劉 麗，何 露，孔凡虹，曹敬麗，賈子琪，劉文松，許 震，王雅杰，3

（1.首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院臨床醫(yī)學研究實驗室，北京100050；2.首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院，北京100050；3.首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院檢驗科，北京100050）

應用快速孵育法優(yōu)化酶聯(lián)免疫吸附實驗過程探討——以乙型肝炎病毒表面抗原檢測為例

劉 麗1，何 露2，孔凡虹2，曹敬麗1，賈子琪2，劉文松2，許 震2，王雅杰1，3

（1.首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院臨床醫(yī)學研究實驗室，北京100050；2.首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院，北京100050；3.首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院檢驗科，北京100050）

目的 利用快速孵育法優(yōu)化酶聯(lián)免疫吸附實驗操作流程，通過縮短孵育時間，以提高工作效率。方法 收集化學發(fā)光法定量檢測乙肝表面抗原陽性高值樣本30例、陽性中值樣本30例、陽性臨界值樣本30例、陰性樣本30例，使用ELISA試劑盒說明書推薦方法和快速孵育法同時進行檢測，比較檢測結果相關性。結果 使用酶標板孵育器將孵育時間縮短至原來的1/2、1/3時，ELISA試劑盒說明書推薦方法、快速孵育法與化學發(fā)光法檢測結果符合率100%；當孵育時間縮短至原來時間的1/4時，兩種方法與化學發(fā)光法陰性、高值和中值樣本檢測結果符合率100%；臨界值樣本檢測時，ELISA試劑盒說明書推薦方法與化學發(fā)光法檢測結果符合率100%，快速孵育法與化學發(fā)光法結果6例不一致，檢測結果符合率80%。結論 通過實驗證實，酶聯(lián)免疫吸附實驗時，快速孵育法可滿足臨床檢測，可將孵育時間縮短至原試劑盒推薦時間的1/3或1/2，可提高工作效率。

酶聯(lián)免疫吸附實驗； 快速孵育法

酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）是臨床實驗室中最常使用的方法之一，是一種以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合的一種實驗技術。ELISA技術操作簡易、成本低、數(shù)據(jù)可靠，在臨床和科研中均有比較廣泛的應用［1］。本文利用ELISA技術進行乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）檢測，其主要實驗步驟為加樣、抗原抗體孵育、洗滌、生物酶素孵育、洗滌、辣根過氧化酶二抗孵育、顯色、終止、酶標儀讀取結果。孵育是ELISA檢測中影響檢測成敗的最關鍵因素之一［2］，本文中ELISA實驗過程涉及三次孵育，是耗時最長的實驗步驟。酶標板快速孵育器采用前期加溫造就一個孵育室高溫環(huán)境，使酶標板與孵育室的溫差增大而快速升溫，以縮短孵育時間。本文通過利用快速孵育器孵育與ELISA試劑盒推薦方法、化學發(fā)光法進行臨床上常見指標乙型肝炎病毒（簡稱乙肝）表面抗原的檢測，探討利用快速孵育法優(yōu)化酶聯(lián)免疫吸附實驗操作流程的可能性。

材料與方法

1 樣本來源

收集乙肝患者定量檢測乙肝表面抗原的血清樣本，其中大于試劑盒檢測上限（≥250 IU/mL）的高值樣本30例，男性14例，女性16例，年齡26～58歲，37.2±11.0歲；中值樣本（100～250 IU/mL）30例，其中24例男性，6例女性，年齡29～70歲，45.4± 2.0歲，實際檢測結果100.69～209.98IU/mL；低值樣本（0～100 IU/mL）30例，其中23例男性，7例女性，年齡26～69歲，48.0±12.4歲，實際檢測結果1.25～82.38 IU/mL；收集正常體檢樣本，乙肝表面抗原陰性樣本30例，其中11例男性，19例女性，年齡25～79歲，49.0±14.4歲。所有樣本 3000r/min離心10min，分裝于離心管中，存儲在-80℃冰箱中，用于ELISA說明書推薦方法、快速孵育法檢測，檢測時所有樣本隨機順序加樣。

