劉明 楊曉崗 馬波 陳麗

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是50歲以上人群視力喪失的重要原因，已成為全球失明的主要原因之一，因此，AMD的防治具有舉足輕重的意義[1]。目前認(rèn)為，AMD的發(fā)病機(jī)制是由于氧化應(yīng)激、細(xì)胞老化、炎癥等因素綜合作用所致的，而氧化應(yīng)激可能是各種因素的共同作用機(jī)制[2]。視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞是位于視網(wǎng)膜最外層的單細(xì)胞層，在AMD的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，是其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)[3]。有研究證明，鐵代謝異常與AMD的發(fā)病密切相關(guān)[4]。而在肝臟中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)-6可調(diào)節(jié)鐵調(diào)素進(jìn)而維持鐵的平衡[5]。這些研究均提示，BMP-6可能與AMD的發(fā)病有關(guān)，在保護(hù)RPE細(xì)胞方面可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。此外，我們既往研究發(fā)現(xiàn)，H2O2可引起RPE細(xì)胞鐵調(diào)素水平的下降[6]，而BMP-6是調(diào)節(jié)鐵調(diào)素的關(guān)鍵因子[5]。因此，本研究利用細(xì)胞培養(yǎng)和分子生物學(xué)等技術(shù)，在細(xì)胞層面觀察氧化應(yīng)激對(duì)RPE細(xì)胞的損傷作用和對(duì)BMP-6及其相關(guān)受體的影響，探討RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的分子機(jī)制，為AMD的防治尋找新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及分組RPE細(xì)胞(美國ATCC公司)，常規(guī)培養(yǎng)，隨機(jī)分為對(duì)照組、H2O2組、實(shí)驗(yàn)組。其中對(duì)照組RPE細(xì)胞正常培養(yǎng)；H2O2組RPE細(xì)胞加入200 μmol·L-1H2O2培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組RPE細(xì)胞先加入0.1 ng·L-1BMP-6培養(yǎng)1 h后，再加入200 μmol·L-1H2O2繼續(xù)培養(yǎng)。

1.1.2 試劑與儀器DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)；胎牛血清(Hyclone，美國)；過氧化氫(滬試貨號(hào)10011208)；BMP-6(PeproTech，美國)；流式細(xì)胞儀(型號(hào)CytoFLEX，BECKMAN，美國)；酶標(biāo)儀(Thermo，美國)；細(xì)胞凋亡試劑盒(上海翊圣，中國)；活性氧(reactive oxygen species,ROS)試劑盒、DAPI(碧云天，中國)；PCR儀(ABI，美國)；兔多抗GAPDH(杭州賢至，中國)；鼠多抗BMP、兔多抗BMPR1A、兔多抗BMPR1B、兔多抗尤文素(Hemojuvelin，HJV)(Affinity,美國)；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(武漢博士德，中國)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)RPE細(xì)胞常規(guī)DMEM/F12培養(yǎng)，次日貼壁生長(zhǎng)后更換為無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按每孔5×105個(gè)細(xì)胞接入6孔板，在含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的飽和濕度條件下，37 ℃培養(yǎng)細(xì)胞密度至70%。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處理各組細(xì)胞。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)RPE細(xì)胞ROSH2O2組RPE細(xì)胞加入200 μmol·L-1H2O2處理12 h后，將對(duì)照組與H2O2組用不含EDTA的2.5 g·L-1胰蛋白酶消化細(xì)胞，終止消化后EP管收集，1200 r·min-1離心3 min，去上清，加PBS重懸，用PBS將細(xì)胞潤(rùn)洗2次后1200 r·min-1離心3 min，按照DCFH-DA細(xì)胞ROS檢測(cè)試劑盒操作說明，去PBS，用無血清培養(yǎng)基11000稀釋DCFH-DA，每管加入1 mL，對(duì)照加不含DCFH-DA的無血清培養(yǎng)基；37 ℃培養(yǎng)箱孵育20 min，每隔3 min混勻一次；用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次；流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)BMP-6及相關(guān)受體mRNA按照RNA提取試劑盒說明書，用Trizol法提取對(duì)照組和H2O2組mRNA，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；按逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，反應(yīng)條件25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；再按實(shí)時(shí)熒光定量 PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)。 BMP-6和GAPDH引物序：GAPDH上游引物為5’-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3’，下游引物為5’-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3’；BMPR1A上游引物為5’-GGAGATGGCTCGTCGTTGTA-3’，下游引物為5’-AGTCTGGAGGCTGGATTGTG-3’；BMPR1B上游引物為5’-CCACCACCCTAGACGCTAAA-3’，下游引物為5’-TGCCAACTCGAGTGTTAGGT-3’；HJV上游引物為5’-GATCCCAACTTTACCGTGGC-3’，下游引物為5’-CCACAGAACAAAGAGCCCAG-3’，繪制溶解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進(jìn)行分析。

