表達株系(OE)在5月15日至9月1日植物生長發(fā)育季節(jié)，葉色以中度橄欖綠或灰色橄欖綠為主；而BpGLK1干擾表達株系(RE4例外)葉色在濃黃綠色和淡黃綠色之間變化；野生型白樺(WT)在6月前期葉色為中度橄欖綠，此后葉色呈現(xiàn)中度黃綠色(圖4)。

在CIELAB顏色系統(tǒng)中，L*值是衡量葉色明暗程度的指標，該值越大表明葉片亮度越高；而黃藍屬性b*值由小變大，則表示藍色的減退、黃色的增加。采用分光色差儀測定葉片，結(jié)果顯示，在生長季的不同發(fā)育時期葉片L*值及b*值在株系間均差異顯著(P<0.05)，多數(shù)干擾表達株系(RE4例外)的L*值顯著高于過表達株系及WT株系，其中RE1、RE7株系的L*值在各時期均居前2位(表1)；同樣，葉片的b*值也呈現(xiàn)干擾表達株系顯著高于過表達株系及WT株系(RE4例外)(表2)，其中RE1、RE7株系的b*值在各時期均顯著高于其他株系。從L*值及b*值的時序變化發(fā)現(xiàn)，各株系葉片亮度(L*值)及黃色程度(b*值)在7月1日達到高峰?？傊?，BpGLK1干擾表達株系由于BpGLK1基因的低量表達，能夠不同程度地提高葉色亮度及黃色程度。

a：BpGLK1過表達株系葉色比較。WT.中度黃綠(RHS 138A)；OE.灰橄欖綠(RHS NN137C)。b：BpGLK1干擾表達株系葉色比較：WT.中度黃綠(RHS 138A)；RE1、RE2、RE5、RE6、RE7濃黃綠(RHS 143C)；RE3濃黃綠(RHS 143B)；RE4中度黃綠(RHS 138A)。

表1 不同發(fā)育時期各參試株系葉片L*值多重比較

表2 不同發(fā)育時期各參試株系葉片b*值多重比較

2.3 轉(zhuǎn)BpGLK1基因白樺葉綠素相對含量的時序變化

轉(zhuǎn)基因株系葉綠素相對含量(SPAD值)測定顯示，各株系在生長發(fā)育的不同時期葉片葉綠素SPAD值差異顯著(P<0.05)，在各時期均以BpGLK1過表達株系葉綠素相對含量最高，而BpGLK1干擾表達株系葉綠素相對含量較低(圖5)。各株系SPAD值的時序變化趨勢表現(xiàn)為7月1日最低，隨后3個過表達株系顯著高于WT株系，而干擾表達株系(RE4例外)均低于或顯著低于WT株系。

圖5 參試株系葉片SPAD值時序變化

2.4 轉(zhuǎn)BpGLK1基因白樺生長變異分析

2.4.1 苗高生長模型建立與擬合 用Logistic模型對11個株系共233個單株苗高生長進行擬合，其生長曲線的擬合度R2均在0.98以上，說明用該模型能夠準確模擬參試株系生長曲線，可對參試株系的苗高生長進行分析與預測。

由表3可知，BpGLK1抑制表達株系和過表達株系的苗高(即停止生長后的實測值)均顯著高于WT株系(RE1、RE6例外)，其中OE3株系最高，為187.29 cm；其次為RE5株系，為167.13 cm；RE4株系的苗高峰值出現(xiàn)最早，t0= 157.46 d，較WT株系及其他參試株系(RE2例外)提前10 d左右；苗高速生點處的生長速度較高為RE1、RE4及OE2，平均為2.15 cm/d，顯著高于WT株系及RE3、RE6、RE7，但與其他株系差異不顯著(表3)。

表3 參試株系苗高的Logistic模型

2.4.2 轉(zhuǎn)BpGLK1基因白樺速生期生長參數(shù)變異 由表4可知，苗木速生期始期最早的是RE4株系(t1=136.33 d)，該株系的速生期結(jié)束期也最早。速生期持續(xù)時間較長的株系為OE3和RE2，分別為60.88、58.50 d；在速生期內(nèi)苗高平均生長量(GR)高于群體均值的株系為OE1、OE2、OE3、RE1、RE2、RE4和RE5，這些株系在速生期內(nèi)苗高日生長量(GD)在1.5 cm/d以上，其中RE4最高，苗高日生長量達1.9330 cm/d(表4)。參試株系在速生期內(nèi)的生長量占整個生物量的56%～58%，說明速生期內(nèi)苗高生長在其整個生長期中起重要作用。

