于童 張勁松

白內(nèi)障是一種常見的致盲性眼病，發(fā)病率不斷上升，目前手術(shù)是其唯一有效的治療方法。白內(nèi)障超聲乳化吸出術(shù)雖然能在很大程度上改善患者的視覺質(zhì)量，但是術(shù)中殘留的人晶狀體上皮細胞(human lens epithelial cells，HLECs)在白內(nèi)障術(shù)后發(fā)生的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)會導(dǎo)致后發(fā)性白內(nèi)障發(fā)生。YAG激光后囊切開術(shù)雖可對后發(fā)性白內(nèi)障進行有效的治療，但其導(dǎo)致的多種并發(fā)癥如眼內(nèi)炎、視網(wǎng)膜脫離、人工晶狀體(intraocular lens，IOL)偏位等影響患者的生活質(zhì)量[1]。1982年Greenburg等[2]通過將LECs在膠原凝膠中培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，上皮細胞具有間質(zhì)細胞的形態(tài)，由此提出了EMT的概念，其在胚胎發(fā)育、多種纖維化疾病及癌癥轉(zhuǎn)移中均起重要作用。在EMT的過程中，原本緊密相連的上皮細胞的細胞間黏附分子，如E-鈣黏蛋白(E-Cadherin)的表達減少，喪失了與基底膜的連接并逐漸失去上皮細胞表型，而間質(zhì)細胞遷移與侵襲能力增強，同時波形蛋白(Vimentin)表達增加,從而逐漸獲得間充質(zhì)特征。轉(zhuǎn)化生長因子β2(transforming growth factor β2，TGF-β2)可以成功誘導(dǎo)LECs發(fā)生EMT，且經(jīng)過TGF-β2處理的LECs可以作為EMT的細胞模型[3]。線粒體融合蛋白基因2(mitofusin 2，Mfn2)是存在于線粒體外膜上高度保守的GTP酶，是參與線粒體外膜融合的重要蛋白之一，并與細胞及細胞器多種生物學(xué)功能密切相關(guān)，它除了參與調(diào)控線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)外，還與細胞代謝、增殖、凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬等有關(guān)[4]。有關(guān)Mfn2與LECs發(fā)生EMT的關(guān)系的報道尚少。本研究通過分別檢測TGF-β2作用下HLECs內(nèi)Mfn2的表達差異和Mfn2過表達對HLECs的影響，來探討Mfn2對TGF-β2誘導(dǎo)的LECs發(fā)生EMT的作用。

1 材料與方法

1.1 材料HLECs細胞系(SRA01/04)由中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科晶狀體實驗室提供；人TGF-β2(Human TGF-β2-Mammalian)、山羊抗兔二抗(美國PeproTech公司)；pEGFP-Mfn2質(zhì)粒合成(武漢金開瑞生物工程有限公司合成)；RNAiso(美國Invitrogen公司)；PrimerScriptTMRT 5酶混合液、SYBRPremix Ex Taq II(日本Takara公司)；兔抗人Mfn2、Vimentin、E-Cadherin抗體(英國Abcam公司)；ABI 7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法將TGF-β2作用24 h的HLECs作為TGF-β2處理組，轉(zhuǎn)染pEGFP-Mfn2的HLECs作為轉(zhuǎn)染組，自然生長不做處理的HLECs作為對照組。

1.2.1 細胞培養(yǎng)和處理將凍存的HLECs SRA01/04復(fù)蘇后接種于含體積分數(shù)10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的培養(yǎng)基中，置37 ℃、含體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長到90%融合時用含2.5 g·L-1EDTA的胰蛋白酶消化傳代。傳代三次以上后取同代且生長狀態(tài)良好的細胞進行實驗。分別用濃度為10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1的TGF-β2作用于HLECs 24 h作為TGF-β2處理組，用于后續(xù)實驗。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測RNAiso plus試劑提取細胞內(nèi)總RNA，Nano drop檢測RNA濃度。利用RT 5酶混合液反轉(zhuǎn)錄獲得cDNAs，以GAPDH作為內(nèi)參。Mfn2引物序列:上游引物:5’-TCAGAGCCCGAGTACATGGA-3’，下游引物:5’-CGTTGAGCACCTCCTTAGCA-3’；E-Cadherin引物序列:上游引物:5’-GAAAGCGGCTGATACTGACC-3’，下游引物:5’-CGTACATGTCAGCCGCTTC-3’；Vimentin引物序列:上游引物:5’-GAGAACTTTGCCGTTGAAGC-3’，下游引物:5’-TCCAGCAGCTTCCTGTAGGT-3’；GAPDH引物序列:上游引物：5’-CGGATTTGGTCGTATTGGG-3’，下游引物：5’-TGCTGGAAGATGGTGATGGGATT-3’，反應(yīng)體系20 μL。采用ABI 7500進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，經(jīng)過3次獨立實驗，采用 2-ΔΔCt法定量分析TGF-β2處理組、轉(zhuǎn)染組、對照組的Mfn2、E-cadherin和Vimentin的mRNA相對表達量，Graphpad prism 5作圖并進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前1 d將HLECs按后續(xù)實驗需要分別接種于6孔板和24孔板，并分為轉(zhuǎn)染組和對照組。6孔板細胞鋪板于2 mL含血清、不含抗生素的培養(yǎng)基中；24孔板細胞鋪板于500 μL含血清、不含抗生素的培養(yǎng)基中。細胞達到50%融合時，6孔板轉(zhuǎn)染組每孔加入10 μL Lipofectamine2000和4 μg pEGFP-Mfn2進行轉(zhuǎn)染；24孔板轉(zhuǎn)染組每孔加入2 μL Lipofectamine2000和0.8 μg pEGFP-Mfn2進行轉(zhuǎn)染。6 h后，更換為含有血清的全培養(yǎng)基，在37 ℃、含體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h后檢測轉(zhuǎn)染水平進行后續(xù)實驗。