2 儀器與試劑

2.1儀器 美國雅培Architect i2000化學發(fā)光免疫分析儀，美國MD酶標儀，成都蓋森酶標板快速孵育器，白洋離心機，美國RAININ移液器。

2.2試劑 化學發(fā)光法乙型肝炎病毒表面抗原定量測定試劑盒（美國雅培ARCHITECT公司），酶聯(lián)免疫法乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒（北京萬泰生物藥業(yè)有限公司）。

3 實驗方法

3.1化學發(fā)光法定量檢測HBsAg的方法（E法） 按照美國雅培ARCHITECT公司乙型肝炎病毒表面抗原定量測定試劑說明書操作，檢測前質(zhì)控結果在控。

3.2ELISA方法批內(nèi)重復性實驗（精密度）

選用高、低兩個質(zhì)控品，使用ELISA方法進行重復性檢測，每個質(zhì)控品連續(xù)重復測定20次，記錄S/CO值，計算變異系數(shù)（CV，%）。ELISA檢測時，試劑盒室溫平衡30min后進行A、B、C、D四種實驗方法檢測，其中A法按說明書使用常規(guī)方法進行孵育，B、C、D法均使用酶標板快速孵育器進行孵育，其中B法孵育時間選用原來1/2時間，C法孵育時間選用原來1/3時間，D法孵育時間選用原來1/4時間，具體孵育時間見表1，其他操作步驟嚴格遵守說明書進行。

表1　不同方法ELISA實驗孵育時間

3.3ELISA方法檢測 使用臨床收集樣本進行ELISA檢測，樣本隨機順序加樣，ELISA檢測方法同3.2。記錄樣本S/CO的值（S/CO＜1為陰性，S/CO≥1為陽性）。

4 結果統(tǒng)計

A法與化學發(fā)光法（E法）進行比較，B、C、D法再分別和A法進行比較，分別計算臨界值樣本、陰性值樣本、陽性值樣本符合率。所有結果均使用S/CO值進行計算，使用SPSS統(tǒng)計軟件對實驗結果進行χ2檢驗。

結果

實驗設置陰性、陽性對照，根據(jù)說明書標準，陰性質(zhì)控結果吸光度值＜0.10、陽性質(zhì)控結果吸光度值＞0.80時實驗結果有效。實驗中陰性質(zhì)控結果吸光度均值0.007，陽性質(zhì)控結果吸光度均值3.93，實驗結果有效。

A法與E法檢測結果比較見表2。結果顯示，ELISA試劑盒推薦方法檢測結果與化學發(fā)光法結果完全一致，與化學發(fā)光法比較方法無差異（P＞0.05）。

表2　A法與E法檢測HBsAg陰陽性情況

A、B、C、D法批內(nèi)重復性實驗（精密度）判斷標準為說明書要求的精密度變異系數(shù)（CV，%）≤15%。精密度結果使用S/CO值進行計算。實驗結果顯示，精密度均在15%以內(nèi)。見表3。

表3　A、B、C、D法檢測HBsAg精密度結果

實驗結果顯示（表4至表6），用酶標板快速孵育器進行實驗，使用北京萬泰生物藥業(yè)HBsAg診斷試劑盒，當時間縮短為原來的1/2、1/3時，陰性陽性結果與A法完全一致（P＞0.05），敏感性100%，特異性100%，符合率100%；當時間縮短為原來的1/4時，陰性結果完全一致，陽性結果有6例不符，且均在臨界值樣本，敏感性 93.3%，特異性 100%，樣本符合率80%，與A法有差異（P＜0.05）。

表4　A、B、C、D法檢測HBsAg陰陽性情況

表5　B、C、D法檢測HBsAg敏感性特異性情況

表6　B、C、D法檢測HBsAg陰陽性符合率情況

討論

ELISA檢測方法是臨床檢驗最為常用的實驗方法之一，其操作簡便、成本低、特異性好、靈敏度高［3-4］，無需特殊儀器，易于推廣和標準化。但是其操作時間長，孵育時間約占到實驗總時間的一半，每天可檢測的數(shù)量有限。如果可以縮短實驗流程將會提高工作效率。

