彭潔，易兵，戚青林

（江西省萍鄉(xiāng)市婦幼保健院，萍鄉(xiāng)337000）

精液優(yōu)化是輔助生殖技術(shù)中男性精子優(yōu)選的重要手段，但優(yōu)化過程的操作時間及力度、離心力、離心時間等因素均可造成精子DNA損傷[1]。采用密度梯度法優(yōu)化精液大概耗時40-60min，優(yōu)化后精液經(jīng)孵育后行IUI手術(shù)，但是孵育時間的長短及與臨床結(jié)局的關(guān)聯(lián)還不明確，缺乏相關(guān)指南及標(biāo)準(zhǔn)。優(yōu)化后的的精子具有運(yùn)動活躍、濃度高的特點(diǎn)，孵育后可促進(jìn)精子的獲能[2]，有利于受精，但精子碰撞及ROS水平均增多，反而可能促進(jìn)DNA損傷及自發(fā)頂體反應(yīng)的發(fā)生，因此確定獲得最佳臨床結(jié)局的孵育時間閾值具有重要意義。本研究旨在探討IUI精液優(yōu)化后孵育時間的最佳范圍。

1 資料與方法

1.1 一般資料 對2016年1月-2019年1月萍鄉(xiāng)市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科完成的IUI周期進(jìn)行回顧性分析。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴女方年齡＜35歲；⑵進(jìn)入IUI周期前篩查精子DNA碎片率（DFI）＜30%，精子自發(fā)頂體反應(yīng)率（AR）＜10%；⑶采用非連續(xù)密度梯度法優(yōu)化精液，優(yōu)化后PR總數(shù)≥5×106。排除標(biāo)準(zhǔn)：采用上游法處理；優(yōu)化后PR總數(shù)＜5×106；女方年齡＞35歲。最終納入168個IUI周期，其中促排卵周期122個，自然周期46個；男方年齡(33.02±4.70)歲，女方年齡(30.94±2.03)歲。收集優(yōu)化后精液孵育時間、臨床妊娠、自然流產(chǎn)及活產(chǎn)等資料，并分析優(yōu)化后精液孵育時間與精子DFI、自發(fā)AR率及IUI臨床結(jié)局的相關(guān)性。

1.2 方法

1.2.1 精液優(yōu)化方案 采用非連續(xù)密度梯度離心法：包括梯度液配置、加樣、分離、洗滌等步驟。梯度液（SAGE）配置：上層1.5ml 40%梯度液+下層1.5ml 80%梯度液，加樣：在40%梯度液上方加入1.5ml完全液化的精液，分離：400g離心20min，洗滌：沉淀轉(zhuǎn)移至4ml精子洗液，200g離心5min，沉淀加入適量G-IVF，最終體積0.6ml，37℃孵育備用，并記錄孵育時間（即從精液優(yōu)化完成后至送入宮腔前的時間間隔）。

1.2.2 精子DNA碎片檢測 分別收集精液優(yōu)化完成、孵育完成時的兩份標(biāo)本各20μl用于精子DNA碎片的檢測。試劑盒采用安科生物《精子DNA碎片檢測試劑盒》。精子DNA碎片檢測采用SCD法，包括制片、變性、裂解、洗滌、脫水、染色等步驟。400光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)。精子DNA碎片指數(shù)（DFI）=（小暈環(huán)精子數(shù)+無暈環(huán)精子數(shù)）/計(jì)數(shù)精子總數(shù)×100%。

1.2.3 精子自發(fā)頂體反應(yīng)檢測 分別收集精液優(yōu)化完成、孵育完成時的兩份標(biāo)本各20μl用于精子自發(fā)頂體反應(yīng)的檢測。試劑盒采用安科生物《精子自發(fā)頂體反應(yīng)檢測試劑盒》。精子自發(fā)頂體反應(yīng)檢測采用PSA-FITC染色，包括制片、固定、染色、熒光顯微鏡觀察等步驟。用450-490nm激發(fā)光，于400倍鏡下觀察并計(jì)數(shù)精子200條以上。頂體完整（AI）：精子頭部一半以上熒光染色明亮且均勻；已發(fā)生頂體反應(yīng)（AR）：精子僅在赤道帶出現(xiàn)熒光帶或者頂體區(qū)沒有熒光染色；頂體異常：除上述兩類精子外的所有精子，該類精子不計(jì)數(shù)。自發(fā)頂體反應(yīng)率=AR精子數(shù)/計(jì)數(shù)精子總數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用()表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。多組間比較則采用單因素ANOVA分析。均以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 優(yōu)化后精液孵育時間對精子DFI的影響 與孵育前比較，孵育46-60min、61-90min、91-120min后的精子DFI均顯著升高 （P＜0.05）。單因素ANOVA分析結(jié)果顯示，孵育前各組精子DFI比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；孵育后各組精子DFI比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=5.516，P=0.000），孵育61-90min、91-120min組的精子DFI均顯著高于0-15min、16-30min、31-45min、46-60min組(P＜0.05)，見表1。

