付 慧,常 芬,王浩玉,白 芃,康 杰

(1山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院科技中心,汾陽 032200;2山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系病原生物學(xué)與病原生物學(xué)檢驗教研室;3北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室;4山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部解剖教研室;*通訊作者,E-mail:fuhui132@163.com)

應(yīng)激是引起情緒異常、自身免疫性疾病、感染性疾病、心血管疾病及腫瘤的一個危險因素[1,2]。身體或心理上的應(yīng)激,根據(jù)應(yīng)激程度和持續(xù)時間的不同,會對人和動物的免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生不同的影響[3,4]。急性應(yīng)激和中等程度的應(yīng)激可增強(qiáng)免疫應(yīng)答(可引起遲發(fā)型超敏反應(yīng)的增強(qiáng)),而慢性應(yīng)激如長期的情緒壓力會使免疫功能減弱,引起免疫抑制并增加患病幾率。研究表明,這種免疫功能的減弱,很大一部分原因是淋巴細(xì)胞數(shù)量減少[5,6]。

造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSCs)是一種多潛能成體干細(xì)胞,可分化為所有成熟的血細(xì)胞[7]。造血干祖細(xì)胞(hematopoietic stem-progenitor cells,HSPCs)可從骨髓、臍帶血和外周血中分離獲得[8]。HSC可分化為表達(dá)CD34分子的多潛能祖細(xì)胞,這些細(xì)胞可有效治療多種疾病,尤其是免疫應(yīng)答失調(diào)如過敏性疾病、自身免疫性疾病等[9]。

已有研究表明,慢性約束應(yīng)激可增加糖皮質(zhì)激素的產(chǎn)生,使脾細(xì)胞數(shù)量減少并抑制免疫應(yīng)答[4]。本研究通過將小鼠放入慢性約束應(yīng)激管中,建立小鼠慢性應(yīng)激的體內(nèi)模型;通過用糖皮質(zhì)激素地塞米松處理脾細(xì)胞,建立慢性應(yīng)激的體外模型,觀察CD34+HSPC對慢性約束應(yīng)激小鼠脾細(xì)胞數(shù)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡雄性BALB/c小鼠100只,SPF級,體質(zhì)量20-25 g,購自山東大學(xué)動物實驗中心,生產(chǎn)許可證號:SCXK(魯)2013-0009)。

1.2 主要試劑與儀器

紅細(xì)胞裂解液(博士德生物工程有限公司,中國),生物素化的CD34抗體(eBioscience,美國),磁珠分選試劑盒(BD,美國),CFDA SE細(xì)胞示蹤試劑盒(Invitrogen,美國),細(xì)胞凋亡試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司,中國),1640細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibico,美國),胎牛血清(HyClone,美國),地塞米松(西格瑪奧德里奇公司)。流式細(xì)胞儀(Merck Millipore,美國)。

1.3 慢性約束應(yīng)激小鼠模型的建立

慢性約束應(yīng)激管的制備:取50 ml離心管,用燒熱的鑷子在離心管壁上燙出均勻的孔洞以保持通風(fēng)(6排,每排5孔)。將小鼠放入約束應(yīng)激管中慢性約束應(yīng)激12 h/d(早9:00-晚9:00),應(yīng)激過程中小鼠不能飲水和進(jìn)食;解除約束12 h/d(晚9:00-早9:00),小鼠可自由活動和飲食。連續(xù)處理3 d。

1.4 檢測慢性約束應(yīng)激后小鼠脾細(xì)胞數(shù)的變化

將10只BALB/c小鼠分為2組,每組5只。①慢性應(yīng)激組:建立慢性約束應(yīng)激的小鼠模型,連續(xù)處理3 d;②對照組:正常飼養(yǎng)的小鼠,不施加任何處理。慢性應(yīng)激第3天結(jié)束時,即脫頸處死小鼠,無菌取脾,網(wǎng)搓法提取小鼠脾單細(xì)胞:將脾放到無菌的濾網(wǎng)(200目)上,用無菌EP管管蓋輕輕擠壓、研磨脾,單細(xì)胞通過網(wǎng)篩分散到PBS緩沖液中,收集單細(xì)胞懸液,離心(2 480 r/min,8 min)后加入5 ml紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞5 min。用PBS重懸并用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)。

