徐福如 蔣文君 姜倩 張瑞雪 劉德政 畢宏生

黃斑變性(macular degeneration，MD)是一種引起視網(wǎng)膜黃斑中心凹退行性病變的疾病，可分為年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)和先天性MD，MD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中與遺傳因素關(guān)系密切，是多個或單個基因變異共同作用的結(jié)果。原纖維蛋白-2(fibrillin-2，F(xiàn)BN2)與原纖維蛋白-1(fibrillin-1，F(xiàn)BN1)共同參與纖維結(jié)締組織的構(gòu)成，兩者基因突變均可引起全身性結(jié)締組織病[1]。近期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BN2基因突變是早發(fā)型MD家系的致病突變[2-3]，動物研究證明,FBN2和FBN1對小鼠睫狀小帶的發(fā)育起關(guān)鍵作用[4-5]，然而，F(xiàn)BN2對小鼠視網(wǎng)膜變性作用的研究尚少。因此，本研究選用向C57BL/6小鼠玻璃體內(nèi)注射FBN2抗體的方式，旨在探討FBN2對小鼠視網(wǎng)膜變性的影響，幫助進(jìn)一步明確MD的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物選取18只8周齡SPF級健康 C57BL/6J雄性小鼠，體質(zhì)量22～23 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001。實驗前對小鼠進(jìn)行篩查，排除患有眼部疾病，如白內(nèi)障、角膜損傷以及眼底異常的小鼠。在SPF級潔凈系統(tǒng)密閉環(huán)境下，保證水和飼料充足，溫度和濕度適宜，12 h光暗循環(huán)的條件下飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)眼科研究所動物房。所有實驗均符合ARVO對于動物在眼睛和視覺方面的應(yīng)用規(guī)則。

1.1.2 主要試劑及儀器FBN2抗體(sc393968；美國 Santa Cruz 公司)，PBS(E607016；上海生物工程有限公司),酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)，激光共聚焦眼底掃描鏡(英國 Daytona 公司)，視覺電生理儀器(德國 Roland公司)，光學(xué)顯微鏡(德國 ZEISS 公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及其分組將18只8周齡C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為3組：正常對照組(n=6)、PBS組(n=6)、FBN2抗體組(n=6)，對每組小鼠進(jìn)行標(biāo)記并記錄。正常對照組小鼠不做任何處理，正常飼養(yǎng)；PBS組：小鼠雙眼玻璃體內(nèi)注射4 μL PBS溶液；FBN2抗體組：小鼠雙眼玻璃體內(nèi)注射4 μL FBN2抗體(0.2 g·L-1)。PBS組和FBN2抗體組每周注射1次，連續(xù)3周。每次注射1周后對小鼠行眼底照相和視網(wǎng)膜電流圖(ERG)檢查。

1.2.2 玻璃體內(nèi)注射方法PBS組和FBN2抗體組小鼠提前1 d滴氧氟沙星滴眼液(3次·d-1)，腹腔注射10 g·L-1戊巴比妥鈉溶液(50 mg·kg-1)將小鼠麻醉，滴復(fù)方托吡卡胺滴眼液充分散瞳，碘伏消毒液對小鼠眼表消毒，1 min后用生理鹽水沖洗，滴鹽酸奧布卡因滴眼液對角膜行表面麻醉。玻璃體內(nèi)注射在蔡司顯微鏡下進(jìn)行，用顯微齒鑷固定眼球，使用漢密爾微量注射器(10 μL)和規(guī)格為33的針頭，于角鞏膜緣顳側(cè)后1 mm處垂直鞏膜進(jìn)針，有突破感后針頭向眼球壁傾斜20°避開晶狀體，注射抗體完畢后用齒鑷輕輕夾住30 s，滴典必殊滴眼液,術(shù)后1 d繼續(xù)滴典必殊滴眼液。所有手術(shù)均由同一研究者完成。

1.2.3 眼底照相腹腔注射10 g·L-1戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)溶液將3組小鼠麻醉后，滴復(fù)方托吡卡胺滴眼液充分散瞳，涂氧氟沙星眼膏，保持角膜濕潤。由同一檢查者手持小鼠將眼睛對準(zhǔn)掃描激光眼底鏡鏡頭，拍攝并保存圖像。由同一眼科醫(yī)師評判小鼠眼底改變。