2.2 優(yōu)化后精液孵育時間對精子自發(fā)頂體反應(yīng)率的影響 與孵育前比較，孵育46-60min、61-90min、91-120min后的精子自發(fā)AR率均顯著升高（P＜0.05）。單因素ANOVA分析結(jié)果顯示，孵育前各組精子自發(fā)AR率比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；孵育后各組精子自發(fā)AR率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=7.424，P=0.000），61-90min、91-120min的精子自發(fā)AR率均顯著高于0-15min、16-30min、31-45min、46-60min（P＜0.05），見表2。

2.3 優(yōu)化后精液孵育時間對IUI臨床結(jié)局的影響當(dāng)孵育時間0-45min時，臨床妊娠率逐漸升高，31-45min妊娠率最高；孵育時間46-120min時，臨床妊娠率逐漸下降，但各組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組自然流產(chǎn)率、活產(chǎn)率比較也均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表3。

表1 優(yōu)化后精液孵育時間對精子DFI的影響

表2 優(yōu)化后精液孵育時間對精子自發(fā)頂體反應(yīng)率的影響

表3 優(yōu)化后精液孵育時間對IUI臨床結(jié)局的影響(%)

3 討論

精子獲能是指成熟精子經(jīng)過一系列生理生化變化獲得受精能力的過程，人工授精的精子主要通過體外途徑獲能，因?yàn)橄盗芯酉匆?、受精液中均含有葡萄糖、乳酸鹽、丙酮酸鹽和白蛋白等能量物質(zhì)，在體外37℃孵育適當(dāng)時間可完成精子獲能[3]。體外孵育雖然有利于精子獲能，但也可能會造成精子損傷，因?yàn)閮?yōu)化后的精子濃度及活力均較高、多呈直線運(yùn)動、且運(yùn)動速度快，極大地增加了精子的碰撞機(jī)率、能量損耗及ROS水平，損傷精子DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)成分，從而影響精子的受精能力[4]。本研究結(jié)果顯示，孵育后精子DFI、自發(fā)AR率隨時間增長呈逐漸升高趨勢，孵育0-45min對精子DFI及自發(fā)AR率并無明顯影響；而孵育46-120min時，精子DFI及自發(fā)AR率顯著高于孵育前，與梁嘉穎[5]等報(bào)道的正常、少、弱、畸形精子癥患者優(yōu)化后精液孵育40min后精子質(zhì)量顯著降低的結(jié)果類似。Enkhmaa[6]等研究顯示隨孵育時間增長（1h、4h與18h）ROS水平逐漸升高，提示高濃度精子產(chǎn)生大量的ROS，可能是導(dǎo)致DNA損傷及精子質(zhì)量下降的重要原因。在體外獲能培養(yǎng)液中，自發(fā)AR率隨孵育時間延長呈依賴性增長，而發(fā)生自發(fā)頂體反應(yīng)的精子則喪失了受精能力，導(dǎo)致受精率降低。段彪[7]等研究顯示優(yōu)化后精液獲能1h時的IVF受精率顯著高于2h及4h，華月琴[8]等研究顯示優(yōu)化后精液獲能0.5h時可獲得最好的IVF受精率，提示孵育獲能0.5-1h有利于精卵受精，可能與精子自發(fā)頂體反應(yīng)率較低有關(guān)，與本研究結(jié)果類似。

此外還發(fā)現(xiàn)孵育時間31-45min時IUI臨床妊娠率最高，但各組妊娠率、自然流產(chǎn)率及活產(chǎn)率比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與梁嘉穎[9]等報(bào)道的優(yōu)化后精液孵育20-39 min IUI臨床妊娠率最高類似。FAUQUE[10]等研究也顯示優(yōu)化后精液孵育40-80min可獲得最高的臨床妊娠率?？赡茉?yàn)榉跤龝r間過短可導(dǎo)致精子染色體解凝度降低[11]，過長則促進(jìn)精子DNA損傷及自發(fā)頂體反應(yīng)率的發(fā)生，降低精子受精能力，孵育31-45min可能是獲得IUI妊娠的適宜時間。此外，本研究發(fā)現(xiàn)孵育時間46-120min時，自然流產(chǎn)率呈逐漸升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。精子DNA碎片率高是導(dǎo)致自然流產(chǎn)的主要男方因素，孵育時間過長導(dǎo)致精子DNA損傷加劇，可能是IUI流產(chǎn)率升高的原因，樣本量少可能是導(dǎo)致臨床結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的原因。

綜上所述，精液優(yōu)化后孵育時間越長，對精子DNA完整性及精子受精能力均會產(chǎn)生不利影響，但臨床結(jié)局變化并不明顯，這可能與樣本量較少有關(guān)。關(guān)于IUI精液優(yōu)化后孵育時間對精子功能及臨床結(jié)局的影響，仍需多中心大樣本的研究，從而發(fā)現(xiàn)獲得最佳臨床結(jié)局的孵育時間閾值，有利于各生殖中心IUI實(shí)驗(yàn)室精液獲能條件的標(biāo)準(zhǔn)化。