本文乙肝表面抗原ELISA檢測方法的原理為雙抗體夾心法［5］，即先將抗體結合到某種固相載體表面，然后加入待測抗原樣本，再加入酶標抗體，形成雙抗體夾心結構，最后加入底物進行顯色，由于酶的催化效率很高，故可放大反應效應，從而使測定方法達到很高的敏感度。整個實驗過程中，每一步抗原抗體的反應均需要相應的孵育，孵育時間合適才能使抗原抗體有效的結合，最終得到可信的結果。

常規(guī)ELISA實驗的孵育［6］都是在水浴鍋或者溫箱里進行的，升溫曲線較慢，50～60min樣本溫度才能趨于37℃恒溫點，而且溫箱或水浴鍋存在受熱不均勻、溫度不準確或ELISA反應板周圍環(huán)境可達到預期溫度而孔內(nèi)溫度不能達到等問題。

酶標板快速孵育器主要通過發(fā)熱模塊產(chǎn)生空氣循環(huán)加熱，同時使用多個方向風扇旋轉(zhuǎn)使孵育腔內(nèi)形成流動氣體，保證溫度的均勻性。其核心快速功能是采用特有的微處理溫控技術，加快孵育樣本升溫曲線，使樣本溫度快速穩(wěn)定達到最佳孵育恒溫點（常規(guī)水浴等方式的升溫曲線較慢，50～60min樣本溫度才能趨近于37℃恒溫點，而快速孵育方式可控制在10min以內(nèi)趨近恒溫點）；同時孵育全過程中結合振蕩，促進抗原抗體結合，能一定程度上增加試劑的靈敏度。從圖1中的曲線4可以看出，酶標板在恒溫箱中，微孔液體從常溫狀態(tài)要升到最佳孵育的恒溫線（一般為37℃）處，需要較長的升溫過程。實驗證明，要達到接近恒溫線的E點，需要50min以上，而從E到F點最佳孵育段，僅需要5min即可。由此可見，整個孵育過程，絕大部分時間浪費在較長的升溫過程上。而酶標板快速孵育器是在短時間內(nèi)將孵育室溫度升到高于恒溫點4℃以上，拉大孵育室腔體空氣與酶標板微孔液體的溫差，當曲線（2）酶標板溫度離恒溫點還差1～2℃時，此時曲線1孵育室腔體溫度也升到最高點B（此點根據(jù)室溫實際情況自動設置，一般高于恒溫點4～10℃以內(nèi)），然后斷開加熱，鼓風機繼續(xù)排風快速降溫。降溫過程溫差仍然很大，酶標板繼續(xù)升溫，當?shù)竭_接近恒溫點的C點時，孵育室溫度也迅速降到恒溫點恒溫，以保證微孔液體在不超過37℃的同時與孵育室在恒溫點趨于一致的情況下進行孵育。

本實驗使用酶標板快速孵育器進行孵育，在達到相等孵育效果的前提下，可大大節(jié)省孵育時間。根據(jù)抗原抗體反應原理，在一定的溫度范圍內(nèi)，反應的溫度升高，分子運動加快，可以使反應的時間縮短［7］，酶標板快速孵育器就是采用前期加溫造就一個孵育室高溫環(huán)境，使酶標板與孵育室的溫差增大而快速升溫。當酶標板的溫度接近最佳孵育的恒溫點時，此時孵育室的溫度也迅速降到恒溫點恒溫，大大縮短酶標板的升溫時間，從而達到快速孵育的目的。

