王潔 李思雨 謝子康 左慧懿 唐承業(yè) 唐東永 忠昕 梁皓

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是引起糖尿病患者不同程度視力障礙甚至失明的一種高度特異性神經(jīng)血管并發(fā)癥，其早期臨床表現(xiàn)包括微動(dòng)脈瘤形成和視網(wǎng)膜內(nèi)出血[1]。目前，DR眼內(nèi)治療主要有視網(wǎng)膜激光光凝、玻璃體內(nèi)注射抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和類固醇藥物、玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)，這些治療僅針對(duì)視網(wǎng)膜已發(fā)生不可逆損傷的DR晚期階段且存在許多并發(fā)癥和副作用[2-3]。因此，有必要早期識(shí)別、預(yù)防或解決DR的早期病理?yè)p傷。DR以往被認(rèn)為是微血管疾病，然而在糖尿病的早期階段，患者眼底檢查未發(fā)現(xiàn)明顯微血管異常時(shí)已發(fā)現(xiàn)存在對(duì)比敏感度降低、暗適應(yīng)延遲和視野異常等視網(wǎng)膜功能異常[4-5]，如今研究者已意識(shí)到DR早期存在神經(jīng)元功能障礙和神經(jīng)退行性變[6]。值得注意的是，衰老是神經(jīng)退行性疾病的最大風(fēng)險(xiǎn)因素，年齡增加會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元變性和視覺系統(tǒng)功能下降[7]。事實(shí)上，糖尿病和衰老有密切聯(lián)系，糖尿病導(dǎo)致的多器官系統(tǒng)功能障礙(認(rèn)知障礙、心血管疾病、腎功能不全、骨質(zhì)疏松和視力障礙等)與衰老類似，且越來越多證據(jù)表明二者之間存在平行分子機(jī)制，包括細(xì)胞衰老、免疫炎癥、蛋白穩(wěn)態(tài)異常、mRNA加工異常和DNA損傷修復(fù)障礙等[8]。根據(jù)糖尿病與衰老之間生物學(xué)聯(lián)系的提示，本研究嘗試考慮從糖尿病和衰老中共同作用因子角度去探尋針對(duì)DR早期干預(yù)的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取20只SPF級(jí)昆明小鼠，雄性，6周齡，體質(zhì)量(22±2)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK桂2014-0002。本研究已獲廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 藥物及試劑鏈脲佐菌素(Sigma)；SP試劑盒、DAB顯色試劑盒(中杉金橋)；抗衰老標(biāo)記蛋白30(senescence marker protein 30,SMP30)抗體(Abcam);反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real Time PCR反應(yīng)試劑盒(Takara)。

1.2 方法

1.2.1 與糖尿病和衰老共同相關(guān)基因的篩選從在線數(shù)據(jù)庫(kù)Rat Genome Database(RGD；http://rgd.mcw.edu)[9]分別搜索與人類糖尿病和衰老有關(guān)的基因，該數(shù)據(jù)庫(kù)提供了與實(shí)驗(yàn)鼠相關(guān)的最全面的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)庫(kù)和信息學(xué)平臺(tái)，包含大鼠、小鼠和人類的各種疾病相關(guān)基因信息。將上述獲取到的兩組基因取交集，篩選出與糖尿病和衰老共同相關(guān)基因。

1.2.2 相互作用分析為了解上述篩選所得基因之間的相互作用關(guān)系，分別使用STRING(https://string-db.org/)[10]和GeneMANIA(http://www.genemania.org/)[11]構(gòu)建了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和基因-基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.3 富集分析使用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)[12]研究上述基因涉及的生物學(xué)功能和通路，包括GO分析和KEGG通路，其中GO分析又包括生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細(xì)胞成分(cellular component,CC)3個(gè)部分，富集分析結(jié)果P<0.05為有相關(guān)性。