1.2.4 免疫熒光細胞化學(xué)檢測實驗前將細胞鋪板爬片并進行所需處理，實驗第1天在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的玻片用PBS清洗后，用40 g·L-1多聚甲醛固定15 min。體積分數(shù)0.5%TritonX-100室溫通透20 min，再用PBS清洗3次，滴加山羊血清封閉30 min。滴加稀釋好的兔抗人一抗4 ℃孵育過夜。實驗第2天滴加稀釋好的熒光山羊抗兔二抗，避光20～37 ℃孵育1 h。滴加DAPI避光孵育5 min，PBST清洗后用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。檢測TGF-β2處理組、轉(zhuǎn)染組與對照組的Mfn2、E-Cadherin和Vimentin蛋白表達變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示。兩樣本比較采用t檢驗。檢驗水準：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β2處理組和對照組HLECs中Mfn2表達變化

2.1.1 TGF-β2處理組和對照組HLECs中Mfn2 mRNA表達變化實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，不同濃度TGF-β2(10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1)處理HLECs 24 h后，TGF-β2處理組Mfn2 mRNA表達量較對照組(0 ng·mL-1TGF-β2)均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.001)。其中當TGF-β2濃度為100 ng·mL-1時，Mfn2 mRNA表達量升高最明顯，見圖1。因此，選取100 ng·mL-1TGF-β2作為后續(xù)實驗的細胞最佳處理濃度。

圖1 TGF-β2處理組和對照組HLECs中Mfn2 mRNA TGF-β2濃度表達量變化 與對照組比較，**P

2.1.2 TGF-β2處理組和對照組HLECs中Mfn2蛋白表達變化免疫熒光細胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示，細胞內(nèi)Mfn2(紅色)熒光亮度增強，數(shù)量增加，反映經(jīng)最佳濃度100 ng·mL-1TGF-β2處理后，TGF-β2處理組Mfn2蛋白表達較對照組增加，見圖2。

圖2 TGF-β2處理組和對照組HLECs中Mfn2蛋白表達變化 HLECs核呈藍色熒光(DAPI)，Mfn2蛋白呈紅色熒光。A：對照組；B：TGF-β2處理組

2.2 TGF-β2處理組和對照組HLECs中上皮標志物變化

2.2.1 TGF-β2處理組和對照組HLECs中E-Cadherin和Vimentin的mRNA表達變化實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，100 ng·mL-1TGF-β2處理組處理細胞24 h后，TGF-β2處理組與對照組相比E-Cadherin mRNA表達量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，Vimentin mRNA表達量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),見圖3。說明在100 ng·mL-1TGF-β2作用細胞24 h后，在mRNA表達水平HLECs發(fā)生了EMT。

2.2.2 TGF-β2處理組和對照組HLECs中E-Cadherin和Vimentin的蛋白表達變化免疫熒光細胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示，100 ng·mL-1TGF-β2處理組處理細胞24 h后，細胞內(nèi)E-cadherin(綠色)熒光亮度降低，數(shù)量減少，反映了TGF-β2處理組E-Cadherin蛋白表達較對照組下降，Vimentin(紅色)熒光亮度增強，數(shù)量增加，說明TGF-β2處理組較對照組Vimentin蛋白表達增加，見圖4。即100 ng·mL-1TGF-β2作用24 h，在蛋白水平HLECs發(fā)生了EMT。

2.3 Mfn2轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)染組和對照組HLECs上皮標志物變化

2.3.1 Mfn2轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)染組和對照組E-Cadherin和Vimentin mRNA表達變化實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，pEGFP-Mfn2轉(zhuǎn)染HLECs后，轉(zhuǎn)染組Mfn2 mRNA表達量較對照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。從mRNA水平證明pEGFP-Mfn2轉(zhuǎn)染使Mfn2成功過表達，見圖5。轉(zhuǎn)染組E-Cadherin mRNA表達量較對照組下降，Vimentin mRNA表達量較對照組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.001)，見圖6。從mRNA水平證明了過表達Mfn2可使HLECs發(fā)生EMT。