1.2.4 ERG檢測ERG檢測在夜晚進(jìn)行。檢測前進(jìn)行8 h以上的暗適應(yīng)，在暗環(huán)境下腹腔注射10 g·L-1戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)溶液將小鼠麻醉，滴復(fù)方托吡卡胺滴眼液充分散瞳，鹽酸奧布卡因滴眼液進(jìn)行角膜表面麻醉。小鼠放在動物操作臺上，將由金絲制作的直徑3.0 mm環(huán)狀角膜電極固定置于小鼠雙眼角膜表面，不銹鋼針狀電極的參考電極分別插入眼睛與耳朵連線的中間皮下，針狀電極的接地電極刺入小鼠尾端皮下(上述操作在暗紅光下執(zhí)行)，待各電阻小于5 kΩ時，并且顯示屏上基線穩(wěn)定后，開始記錄各個ERG反應(yīng)。

1.2.5 PAS染色所有檢測結(jié)束后，腹腔注射過量10 g·L-1戊巴比妥鈉溶液處死小鼠，迅速取眼球，每組隨機(jī)選取4眼置于固定液中固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋及切片，切片厚4 μm，當(dāng)視神經(jīng)出現(xiàn)時收集切片，用PAS試劑盒進(jìn)行染色，取3張切片，每張切片在20×10 光學(xué)顯微鏡下選取視神經(jīng)上方400 μm處作為測量點，測量各組后極部視網(wǎng)膜、外核層以及內(nèi)核層的厚度。

1.2.6 ELISA檢測所有檢測結(jié)束后，腹腔注射過量10 g·L-1戊巴比妥鈉溶液處死小鼠，迅速摘除眼球，每組隨機(jī)選取4眼沿角鞏膜緣剪開，去除角膜、虹膜、晶狀體、玻璃體，用虹膜恢復(fù)器輕輕分離出視網(wǎng)膜置于液氮中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?。取出視網(wǎng)膜組織，快速放入液氮中，加入組織裂解液，12 000 r·min-14 ℃離心1 min，吸取上清到新EP 管中。利用BCA法檢測樣品濃度，嚴(yán)格按照FBN2 ELISA試劑盒說明書進(jìn)行ELISA檢測，分析FBN2蛋白的表達(dá)。

1.2.7 實時熒光定量PCR檢測視網(wǎng)膜總RNA的提取和實時定量PCR反應(yīng)按照經(jīng)典方法進(jìn)行[6]。將凍存的視網(wǎng)膜組織取出，放入液氮速凍。使用Trizol試劑提取總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用 Light Cycler 480 II實時熒光定量 PCR 儀檢測FBN2 mRNA 表達(dá)。FBN2的上游引物：5’-CGGGACGTCTTGTGTAGACC-3’、下游引物：5’-TTCATTGTTGTCGATGCACGC-3’。以β-actin蛋白作為內(nèi)參，上游引物：5’-GGCCAACCGTGAAAAGATGA-3’、下游引物5’-CACAGCCTGGATGGCTACGT-3’。經(jīng)過3次獨立實驗,采用2-ΔΔCt法定量分析FBN2 mRNA的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 眼底照相結(jié)果各個時間點正常對照組眼底無明顯改變。PBS組在注射2次后出現(xiàn)輕微少量滲出，并在注射3次后滲出減少。FBN2抗體組在注射1次后出現(xiàn)少量眼底滲出，黃白色似玻璃膜疣樣沉積物以及色素沉著的病理改變，且隨注射次數(shù)的增加及時間的延長，滲出范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，黃白色玻璃膜疣樣沉積物以及色素沉著物累積增多，病變可累及視盤周圍。見圖1。

2.2 視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果正常對照組和PBS組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)規(guī)整,細(xì)胞排列整齊。FBN2抗體組視網(wǎng)膜厚度[(129.33±15.38)μm]與正常對照組[(197.68±13.50)μm] 和PBS組 [(198.27±8.28)μm]比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。FBN2抗體組外核層厚度[(23.39±3.93)μm]與正常對照組[(46.54±7.44)μm]和PBS組[(38.92±2.39)μm]比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。FBN2抗體組內(nèi)核層厚度[(33.89±7.10)μm]與正常對照組小鼠 [(29.74±5.45)μm] 和PBS組小鼠[(233.11±6.09)μm]比較，差異均無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)，見圖2。