1.2.4 小鼠糖尿病模型建立將小鼠用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組和糖尿病組，每組各10只。糖尿病組小鼠改用高脂飼料喂養(yǎng)1個(gè)月后行腹腔注射STZ溶液40 mg·kg-1，按上述劑量連續(xù)注射處理3 d，對(duì)照組用同等劑量的檸檬酸緩沖液處理。注射前小鼠過夜禁食不禁水12 h，注射STZ后糖尿病組小鼠高脂飼料維持喂養(yǎng)。注射1周后行小鼠尾靜脈采血測(cè)量空腹血糖，空腹血糖≥11.0 mmol·L-1為糖尿病模型建立成功。造模過程中糖尿病組2只小鼠死亡，剩下8只繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)1個(gè)月后頸椎脫臼法處死。

1.2.5 取材頸椎脫臼法處死小鼠后，快速摘出眼球于PBS緩沖液中稍加漂洗，浸沒于100 g·L-1多聚甲醛溶液中，4 ℃保存用于制作病理切片。同上述方法摘出眼球后，置于裝有PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中。用眼科無齒鑷夾住眼球后部的視神經(jīng)斷端，將眼球前部調(diào)至顯微鏡視野中央。用有齒鑷鉗夾鞏膜固定眼球，然后用角膜剪沿角鞏膜緣剪下角膜。用鑷子將晶狀體挑出后，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗剩余眼球內(nèi)壁,去除殘留玻璃體后，用鑷子將視網(wǎng)膜完整剝離下來后轉(zhuǎn)移至EP管，-80 ℃保存。

1.2.6 HE染色觀察小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)摘除的小鼠眼球于體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛溶液固定24 h后，梯度酒精脫水后石蠟包埋，切片厚5 μm。將切片于二甲苯中二次脫蠟，每次5 min；于梯度乙醇中進(jìn)行水化后浸于蒸餾水中2 min。蘇木素染色1 min沖洗、體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸酒精中分化10 s、溫水中浸泡15 min。伊紅染色2 min后沖洗、浸泡、脫水后封片。使用數(shù)字病理切片掃描儀掃描切片，用切片瀏覽軟件NDP.view2進(jìn)行閱片。

1.2.7 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠視網(wǎng)膜組織中SMP30蛋白表達(dá)將小鼠視網(wǎng)膜切片脫蠟復(fù)水后進(jìn)行高壓修復(fù)抗原。內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育10 min、正常山羊血清工作液室溫孵育15 min進(jìn)行封閉、預(yù)先稀釋的一抗(稀釋比例1800)4 ℃過夜。生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG室溫孵育15 min、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液室溫孵育15 min，滴加 120現(xiàn)配DAB顯色工作液后于顯微鏡下觀察顯色反應(yīng)。蘇木素復(fù)染，脫水后封片。掃描切片和閱片同上，圖像數(shù)據(jù)分析使用Image J軟件。

1.2.8 RT-qPCR檢測(cè)小鼠視網(wǎng)膜組織中SMP30 mRNA表達(dá)使用總RNA制備試劑盒提取小鼠視網(wǎng)膜組織中的總RNA，用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)量總RNA的濃度和純度。使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒去除總RNA樣品中殘留的基因組DNA并合成cDNA，去除基因組DNA反應(yīng)液和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液按試劑盒說明書進(jìn)行配置。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s，合成的cDNA于-20 ℃保存。采用TB Green嵌合熒光法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，按照試劑盒操作手冊(cè)中提供的方法配置PCR反應(yīng)液和進(jìn)行兩步法PCR反應(yīng)程序。采用2-△△Ct法行mRNA的相對(duì)定量分析。PCR引物序列如下，SMP30正向引物：5’-TGTGTTTTACGGGAGAACTACA-3’，反向引物：5’-ACCGTATCCCATCGACAAATAA-3’。內(nèi)參β-actin的正向引物：5’-GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG-3’，反向引物：5’-ATGCCACAGGATTCCATACC-3’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用GraphPad prism 7進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。本研究數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同組間行兩樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 與糖尿病和衰老共同相關(guān)基因的篩選結(jié)果共搜索到與人類糖尿病相關(guān)基因1146個(gè)、與衰老相關(guān)基因408個(gè)，二者之間重疊的基因有11個(gè)，分別為超氧化物歧化酶2(SOD2)、鈣調(diào)素(RGN/SMP30)、蛋白激酶Cα型(PRKCA)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、叢生蛋白(CLU)、NAD依賴性蛋白脫乙酰酶 Sirtuin 3(SIRT3)、Werner綜合征ATP依賴解旋酶(WRN)、自閉癥易感基因蛋白2(AUTS2)、ATP合酶亞基(MT-ATP6)、煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(NAMPT)、腫瘤蛋白63(TP63)。上述11個(gè)基因在蛋白和基因水平上有相互作用關(guān)系。