2.3.2 Mfn2轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)染組和對照組HLECs中E-Cadherin和Vimentin蛋白表達變化免疫熒光細胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示，細胞內(nèi)Mfn2(紅色)較對照組熒光亮度增強，數(shù)量增加，在蛋白水平反映了pEGFP-Mfn2轉(zhuǎn)染HLECs后，轉(zhuǎn)染組與對照組相比Mfn2蛋白成功過表達。且與對照組相比，轉(zhuǎn)染組E-Cadherin(綠色)熒光強度減弱，表達明顯減少，Vimentin(紅色)熒光亮度增強，表達明顯增加，見圖7。說明在蛋白表達水平，過表達Mfn2可使HLECs發(fā)生EMT。

圖3 TGF-β2處理組和對照組HLECs中E-Cadherin和Vimentin mRNA表達量變化 兩組間比較，**P

圖4 TGF-β2處理組和對照組HLECs中E-Cadherin和Vimentin的蛋白表達變化 HLECs核呈藍色熒光(DAPI)，E-Cadherin呈綠色熒光,Vimentin呈紅色熒光

圖5 pEGFP-Mfn2轉(zhuǎn)染HLECs后轉(zhuǎn)染組與對照組Mfn2 mRNA表達變化 與對照組比較，**P

圖6 pEGFP-Mfn2轉(zhuǎn)染HLECs后轉(zhuǎn)染組與對照組E-Cadherin和Vimentin的mRNA表達變化 兩組間比較，**P

圖7 pEGFP-Mfn2轉(zhuǎn)染HLECs后轉(zhuǎn)染組與對照組Mfn2、E-Cadherin和Vimentin的蛋白表達變化 HLECs核呈藍色熒光(DAPI)，Mfn2和Vimentin呈紅色熒光，E-Cadherin呈綠色熒光

3 討論

Mfn2是參與線粒體外膜融合的重要蛋白之一，Mfn2與細胞及細胞器多種生物學(xué)功能均存在著密切的關(guān)系。隨著研究的不斷深入，Mfn2在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用也越來越受到關(guān)注。已有研究表明，在腎間質(zhì)纖維化過程中，Mfn2 mRNA的表達量明顯升高[5]。同時，Mfn2還參與調(diào)節(jié)了間質(zhì)性膀胱炎的EMT過程，且表達上調(diào)[6]。EMT是上皮細胞通過特定的程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞的生物學(xué)過程，也是白內(nèi)障術(shù)后后發(fā)性白內(nèi)障形成的重要原因。E-Cadherin是一種主要存在于表皮組織中的同親型結(jié)合、鈣依賴的細胞黏著糖蛋白，Vimentin是中間絲的其中一種蛋白質(zhì)，上皮細胞發(fā)生EMT時的主要特征為細胞間黏附分子E-Cadherin表達減少、以細胞角蛋白細胞骨架轉(zhuǎn)化為以Vimentin為主的細胞骨架及形態(tài)上具有間充質(zhì)細胞的特征改變。研究表明，多種因素均參與了LECs發(fā)生EMT的過程，如結(jié)締組織生長因子[7]、白細胞介素6等[8]細胞因子，miR-181a[9]、miR-26b[10]等非編碼RNA及組蛋白去乙?；?HDAC)[11-12]、缺氧誘導(dǎo)因子-1[13]、晚期糖基化終末產(chǎn)物AGE[14]等。

本研究發(fā)現(xiàn)，在TGF-β2的作用下，HLECs發(fā)生了EMT，將其作為后發(fā)性白內(nèi)障的模型，與對照組相比，TGF-β2處理組中Mfn2 mRNA表達量明顯升高，且蛋白表達增加，提示Mfn2參與了HLECs發(fā)生EMT的過程。pEGFP-Mfn2轉(zhuǎn)染HLECs使Mfn2成功過表達后，與對照組相比，轉(zhuǎn)染組上皮標志物E-Cadherin mRNA表達量下調(diào)，Vimentin mRNA表達量上調(diào)。E-Cadherin蛋白表達減少，Vimentin蛋白表達增加。進一步證明了Mfn2參與HLECs的EMT過程，而且過表達Mfn2會誘發(fā)HLECs發(fā)生EMT，但其具體作用機制有待進一步探究。

綜上所述，Mfn2在后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)病過程中起到了重要作用且表達上調(diào)，通過過表達Mfn2可誘發(fā)HLECs發(fā)生EMT，從而促進后發(fā)性白內(nèi)障的形成。隨著進一步深入研究，Mfn2有望作為后發(fā)性白內(nèi)障生物治療的新靶點，從新的角度為后發(fā)性白內(nèi)障的預(yù)防和治療提供思路。