任松潔,呂 娟,李 婧,王贊宏*

(1山西醫(yī)科大學(xué)附屬白求恩醫(yī)院婦產(chǎn)科,太原 030032;2山西晉城無煙煤礦業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司總醫(yī)院婦產(chǎn)科;*通訊作者,E-mail:wangzanhong@126.com)

子宮頸癌是影響全球女性健康的第二大惡性腫瘤,目前已經(jīng)明確高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的感染與宮頸癌有著十分密切的關(guān)系,宮頸癌HPV的檢出率高達(dá)99.7%,其中HPV16、18是其主要亞型,主要通過癌蛋白E5、E6、E7發(fā)揮致癌作用[1]。但事實(shí)上并非所有HPV感染的患者均有宮頸癌的發(fā)生,提示必然存在其他因素也參與了這一過程[2]。人體具有天然的抗病毒感染屏障,近來研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)在病毒感染和致病過程中具有重要意義[3,4]。當(dāng)HPV感染人體后,會(huì)產(chǎn)生多種病毒蛋白,在這樣的情況下錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)就會(huì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)聚集,導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能紊亂,即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS),如果這一過程持續(xù)存在會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[5]。但是,腫瘤細(xì)胞此時(shí)會(huì)通過蛋白降解將這些錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)清除,從而使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能修復(fù)避免死亡。蛋白質(zhì)的降解主要包括兩條通路:泛素—蛋白酶體通路和自噬—溶酶體通路。一直以來都認(rèn)為這兩條通路是相互獨(dú)立的,但近來發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能和自噬之間存在相互關(guān)聯(lián)[6,7],并且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解蛋白Derlin-1可能是兩者間可能的對(duì)話分子。同時(shí)Derlin-1表達(dá)異?？蓪?dǎo)致腫瘤等多種疾病,并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后等密切相關(guān)[8]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)HPV16 E6過表達(dá)可以使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物GRP78和自噬蛋白Beclin 1表達(dá)增加[9],本研究擬在此基礎(chǔ)上探討HPV16 E6過表達(dá)后Derlin-1表達(dá)的變化,以及Derlin-1表達(dá)變化對(duì)自噬蛋白的影響,旨在發(fā)現(xiàn)兩條蛋白通路間的對(duì)話分子。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Derlin 1(N-20,sc-46913)多克隆抗體、Beclin1(H-300,sc-11427)多克隆抗體,GRP78(H-129,sc-13968)多克隆抗體和β-actin(C4,sc-47778)單克隆抗體購買自Santa Cruz公司,P62(D5E2,8025S)多克隆抗體購買自Cell Signaling公司。lipofectamine2000、G418購自美國Invivogen公司。Tunicamycin(TM)購自美國Sigma Aldrich公司。細(xì)胞組織裂解液RIPA及蛋白酶抑制劑PMSF購自上海申能博彩公司,BCA蛋白定量試劑盒為美國PIERCE公司產(chǎn)品,DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清為浙江天杭生物科技股份有限公司產(chǎn)品,宮頸癌細(xì)胞株C33A購自美國典型物種保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC),由本實(shí)驗(yàn)室保種。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 載體構(gòu)建 HPV16 E6真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-HPV16 E6[9]、Derlin-1的干擾質(zhì)粒PSUPER-siDerlin-1[10]由本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建并保存。

1.2.2 C33A細(xì)胞培養(yǎng) 將人宮頸癌細(xì)胞C33A置于加入含有100 μg/ml鏈霉素、100 μg/ml青霉素和10%胎牛血清的DMEM(Gibco Invitrogen美國)培養(yǎng)基中,在5% CO2,37 ℃濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 HPV16 E6真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C33A細(xì)胞 將宮頸癌C33A細(xì)胞以每孔5×105個(gè)細(xì)胞濃度于6孔板中接種,參照lipofectamine 2000的操作說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染,分別取pcDNA3.1(-)-HPV16 E6、pcDNA3.1(-)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C33A細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24 h后用G418篩選(濃度為500 μg/ml),篩選3周后,選取陽性克隆細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。并將兩組細(xì)胞分別命名為:pcDNA3.1(-)-HPV16 E6組和pcDNA3.1(-)組,未做處理的C33A細(xì)胞設(shè)為空白對(duì)照組。

1.2.4 Derlin-1的干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染經(jīng)篩選的C33A細(xì)胞 選擇穩(wěn)定表達(dá)HPV16 E6的人宮頸癌細(xì)胞C33A細(xì)胞,培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期,分別取PSUPER-siDerlin-1和PSUPER質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞,具體方法同1.2.3,分別計(jì)算數(shù)10個(gè)200倍視野中熒光的細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分比。并將兩組細(xì)胞分別命名為:PSUPER-siDerlin-1組和PSUPER組,未再做處理的穩(wěn)定表達(dá)HPV16 E6的人宮頸癌細(xì)胞C33A設(shè)為空白對(duì)照組。