1.2.4 TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡H2O2組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，與對(duì)照組一起進(jìn)行離心收集細(xì)胞，PBS清洗1次，重懸，加載在鋪好的多聚賴氨酸載玻片上，自然干燥，在40 g·L-1多聚甲醛室溫中固定30 min，PBS清洗3遍，每次5 min；將爬好細(xì)胞的玻片浸入40 g·L-1的多聚甲醛(pH 7.4)溶液中室溫固定25 min，隨后用PBS洗滌3次，每次5 min；將細(xì)胞爬片浸入用PBS配制的體積分?jǐn)?shù)0.1% TritonX-100溶液中10 min(冰上操作)，隨后用PBS洗滌2次，每次5 min；用PBS溶液潤(rùn)洗樣本，輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體，處理后的樣本放在濕盒中以保持樣本濕潤(rùn)；按15的比例用去離子水稀釋5×Equilibration Buffer，每個(gè)樣本滴加100 μL 1×Equilibration Buffer使其全部覆蓋待檢樣本區(qū)域，室溫孵育10～30 min，或者將載玻片放入一個(gè)含有1×Equilibration Buffer的缸中，保證緩沖液沒過樣本，在平衡細(xì)胞的同時(shí)在冰上解凍Alexa Fluor 647-12-dUTP Labeling Mix；在平衡后的區(qū)域周圍用吸水紙洗掉100 μL 1×Equilibration Buffer中的大部分，然后在組織上加入TdT孵育緩沖液；把塑料蓋玻片蓋在組織上以保證試劑平均分布，在濕盒的底部放上用水浸濕的紙巾，將載玻片置于濕盒內(nèi)，37 ℃孵育60 min；將濕盒用鋁箔紙包裹以避光；然后用PBS洗滌3次，每次5 min ；復(fù)染核：滴加DAPI避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，PBST 5 min×4次洗去多余DAPI；用吸水紙擦干切片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.5 Weatern blot檢測(cè)BMP-6及其受體蛋白水平表達(dá)應(yīng)用組織裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，按照BCA蛋白定量試劑盒通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的蛋白濃度，對(duì)照組、H2O2組、實(shí)驗(yàn)組蛋白均取等量(30 μg)，加入上樣緩沖液，97 ℃加熱6 min變性，冷卻后取樣，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，采用電轉(zhuǎn)儀將蛋白從分離膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將PVDF膜放入封閉液(TBST+50 g· L-1脫脂奶粉)中，室溫封閉30 min。加入一抗(BMP-6、BMPR1A、BMPR1B及HJV的單克隆抗體)并用封閉液稀釋，室溫孵育過夜。用1×TBST漂洗5～6次，每次5 min。加入適當(dāng)比例稀釋的二抗，室溫孵育2 h。 用1×TBST漂洗5～6次,每次5 min。ECL試劑盒化學(xué)熒光法顯色，用BandScan分析膠片灰度值對(duì)Western blot結(jié)果作半定量分析。三組Western blot法測(cè)定均實(shí)施了3次，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有結(jié)果均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，整體比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析，組間比較如具有方差齊性采用LSD法，如不具有方差齊性則采用Tamhane法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 H2O2對(duì)RPE細(xì)胞ROS的影響對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)ROS水平為(70.55±7.71)%，H2O2組細(xì)胞內(nèi)ROS水平為(99.25±0.28)%，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)照組和H2O2組ROS水平

2.2 H2O2對(duì)RPE細(xì)胞內(nèi)BMP-6的影響H2O2組內(nèi)BMP-6 mRNA水平(0.27±0.05)%相對(duì)于對(duì)照組(0.95±0.06)%為(0.25±0.12)%，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在蛋白水平上，H2O2組(0.18±0.05)相對(duì)于對(duì)照組(0.54±0.07) BMP-6的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見圖2。

2.3 BMP-6對(duì)H2O2環(huán)境下RPE細(xì)胞的影響TUNEL染色結(jié)果顯示，對(duì)照組的染色陽性細(xì)胞數(shù)比例為(8.25±1.06)%，H2O2組為(51.22±8.51)%，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組的染色陽性細(xì)胞數(shù)為(27.63±5.37)%，與H2O2組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

2.4 H2O2對(duì)BMP受體mRNA及蛋白水平的影響Weatern blot檢測(cè)結(jié)果顯示，H2O2組BMP的BMPR1A、BMPR1B及HJV受體水平均低于實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組各受體水平與對(duì)照組和H2O2組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。見圖4。

圖2 H2O2對(duì)RPE細(xì)胞中BMP-6 mRNA及蛋白水平的影響 與對(duì)照組比較，*P

圖3 TUNEL檢測(cè)各組RPE細(xì)胞凋亡率(×400;紅色為凋亡細(xì)胞，藍(lán)色為細(xì)胞核) 與對(duì)照組比較，*P2O2組比較，#P