2.2 富集分析生物學(xué)功能評(píng)估顯示，11個(gè)基因主要富集于神經(jīng)元凋亡過程、NO生物合成過程的正調(diào)控、凋亡過程負(fù)調(diào)控、細(xì)胞衰老、染色體結(jié)合等；KEGG通路分析顯示與線粒體生物發(fā)生和HIF-1信號(hào)通路相關(guān)。

2.3 HE染色觀察小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜10層結(jié)構(gòu)排列較為規(guī)整，內(nèi)界膜平整。糖尿病組小鼠視網(wǎng)膜各層排列較不規(guī)則，內(nèi)界膜不規(guī)則較為明顯，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列錯(cuò)落、紊亂。見圖1。

2.4 小鼠視網(wǎng)膜中SMP30蛋白的表達(dá)2組小鼠視網(wǎng)膜均可觀察到SMP30蛋白免疫陽性反應(yīng)(圖2)。SMP30蛋白免疫陽性反應(yīng)主要位于細(xì)胞胞漿內(nèi)，分布于小鼠視網(wǎng)膜各層，其中神經(jīng)纖維層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、外叢狀層SMP30蛋白免疫陽性產(chǎn)物表達(dá)較強(qiáng)。糖尿病組小鼠視網(wǎng)膜各層SMP30蛋白免疫陽性產(chǎn)物表達(dá)(7.57±0.49)明顯較對(duì)照組(25.20±2.45)弱(t=7.057,P<0.01)。

圖1 小鼠視網(wǎng)膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)(HE染色，×20) A：對(duì)照組；B：糖尿病組(箭頭示神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列錯(cuò)落、紊亂)。RPE：視網(wǎng)膜色素上皮層；LRC：視桿視錐層；ELM：外界膜；ONL：外核層；OPL：外叢狀層；INL：內(nèi)核層；IPL：內(nèi)叢狀層；GCL：神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；NFL：神經(jīng)纖維層；ILM：內(nèi)界膜

圖2 小鼠視網(wǎng)膜SMP30蛋白的表達(dá)情況 A：對(duì)照組；B：糖尿病組

2.5 RT-qPCR檢測(cè)視網(wǎng)膜中SMP30 mRNA的表達(dá)糖尿病組小鼠視網(wǎng)膜中SMP30 mRNA(0.51±0.12)的表達(dá)與對(duì)照組(0.96±0.02)相比顯著降低(t=3.717,P=0.02)。

3 討論

DR病理學(xué)涉及多元醇途徑通量、高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(AGE)、蛋白激酶C(PKC)的激活和增加己糖胺通路通量這4種經(jīng)典機(jī)制，且這些途徑都與活性氧自由基(ROS)的過量產(chǎn)生相關(guān)，ROS的積累會(huì)引起氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜損傷[13]。通過使用RGD數(shù)據(jù)庫(kù)共篩選出11個(gè)與人類糖尿病與衰老相關(guān)的重疊基因，它們?cè)诘鞍缀突蛩缴洗嬖谙嗷プ饔藐P(guān)系，其中幾個(gè)已被證實(shí)是參與DR發(fā)病機(jī)制的重要因子。SOD2是抗氧化酶體系中的重要成員[14]，而高血糖引起ROS產(chǎn)生與抗氧化防御系統(tǒng)之間的不平衡激活了幾種促進(jìn)DR發(fā)病的氧化應(yīng)激相關(guān)機(jī)制，且即使在血糖濃度恢復(fù)到正常水平后，氧化應(yīng)激造成的損害仍然持續(xù)存在較長(zhǎng)時(shí)間[13]。高血糖引起的ROS升高會(huì)降低GAPDH活性，導(dǎo)致上游糖酵解代謝產(chǎn)物增加，從而導(dǎo)致多元醇途徑通量的增加；GAPDH受抑制會(huì)導(dǎo)致磷酸二羥基丙酮水平升高，從而導(dǎo)致甘油二酯(DAG)濃度升高和PKC活化[15]。