根據(jù)ISO15189醫(yī)學實驗室-質(zhì)量和能力的專用要求，乙肝表面抗原為定性檢測，實驗室使用新方法時需要進行驗證。本文對批內(nèi)重復性（精密度）、臨界值、陰性值、陽性值的符合率進行了驗證，ELISA試劑盒推薦方法和酶標板快速孵育法的重復性均符合標準。以HBsAg檢測為例進行應用快速孵育法優(yōu)化酶聯(lián)免疫吸附實驗的結果顯示，在孵育時間縮短到原來的1/2、1/3時，陰性、陽性低值、陽性中值、陽性高值樣本符合率達到100%；在孵育時間縮短到原來的1/4時，陽性低值即臨界值樣本符合率80.0%，小于95%，故該孵育時間不可采用。臨床上臨界值樣本結果的判讀十分重要，誤讀會導致結果不準確，影響醫(yī)生對病情的治療，故建議使用酶標板快速孵育器進行實驗時，時間最短縮短為原來的1/3。

通過實驗證實，酶聯(lián)免疫吸附實驗時，快速孵育法可滿足臨床檢測，可以通過縮短孵育時間提高整個實驗時間，提高工作效率。酶標板快速孵育法可用于ELISA實驗孵育，但具體孵育時間需在自己實驗室對具體實驗項目進行摸索、驗證。

［1］Wongkamchai S，Satimai W，Loymek S，et al.An ELISA kit with two detectionmodesforthediagnosisoflymphaticfilariasis.J Helminthol，2015，89（5）：552-558.

［2］李曉霞，遲偉群，姚玉虹，等.溫濕度對高通量ELISA檢測系統(tǒng)檢測梅毒螺旋體抗體影響的分析.標記免疫分析與臨床，2015，22（1）：46-51

［3］Weng Z，Zhao Q.Utilizing ELISA to monitor protein-protein interaction.Methods Mol Biol，2015，1278：341-352.

［4］Williams S，Schulz P，Sierks M R.A sensitive phage-based capture ELISA for sub-femtomolar detection of protein variants directly from biological samples.Biotechnol Prog，2015，31（1）：289-298.

［5］王蘭蘭，許化溪.臨床免疫學檢驗.第5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：83.

［6］Garber E A，Thole J.Application of microwave irradiation and heat to improve gliadin detection and ricin ELISA throughput with food samples.Toxins（Basel），2015，7（6）：2135-2144.

［7］馬小燕，張弘.ELISA不同孵育條件HBsAg檢測結果的比較.廣西醫(yī)科大學學報，2010，27（3）：440-441.

（張增武編輯）

Evaluation of Rapid Incubation Optimization Process of Enzyme-linked Immunosorbent Assay on Hepatitis B Surface Antigen Detection

LIU Li，HE Lu，KONG Fan-hong，CAO Jing-li，WANG Ya-jie
（Beijing Tian Tan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China）

Objective To evaluate the rapid incubation of enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）on hepatitis B surface antigen.The goal is to reduce the incubation time in order to improve operational efficiency.Methods Hepatitis B surface antigen positive samples detected by chemiluminescence were used in the study.The samples were divided into 3 groups with 30 cases in each group based on the posititivity value，highly positive，borderline positive，negative samples.All samples were tested with ELISA kit both by standard method recommended by manufacturer and by fast incubation method.The results were comparated and analyzed.Results When incubation time was shortened to one-half and one-third of standard time，the results from rapid incubation method and chemiluminescence detection matched 100%.When the time is shortened to one quarter of standard time the results from rapid incubation method and chemiluminescence detection matched 100%in all highly positive samples.For the borderline samples，results from both methods matched 100%.For fast incubation method，there were 6 results which were inconsistent with chemiluminescence，80%.Conclusion The study confirmed that ELISA rapid incubation method satisfied the use of clinical testing；the incubation time may be reduced to one-third or one-half of recommended time.The rapid incubation method will improve the work efficiency in clinical laboratories.

ELISA； Rapid Incubation

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.09.028

2015-12-24；

2016-01-07

家自然科學基金（81572474）；首都醫(yī)科大學校長基金（2015JYY80）；北京市中醫(yī)藥科技發(fā)展資金項目（JJ2015-14）

王雅杰。E-mail：tiantanwyj@aliyun.com