2.3 小鼠ERG檢查結(jié)果注射1次、2次、3次后，F(xiàn)BN2抗體組暗適應(yīng)視桿細(xì)胞反應(yīng)和暗適應(yīng)混合細(xì)胞反應(yīng)波形均逐漸變平緩，呈熄滅型。注射1次、2次、3次后FBN2抗體組暗適應(yīng)視桿細(xì)胞反應(yīng)b波和暗適應(yīng)混合細(xì)胞反應(yīng)a波振幅均低于正常對照組和PBS組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)，且兩者振幅在注射3次后均為最低。注射2次、3次后，F(xiàn)BN2抗體組暗適應(yīng)混合細(xì)胞反應(yīng)b波振幅均低于正常對照組和PBS組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)，且注射2次時b波振幅最低。正常對照組和PBS組之間，各波振幅差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。見圖3和表1。

2.4 小鼠視網(wǎng)膜FBN2蛋白及mRNA的相對表達(dá)正常對照組和PBS組比較，小鼠視網(wǎng)膜FBN2蛋白及mRNA的相對表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)；FBN2抗體組視網(wǎng)膜中FBN2蛋白及mRNA 的相對表達(dá)均低于正常組和PBS組， 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。見表2。

圖1 各組小鼠玻璃體內(nèi)注射后眼底圖像 A：正常對照組；B：PBS組；C：FBN2抗體組

圖2 PAS染色各組小鼠視網(wǎng)膜形態(tài) A：正常對照組；B：PBS組；C：FBN2抗體組

圖3 各組小鼠ERG波形圖 A：正常對照組；B：PBS組；C：FBN2抗體組

組別視桿細(xì)胞反應(yīng)b波振幅/μV注射1次后注射2次后注射3次后混合細(xì)胞反應(yīng)a波振幅/μV注射1次后注射2次后注射3次后混合細(xì)胞反應(yīng)b波振幅/μV注射1次后注射2次后注射3次后正常對照組72.85±11.92 86.00±20.14 76.24±11.02 75.42±7.06 92.69±22.02 77.30±9.58 179.69±35.42276.63±77.36 243.87±39.69 PBS組80.56±16.2689.11±24.3682.96±14.0877.94±22.59129.10±27.5115.74±18.52209.01±50.62323.61±62.00313.66±43.96FBN2抗體組31.00±10.46#?20.72±5.80##?13.28±3.41##??24.36±3.31##?22.84±8.07#??21.67±8.81##??100.80±28.5859.12±18.00#??73.43±34.83##??

注：與正常對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與PBS組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別FBN2蛋白/ng·mg-1FBN2mRNA正常對照組0.17±0.01(8.84±0.23)× 10-5PBS組0.17±0.02(9.69±1.02)× 10-5FBN2抗體組0.15±0.01#? (5.59±0.24)× 10-5#?

注：與正常對照組比較，#P<0.05；與PBS組比較，*P<0.05

3 討論

原纖維蛋白是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)中彈性和非彈性細(xì)胞中微纖維的主要骨架，該類基因的突變常與馬凡綜合征、先天性晶狀體異位、先天性胸部動脈瘤、先天性攣縮性蜘蛛指癥等結(jié)締組織遺傳病有關(guān)[7]。FBN1基因突變與馬凡綜合征密切相關(guān)，主要累及眼、骨骼和心血管系統(tǒng)[8],眼科表現(xiàn)為晶狀體異位和近視等。Lee等[9]研究發(fā)現(xiàn)，第一次分離出部分FBN2的cDNA ，F(xiàn)BN2與FBN1結(jié)構(gòu)與功能相似，且均廣泛分布于胚胎和胎兒的肺、心臟、主動脈、神經(jīng)節(jié)等組織中，同時， FBN2在胎兒眼組織的視網(wǎng)膜色素上皮和脈絡(luò)膜中均有表達(dá)，在老年供體中表達(dá)減少。FBN2基因突變主要與先天性攣縮性蜘蛛指癥有關(guān)，累及眼部疾病較少見[10]。Ratnapriya等[2]首次發(fā)現(xiàn)FBN2基因突變可引起常染色體顯性遺傳MD的發(fā)生；Duvvari等[3]在有玻璃膜疣表型的ADM患者中也發(fā)現(xiàn)該基因的變異?？梢奆BN2在MD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其具體作用機(jī)制仍不明確。因此，研究FBN2對MD疾病的影響機(jī)制對臨床防治有重要作用。