與上述基因有相互作用關(guān)系的SMP30，最初于大鼠肝臟組織中作為Ca2+結(jié)合蛋白被發(fā)現(xiàn)[16]，而后被發(fā)現(xiàn)廣泛分布于腎臟、心臟、腦、肺等組織[17]，且其表達(dá)水平會(huì)隨著年齡增加而降低，這種年齡相關(guān)性的特征也正是它命名的起源[18]。SMP30現(xiàn)已被證實(shí)為一種多效蛋白，其具有抗氧化應(yīng)激[19]、調(diào)節(jié)細(xì)胞Ca2+依賴性和非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[20]、調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡[21]和維生素C生物合成必需的葡萄糖酸內(nèi)酯酶等功能。最近研究顯示，SMP30 mRNA和蛋白表達(dá)隨著各種代謝性疾病(非酒精性脂肪肝、糖尿病性腎病和骨質(zhì)疏松癥)的發(fā)生而改變，并且研究證據(jù)提示SMP30可能是參與葡萄糖代謝和脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵因子[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，SMP30在糖尿病組小鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)低于對(duì)照組，這與在糖尿病小鼠的肝臟[23]和腎臟[24]中檢測(cè)到SMP30表達(dá)趨勢(shì)下降是一致的。

DR長(zhǎng)期以來被歸類為糖尿病微血管并發(fā)癥，現(xiàn)其已被定義為高度特異性的神經(jīng)血管并發(fā)癥[25]。許多使用視網(wǎng)膜電圖、暗適應(yīng)、對(duì)比敏感度和色覺測(cè)試的研究已證明，在發(fā)現(xiàn)明顯微血管改變之前神經(jīng)視網(wǎng)膜功能已經(jīng)受損[4,26]。本研究中糖尿病小鼠視網(wǎng)膜病理結(jié)構(gòu)變化顯示，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列紊亂，視網(wǎng)膜內(nèi)膜面極不平整。此外，本研究的富集分析顯示，包括SMP30在內(nèi)的基因與神經(jīng)元的凋亡相關(guān)。這提示視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷和SMP30表達(dá)降低相關(guān)。據(jù)報(bào)道，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中胰島素受體底物(IRS)-2的表達(dá)降低，IRS-2缺失導(dǎo)致視網(wǎng)膜內(nèi)神經(jīng)元和感光細(xì)胞的變性[27-28]。長(zhǎng)期的視網(wǎng)膜胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂不僅會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，還會(huì)損害胰島素依賴性蛋白的合成[29]。有許多證據(jù)顯示，SMP30涉及胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[30-32]。胰島素在體內(nèi)外均能刺激肝細(xì)胞中SMP30的表達(dá)[30-31]。SMP30基因敲除小鼠在給予葡萄糖后出現(xiàn)輕度葡萄糖耐量下降和急性胰島素分泌受損，且高脂飲食嚴(yán)重加劇了SMP30基因敲除小鼠的糖耐量[32]。此外有研究顯示，SMP30過表達(dá)通過減少ROS的產(chǎn)生并增加抗氧化劑防御酶的活性來保護(hù)肝臟和心肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的影響[33-35]。相反地，SMP30基因敲除小鼠表現(xiàn)出比野生型對(duì)照小鼠更高的氧化應(yīng)激水平[36]。

綜上所述，SMP30可作為DR早期的干預(yù)靶點(diǎn)，上調(diào)SMP30表達(dá)可能是保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)組織免受糖尿病狀態(tài)下胰島素信號(hào)紊亂和氧化應(yīng)激導(dǎo)致?lián)p傷的新途徑。