1.5 CD34+HSPC的提取

取20只正常BALB/c小鼠,獲取小鼠骨髓細(xì)胞:無菌取小鼠的股骨和脛骨,切除骨的兩端,用1 ml注射器吸取預(yù)冷PBS,將骨髓細(xì)胞沖出,離心(2 480 r/min,8 min)后加入5 ml紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞5 min。磁珠分選:將除去紅細(xì)胞后的骨髓細(xì)胞重懸于細(xì)胞染色緩沖液(cell staining buffer)中,加入生物素化的CD34抗體,4 ℃孵育40 min。用1×BD IMagTM緩沖液洗滌,加入鏈霉親和素化的磁珠,徹底混勻后置于磁力架上,孵育10 min。棄去上清,加入1×BD IMagTM緩沖液置于磁力架上(重復(fù)2次)。最后一次棄上清,將細(xì)胞重懸于生理鹽水中備用。

1.6 CD34+HSPC的體內(nèi)干預(yù)實驗

將20只BALB/c小鼠分為4組,每組5只:①HSPC干預(yù)+慢性應(yīng)激組:每只小鼠尾靜脈注射已提前提取出的HSPC(1×106個HSPC懸浮于100 μl生理鹽水),慢性應(yīng)激3 d;②溶劑對照+慢性應(yīng)激組:每只小鼠尾靜脈注射100 μl生理鹽水,慢性應(yīng)激3 d;③HSPC干預(yù)組:干預(yù)方法同第①組,不進(jìn)行慢性應(yīng)激;④溶劑對照組:尾靜脈注射100 μl生理鹽水,不進(jìn)行慢性應(yīng)激。慢性應(yīng)激第3天結(jié)束時,立即取各組小鼠脾,提取脾細(xì)胞并用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)。

1.7 雙染法檢測細(xì)胞凋亡和壞死

提取體內(nèi)干預(yù)實驗中各組小鼠脾細(xì)胞,離心棄上清,用預(yù)冷的細(xì)胞染色緩沖液洗滌1次。加抗體結(jié)合緩沖液(binding buffer)重懸細(xì)胞,加5 μl FITC Annexin Ⅴ染液冰上孵育40 min;加入1.5 μl PI染液冰上染色8 min。用預(yù)冷的PBS洗滌1次,細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞。上機(jī)檢測:調(diào)好流式細(xì)胞儀參數(shù)后收集單個細(xì)胞10 000個;IDEAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,輸出早期凋亡、晚期凋亡、壞死以及活細(xì)胞的百分比。

1.8 CD34+HSPC的體內(nèi)示蹤試驗

取30只正常BALB/c小鼠,磁珠分選法提取小鼠骨髓中CD34+HSPC。用CFDA SE熒光探針對HSPC進(jìn)行標(biāo)記:細(xì)胞懸浮于37 ℃預(yù)熱的含有CFDA SE熒光探針的PBS中(500 μl PBS中加入1 μl熒光探針儲液),37 ℃孵育15 min;離心細(xì)胞,重懸于預(yù)熱的培養(yǎng)基中孵育30 min;再次離心洗滌1次,備用。

將15只BALB/c小鼠分為3組,每組5只:①慢性應(yīng)激1 d組;②慢性應(yīng)激2 d組;③慢性應(yīng)激3 d組。每只小鼠尾靜脈注射熒光標(biāo)記的HSPC(1×106個HSPC懸浮于100 μl生理鹽水),對①②③組小鼠分別進(jìn)行慢性應(yīng)激1,2,3 d。慢性應(yīng)激結(jié)束,立即處死小鼠取脾,網(wǎng)搓法獲得脾細(xì)胞單細(xì)胞懸液后置于細(xì)胞培養(yǎng)皿,熒光顯微鏡觀察帶有綠色熒光的細(xì)胞并拍照,檢測遷移至脾中的CD34+HSPC。

1.9 CD34+HSPC的體外干預(yù)實驗

取5只正常小鼠,磁珠分選法提取小鼠的CD34+HSPC,網(wǎng)搓法提取小鼠的脾細(xì)胞,重懸于含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中備用。