動物實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BN2對小鼠眼睫狀小帶的發(fā)育起關(guān)鍵作用，表現(xiàn)為成年基因敲除FBN2小鼠瞳孔異常，晶狀體異位[11]。由于FBN2參與構(gòu)成全身結(jié)締組織，建立的FBN2-/-基因敲除小鼠出現(xiàn)肌肉缺陷、呼吸衰竭等致死性并發(fā)癥的可能性較高，小鼠存活率低，無法進(jìn)一步觀察眼部表型[12]。因此，本研究首次探討了玻璃體內(nèi)注射FBN2抗體對小鼠視網(wǎng)膜變性的影響，可避免基因敲除小鼠出現(xiàn)致死性并發(fā)癥。

MD眼底表現(xiàn)為黃斑區(qū)玻璃膜疣、視網(wǎng)膜色素上皮紊亂和地圖樣萎縮的病理改變。本研究使用C57BL/6J小鼠為模型，發(fā)現(xiàn)玻璃體內(nèi)注射FBN2抗體后眼底出現(xiàn)滲出、玻璃膜疣樣改變和色素沉著等眼底改變。這與劉艷麗等[13]、安娜等[14]、Tao等[15]研究結(jié)果相似。本研究表明，隨時間的延長，小鼠眼底病理改變范圍擴(kuò)大，且滲出及色素沉著增多，說明FBN2抗體可導(dǎo)致視網(wǎng)膜變性的發(fā)生，且具有時間依賴效應(yīng)。提示FBN2基因突變引起MD患者早期眼底改變可能不明顯，隨年齡的增加，視網(wǎng)膜變性范圍及程度會進(jìn)一步加大。因此，定期隨訪及觀察患者眼底情況，有助于避免其他嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生，并為患者選擇個性化治療方式提供判斷依據(jù)。同時，本研究表明小鼠玻璃體內(nèi)注射FBN2抗體，可作為研究FBN2在MD疾病中作用機(jī)制的動物模型。

ERG可作為評價視網(wǎng)膜功能的客觀指標(biāo)。暗適應(yīng)視桿細(xì)胞反應(yīng)b波為視桿細(xì)胞驅(qū)動的on雙極細(xì)胞反應(yīng)；暗適應(yīng)混合細(xì)胞反應(yīng)起源于視桿細(xì)胞、視錐細(xì)胞和雙極細(xì)胞的混合反應(yīng)，以視桿細(xì)胞為主，其中a波起源于視桿、視錐細(xì)胞，b波起源于雙極細(xì)胞[16]。有研究表明，滲出性AMD患者晚期變性區(qū)域僅殘留少許視錐細(xì)胞,視桿細(xì)胞基本消失[17]。陳長征等[18]分析早期AMD患者ERG結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該類患者暗視敏感度降低,證實了視桿細(xì)胞在黃斑疾病中易感性的學(xué)說，同樣濕性AMD患者ERG各波振幅明顯降低。本研究發(fā)現(xiàn)，玻璃體內(nèi)注射FBN2抗體后，暗適應(yīng)視桿細(xì)胞反應(yīng)b波振幅最先降低，之后暗適應(yīng)混合細(xì)胞反應(yīng)a、b波振幅均降低，說明玻璃體內(nèi)注射FBN2抗體干預(yù)后，首先影響了視桿細(xì)胞的電活動，然后影響視錐細(xì)胞和雙極細(xì)胞的電活動，進(jìn)一步降低了視網(wǎng)膜的電生理功能。這與王寶英等[19]研究結(jié)果一致。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)玻璃體內(nèi)注射FBN2抗體后視網(wǎng)膜厚度降低，主要源于外核層厚度的改變。同時，有研究者發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜下移植BMSC和內(nèi)源性或外源性增加眼內(nèi)bFGF能夠抑制視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞凋亡，可促使視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞數(shù)量增多，阻滯視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞凋亡[20]。這提示，玻璃體內(nèi)注射FBN2抗體引起視網(wǎng)膜變性可能與光感受器細(xì)胞凋亡有關(guān)，增加眼內(nèi)bFGF可能成為通過改善光感受器細(xì)胞凋亡，緩解視網(wǎng)膜變性病程的有效方法。

本研究首次探討了玻璃體內(nèi)注射FBN2抗體對小鼠視網(wǎng)膜變性的作用，結(jié)果顯示，小鼠玻璃體內(nèi)注射FBN2抗體可成功建立FBN2表達(dá)減少的MD模型，為后期深入研究FBN2表達(dá)降低引起的生物學(xué)變化提供基礎(chǔ)，有助于進(jìn)一步明確MD發(fā)病機(jī)制，為MD疾病早期診斷和預(yù)防，以及為患者制定個性化診療方式提供一定的理論基礎(chǔ)。