1.2.5 Western blot檢測(cè)HPV16 E6、Beclin1、P62和GRP78、Derlin 1蛋白的表達(dá)水平 預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次,6孔板每孔細(xì)胞加入100 μl RIPA和1 μl PMSF,收集細(xì)胞放置于冰上30 min,離心,上清液即為總蛋白粗提液。BCA法測(cè)定蛋白含量,取50 μg總蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳,通過半干電轉(zhuǎn)移法將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h,加入HPV16 E6多克隆抗體(工作濃度1 ∶300),Beclin1多克隆抗體(工作濃度1 ∶750),P62多克隆抗體(工作濃度1 ∶500),GRP78多克隆抗體(工作濃度1 ∶100),Derlin 1多克隆抗體(工作濃度1 ∶400);4 ℃冰箱振蕩過夜,次晨用含0.1% Tween20的TBST洗滌,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗(工作濃度1 ∶10 000),室溫孵育1 h,TBST洗3遍,TBS洗膜,在PVDF膜上均勻地涂抹化學(xué)發(fā)光底物,暗室內(nèi)X線片曝光顯影,在凝膠成像分析系統(tǒng)中成像并測(cè)量特異性條帶的表達(dá)強(qiáng)度。

1.2.6 Tunicamycin(TM)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 將TM以2 mg/ml的濃度溶解于二甲基亞砜中,-20 ℃保存。C33A細(xì)胞以每孔5×105個(gè)細(xì)胞濃度接種于6孔板中,24 h后以2 μg/ml TM處理24 h,終止反應(yīng),PBS洗2次,收集細(xì)胞備用。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)錄入SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fishier確切概率,計(jì)量數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析,多組間兩兩比較用SNK法,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TM對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78和Derlin-1表達(dá)的影響

以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑TM處理C33A細(xì)胞24 h,Western blot檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物GRP78和Derlin-1的表達(dá),結(jié)果顯示,TM處理前后GRP78/β-actin的灰度比值分別是0.37±0.21和0.62±0.17,Derlin-1/β-actin的灰度比值分別是0.13±0.05和0.32±0.11,表明TM處理C33A細(xì)胞24 h后,GRP78和Derlin-1表達(dá)明顯增加(P<0.05,見圖1)。提示TM成功誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,并激活泛素—蛋白酶體通路。

與TM處理前相比,*P<0.05圖1 TM對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78和Derlin-1表達(dá)的影響Figure 1 Effect of TM on the expression of endoplasmic reticulum stress proteins GRP78 and Derlin-1 by Western blot

2.2 TM對(duì)自噬蛋白Beclin 1和P62表達(dá)的影響

以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑TM處理C33A細(xì)胞,Western blot檢測(cè)自噬蛋白Beclin 1、P62的表達(dá),結(jié)果顯示,TM處理前后Beclin 1/β-actin的灰度比值分別是0.24±0.13和0.59±0.14,P62/β-actin的灰度比值分別是0.71±0.25和0.13±0.05,表明TM處理C33A細(xì)胞24 h后,Beclin 1表達(dá)增加,而P62表達(dá)降低(P<0.05,見圖2),提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)自噬—溶酶體通路被激活。

與TM處理前相比,*P<0.05圖2 TM對(duì)自噬蛋白Beclin 1和P62表達(dá)的影響Figure 2 Effect of TM on the expression of Beclin 1 and P62 proteins by Western blot

2.3 HPV16 E6過表達(dá)對(duì)GRP78、Derlin-1、Beclin 1、P62表達(dá)的影響

用不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C33A細(xì)胞,pcDNA3.1(-)-HPV16 E6組、pcDNA3.1(-)組和空白對(duì)照組HPV16 E6/β-actin的Western blot灰度比值分別是0.74±0.19,0.45±0.21和0.38±0.22;pcDNA3.1(-)-HPV16 E6組HPV16 E6表達(dá)增加,明顯高于pcDNA3.1(-)組和空白對(duì)照組(P<0.05),證明轉(zhuǎn)染成功。Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78、Derlin-1和自噬蛋白Beclin 1、P62的表達(dá)變化,可以看出當(dāng)HPV16 E6過表達(dá)后GRP78、Derlin-1表達(dá)增加(P<0.05),自噬蛋白Beclin 1表達(dá)增加(P<0.05),P62的表達(dá)降低(P<0.05,見圖3),這與TM干預(yù)C33A后結(jié)果相同。

與pcDNA3.1(-)組和空白對(duì)照組相比,*P<0.05圖3 HPV16 E6過表達(dá)對(duì)GRP78、Derlin-1、Beclin 1、P62表達(dá)的影響Figure 3 Effect of overexpression of HPV16 E6 on the expression of GRP78, Derlin-1, Beclin 1, P62 by Western blot