表4 參試株系速生期生長參數(shù)比較

3 結(jié)論與討論

GLK轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥、水稻(OryzasativaL.)、辣椒和番茄等植物中研究證明，GLK基因家族成員通過協(xié)調(diào)光合器官的表達從而調(diào)控植物葉綠體發(fā)育，對葉綠體發(fā)育至關(guān)重要，擬南芥AtGLK1和AtGLK2雙突變體葉片表現(xiàn)為葉綠素含量降低，呈現(xiàn)黃色[4]；在番茄中SIGLK1抑制表達株系葉色呈現(xiàn)黃綠色，其葉綠素含量較對照株系降低[4]。本研究團隊獲得的白樺轉(zhuǎn)BpGLK1基因研究也證實了前人的研究結(jié)果，轉(zhuǎn)基因白樺移栽當年葉色及光合色素測定發(fā)現(xiàn)，與野生型白樺比較，BpGLK1過表達株系表現(xiàn)為葉片綠色加深，葉綠素含量略高；而BpGLK1抑制表達株系(RE4例外)則葉色呈現(xiàn)黃綠色，葉綠素含量減少[14]。本試驗是在團隊研究基礎(chǔ)上，對移栽2年的轉(zhuǎn)BpGLK1白樺追蹤調(diào)查，PCR及qRT-PCR檢測表明，目標基因仍穩(wěn)定整合于轉(zhuǎn)基因白樺基因組中，并在mRNA水平上正常表達(圖3)。葉色及葉綠素相對含量分析發(fā)現(xiàn)，與苗期呈現(xiàn)的規(guī)律一致，BpGLK1過表達株系的葉綠素含量較高，則葉片綠色程度也高，反之，BpGLK1干擾表達株系(RE4例外)的葉綠素含量較低，則葉色為黃綠色(圖4)。通過連續(xù)2年的觀測發(fā)現(xiàn)，RE4株系雖然是BpGLK1干擾表達株系，但其葉片葉綠素相對含量與WT差異不顯著，葉色仍然為綠色，BpGLK1基因在葉片中的相對表達量下調(diào)程度較低。連續(xù)2年的qRT-PCR檢測顯示，該株系的BpGLK1的相對表達量在1年生時較WT株系低41.00%，在2年生時較WT株系低36.09%，而其他6個干擾表達株系BpGLK1的表達量均較WT株系低54.16%以上(圖3)。眾所周知，轉(zhuǎn)基因植物外源基因的插入通常是隨機的，T-DNA插入位點不同，可能導致目標基因表達程度不盡相同，我們推測由于RE4株系BpGLK1基因表達下調(diào)幅度小于其他轉(zhuǎn)基因株系，因此，其葉綠素相對含量與WT差異不顯著，葉色呈現(xiàn)綠色。后續(xù)將通過T-DNA插入位點的鑒定及側(cè)翼序列分析探究影響RE4株系葉色的因素。

對于多年生的木本植物，在獲得轉(zhuǎn)基因株系后往往需要經(jīng)過多年的選擇，只有既表現(xiàn)出導入目標基因性狀，其生長及產(chǎn)量又不受影響的轉(zhuǎn)基因株系才能成為應用推廣的轉(zhuǎn)基因新品種[15，16]。對2年生轉(zhuǎn)BpGLK1白樺干擾表達株系葉色及生長分析，初步選擇RE1、 RE7株系為優(yōu)良株系，這2個株系在葉片亮度及黃色程度方面均優(yōu)于其他株系，其中RE7株系已獲批植物新品種權(quán)(20190378)，可作為城鄉(xiāng)綠化彩葉樹種，豐富東北地區(qū)的園林綠化樹種組成。

研究發(fā)現(xiàn)，植物高葉綠素含量并不是高光合速率的必需條件。高葉綠素含量會加劇植物個體之間競爭,不利于群體的光合作用[17,18]。例如，水稻低葉綠素突變體研究發(fā)現(xiàn)，在高光強條件下，適當降低葉綠素含量，有利于緩解因過量光吸收而導致的活性氧的產(chǎn)生以及對光系統(tǒng)的破壞，緩解光抑制，提高光系統(tǒng)Ⅱ光電轉(zhuǎn)化效率與光合電子傳遞效率，進而可以提高水稻的光合能力[19]。此外，有研究表明，番茄葉色黃化突變體與正常植株在生長勢上沒有顯著差異，且果實產(chǎn)量與普通品種差異不顯著，突變體果實內(nèi)色素含量低于正常品種，耐貯性和硬度都優(yōu)于正常品種[20，21]。陸地棉(GossypiumhirsutumL.)黃綠苗突變體浙12-12N幼苗期真葉葉綠素含量低于常綠苗泗棉2號, 其各葉位葉片的水分利用率、光能利用率及凈光合速率卻高于泗棉2號，子棉產(chǎn)量和皮棉產(chǎn)量也要高于常綠苗泗棉2號[22]。上述研究證明，適當?shù)亟档腿~綠素含量，可以增強植物的光合能力，提高作物產(chǎn)量及品質(zhì)。

轉(zhuǎn)BpGLK1白樺苗高生長調(diào)查顯示，移栽當年苗高生長與WT株系差異不顯著[14]；而在2年生時，無論是BpGLK1過表達株系，還是干擾表達株系，其苗高生長均顯著高于WT株系(RE1、RE6例外)，在速生期內(nèi)苗高平均生長量(GR)高于群體均值的株系為OE1、OE3、RE1、RE2、RE4和RE5，其中RE4苗高日生長量高達1.9330 cm/d。試驗表明，BpGLK1干擾表達株系的葉片葉綠素含量降低，并未影響干擾表達株系的高生長。白樺與上述作物同樣，適當降低葉片葉綠素含量可有效促進白樺苗期株高生長。白樺為多年生高大喬木，我們后續(xù)還需追蹤調(diào)查其生長特性，探討轉(zhuǎn)BpGLK1基因白樺的吸收光能分配特性、葉綠體熒光參數(shù)及光合作用速率等變化。