圖4 H2O2對(duì)BMP-6相關(guān)受體mRNA及蛋白水平的影響 A:氧化應(yīng)激對(duì)受體mRNA水平的影響；B:Western blot檢測(cè)結(jié)果圖；C:氧化應(yīng)激對(duì)受體蛋白水平的影響。與對(duì)照組比較，*P2O2組比較，#P

3 討論

ROS是反映細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的直接指標(biāo)，ROS增多可導(dǎo)致脂質(zhì)氧化、蛋白質(zhì)破碎、交聯(lián)與聚集，同時(shí)還可導(dǎo)致DNA堿基氧化，進(jìn)一步啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[7]。人RPE細(xì)胞暴露于煙霧環(huán)境中可產(chǎn)生大量ROS，同時(shí)抗氧化劑水平下降，導(dǎo)致線粒體功能損害，最后引起RPE細(xì)胞凋亡[8]。我們研究發(fā)現(xiàn)，H2O2可以顯著提高RPE細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，起到促進(jìn)氧化應(yīng)激損傷的作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可以影響鐵調(diào)素的水平[9]，而在肝臟中，BMP-6已被證實(shí)是鐵調(diào)素的主要調(diào)節(jié)因子[10]。我們擬進(jìn)一步觀察氧化應(yīng)激是否可以影響B(tài)MP-6的水平，結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組，H2O2組BMP-6 mRNA水平及蛋白水平均明顯降低，證實(shí)了氧化應(yīng)激可以通過抑制BMP-6起到氧化損傷的作用。

盡管BMP信號(hào)通路在動(dòng)物胚胎發(fā)育、組織分化和細(xì)胞增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]，但有關(guān)BMP信號(hào)通路在AMD發(fā)病中扮演的角色還有待闡明。我們運(yùn)用TUNEL染色法觀察BMP-6預(yù)處理后再添加H2O2處理后細(xì)胞凋亡的變化，結(jié)果顯示，BMP-6可以保護(hù)RPE細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷，顯著降低氧化應(yīng)激導(dǎo)致的RPE細(xì)胞的凋亡。

BMPs可以激活Smad依賴的和多個(gè)Smad非依賴的信號(hào)通路，直接影響下游基因的轉(zhuǎn)錄，它們通過與細(xì)胞表面受體結(jié)合并形成由兩種I型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體組成的異四聚體復(fù)合物來啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[12]。 12種BMP有五種已知的BMPI型受體:激活素受體樣激酶1(ACVRL1或ALK1)；1A型激活素受體(ActR-1A或ALK2)；BMP受體1A型(BMPR1A，也稱ALK3 )；活化素受體1B型(ACVR1B或ALK-4)和BMP受體1B型(BMPR-1B或ALK-6)[13]。HJV是一種BMP共受體，在青少年血色素沉著癥中被破壞時(shí)，會(huì)導(dǎo)致鐵調(diào)素嚴(yán)重缺乏和組織鐵過表達(dá)[14]。HJV選擇性結(jié)合 BMP受體，作為BMP的共受體可以激活 BMP/Smad 信號(hào)通路和鐵調(diào)素的表達(dá)[15]。BMP6-HJV-BMP受體復(fù)合物啟動(dòng)磷酸化信號(hào)級(jí)聯(lián)，Smad1/5/8 被磷酸化并與 Smad4 結(jié)合，形成 Smad 復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，從而激活鐵調(diào)素的轉(zhuǎn)錄。最新研究表明，肝細(xì)胞核因子4α通過滅活肝癌細(xì)胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白途徑，特別是通過BMP1A起到抑制Hepcidin的作用[16]。Castoldi等[17]發(fā)現(xiàn)，通過抑制miR-122可增加BMPR1A及HJV等控制全身鐵水平的基因。氧化應(yīng)激可下調(diào)BMP-6，而添加BMP-6可減輕氧化應(yīng)激所致的細(xì)胞凋亡，因此，我們擬進(jìn)一步觀察氧化應(yīng)激是通過何種與鐵調(diào)控相關(guān)的BMP受體起到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。熒光定量PCR結(jié)果顯示，H2O2可抑制BMP受體的活性(BMP1A受體、BMPR1B受體及HJV受體)，而添加了BMP-6后可對(duì)抗氧化應(yīng)激對(duì)其相關(guān)受體的抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可對(duì)RPE細(xì)胞起到氧化損傷作用，氧化應(yīng)激可以下調(diào)BMP-6的水平促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而BMP-6預(yù)處理RPE細(xì)胞則可以對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷；進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可以抑制BMPR1、BMPR1B及HJV受體，而BMP-6則可以對(duì)抗這種抑制作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了BMP-6在氧化應(yīng)激損傷RPE細(xì)胞中的作用。但我們實(shí)驗(yàn)僅初步探索了氧化應(yīng)激對(duì)RPE細(xì)胞造成損傷的機(jī)制以及BMP-6對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷的結(jié)果。氧化應(yīng)激損傷RPE細(xì)胞的具體分子機(jī)制以及BMP-6對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷的作用仍需進(jìn)一步的研究。