2.4 抑制Derlin-1蛋白表達(dá)對(duì)自噬通路的影響

選擇穩(wěn)定表達(dá)HPV16 E6的人宮頸癌細(xì)胞C33A細(xì)胞,分別取PSUPER-siDerlin-1和PSUPER質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞,Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中Derlin-1和自噬蛋白Beclin 1、P62的表達(dá)變化,結(jié)果顯示,與PSUPER組和空白對(duì)照組比較,PSUPER-siDerlin-1組Derlin-1表達(dá)降低,自噬蛋白Beclin 1表達(dá)增加,同時(shí)P62表達(dá)也增加(P<0.05,見圖4),提示自噬流被阻斷,Derlin-1同時(shí)參與自噬—溶酶體通路。

與PSUPER組和空白對(duì)照組相比,*P<0.05圖4 抑制Derlin-1對(duì)Derlin-1、Beclin 1、P62表達(dá)的影響Figure 4 The effect of inhibition of Derlin-1 on the expression of Derlin-1, Beclin-1 and P62 proteins by Western blot

3 討論

Derlin-1是一個(gè)多功能蛋白,最初發(fā)現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中表達(dá)增加,參與錯(cuò)誤折疊和未折疊蛋白的逆向轉(zhuǎn)運(yùn),從而使其降解,使細(xì)胞免于凋亡,以幫助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)恢復(fù)穩(wěn)態(tài)。近來研究發(fā)現(xiàn)Derlin-1表達(dá)異常與腫瘤等多種疾病有關(guān):Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)Derlin-1在正常乳腺中幾乎不表達(dá),而在乳腺癌組織中過度表達(dá),并且與腫瘤的分級(jí)及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有關(guān),其機(jī)制為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起Derlin-1在乳腺癌組織中過度表達(dá),保護(hù)乳腺癌細(xì)胞免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的凋亡。肺癌中的研究也提示Derlin-1可在61.86%非小細(xì)胞肺癌中表達(dá),并與腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移及腫瘤的TNM分期有關(guān),Derlin-1的高度表達(dá)與肺癌病人的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[12]。本課題組在既往的研究中發(fā)現(xiàn)抑制自噬可以加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,進(jìn)而導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞凋亡[13]。本研究擬了解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解蛋白Derlin-1是否通過參與自噬過程執(zhí)行其癌基因的功能。

病毒感染會(huì)產(chǎn)生大量的癌蛋白,這些蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的聚集會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,HPV也是這樣,HPVE6、E7等癌蛋白的堆積會(huì)引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生,此時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志物GRP78表達(dá)增加,自噬被激活,通過自噬—溶酶體通路使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能修復(fù)避免死亡[14]。近來發(fā)現(xiàn)泛素—蛋白酶體通路和自噬—溶酶體通路之間存在關(guān)聯(lián),Derlin-1可能是兩者間的對(duì)話分子[5,6]。本研究先采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激動(dòng)劑TM處理宮頸癌C33A細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)GRP78表達(dá)增加,表明TM成功誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。同時(shí)Derlin-1的表達(dá)也明顯增加,表明在此情況下泛素—蛋白酶體通路被激活。隨后檢測(cè)自噬蛋白Beclin 1、P62的表達(dá),發(fā)現(xiàn)Beclin 1表達(dá)增加,表明自噬啟動(dòng),P62表達(dá)降低表明自噬溶酶體降解,自噬流暢通,提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)自噬—溶酶體通路激活。之后采用HPV16 E6過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宮頸癌C33A細(xì)胞,使HPV16 E6癌蛋白過度表達(dá),發(fā)現(xiàn)在此種情況下,發(fā)生了TM出來C33A細(xì)胞后相同的效應(yīng),即誘發(fā)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(GRP78表達(dá)增加),同時(shí)Derlin-1、Beclin 1的表達(dá)增加,P62表達(dá)減少,提示當(dāng)病毒蛋白作用于C33A細(xì)胞后,誘發(fā)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,此時(shí)泛素—蛋白酶體通路和自噬—溶酶體通路均被激活,以緩解細(xì)胞的壓力,避免凋亡。

為了解Derlin-1是否通過參與自噬過程,本研究采用RNA干擾技術(shù)沉默了過表達(dá)HPV16 E6細(xì)胞中Derlin-1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)伴隨Derlin-1表達(dá)的降低,Beclin 1的表達(dá)并未出現(xiàn)明顯的變化,而p62的表達(dá)卻出現(xiàn)增加,提示當(dāng)Derlin-1的表達(dá)降低后,自噬的啟動(dòng)過程并沒有受到影響,但是自噬溶酶體的降解被阻斷,自噬流受阻。提示在HPV16感染的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激環(huán)境下,敲除Derlin-1可以影響P62蛋白的降解,導(dǎo)致自噬通路的受阻,Derlin-1在自噬溶酶體降解階段參與了自噬過程,Derlin-1可能是泛素—蛋白酶體通路和自噬—溶酶體通路之間的對(duì)話分子,兩條蛋白質(zhì)的降解通路可能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中發(fā)揮協(xié)同作用,維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài),這一機(jī)制可能參與了HPV16的致宮頸癌過程。