細(xì)胞培養(yǎng)分組及處理:①HSPC干預(yù)+地塞米松組:脾細(xì)胞與HSPC共培養(yǎng),脾細(xì)胞與HSPC比例為10 ∶1,培養(yǎng)液中地塞米松終濃度為1 ng/ml;②脾細(xì)胞+地塞米松組:培養(yǎng)液中地塞米松終濃度為1 ng/ml;③HSPC干預(yù)組:脾細(xì)胞與HSPC比例為10 ∶1,培養(yǎng)液中不加地塞米松;④脾細(xì)胞單獨培養(yǎng)組:培養(yǎng)液中不加地塞米松。培養(yǎng)18 h,收集各組細(xì)胞,用雙染法檢測活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞比例。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計學(xué)軟件GraphPad Prism 5 prism分析,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,兩組間采用t檢驗分析數(shù)據(jù);多組間采用one-way ANOVA分析數(shù)據(jù),再采用Bonferroni檢驗進(jìn)行組間兩兩比較,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性約束應(yīng)激對小鼠脾細(xì)胞數(shù)的影響

細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示,慢性應(yīng)激第3天結(jié)束時,與對照組相比,慢性應(yīng)激組小鼠的脾細(xì)胞總數(shù)顯著減少(P<0.05,見圖1)。

與對照組比較,*P<0.05圖1 慢性約束應(yīng)激對小鼠脾細(xì)胞數(shù)的影響Figure 1 The effect of chronic restraint stress on the number of spleen cells in mice

2.2 CD34+HSPC對慢性約束應(yīng)激小鼠脾細(xì)胞數(shù)的影響

細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示,與溶劑對照+慢性應(yīng)激組相比,HSPC干預(yù)+慢性應(yīng)激組小鼠脾細(xì)胞計數(shù)增加(P<0.05,見圖2),表明CD34+HSPC可使慢性應(yīng)激引起的小鼠脾細(xì)胞數(shù)量得到部分恢復(fù)。

2.3 CD34+HSPC抑制慢性約束應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞的凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,與溶劑對照組相比,溶劑對照+慢性應(yīng)激組小鼠脾細(xì)胞凋亡及壞死比例增加(P<0.05,見圖3);與溶劑對照+慢性應(yīng)激組相比,HSPC干預(yù)+慢性應(yīng)激組小鼠脾細(xì)胞凋亡比例減少,活細(xì)胞比例增加(P<0.05,見圖3),而壞死細(xì)胞比例并未減少。表明慢性約束應(yīng)激誘導(dǎo)脾細(xì)胞的凋亡及壞死,CD34+HSPC可抑制慢性約束應(yīng)激引起的小鼠脾細(xì)胞的凋亡。

與溶劑對照組比較,*P<0.05;與溶劑對照+慢性應(yīng)激組比較,#P<0.05圖2 CD34+HSPC對慢性約束應(yīng)激小鼠脾細(xì)胞數(shù)的影響Figure 2 The effect of CD34+HSPC on the number of spleen cells in mice with chronic constraint stress

與溶劑對照組比較,*P<0.05;與溶劑對照+慢性應(yīng)激組比較,#P<0.05圖3 CD34+HSPC抑制慢性約束應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞的凋亡Figure 3 CD34+HSPC inhibits the apoptosis of spleen cells induced by chronic constraint stress

2.4 慢性約束應(yīng)激過程中CD34+HSPC可遷移至脾中

分別在慢性約束應(yīng)激第1,2,3天完成時,脾細(xì)胞群體中均可觀察到綠色熒光標(biāo)記的HSPC(見圖4)。表明慢性應(yīng)激過程中CD34+HSPC可遷移至脾中。

2.5 CD34+HSPC在體外抑制地塞米松誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞的壞死

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,與脾細(xì)胞單獨培養(yǎng)組相比,脾細(xì)胞+地塞米松組脾細(xì)胞凋亡及壞死比例增加(P<0.05,見圖5)。與脾細(xì)胞+地塞米松組相比,HSPC干預(yù)+地塞米松組脾細(xì)胞壞死比例減少,活細(xì)胞比例增加(P<0.05,見圖5),而凋亡細(xì)胞的比例并未減少。表明,地塞米松可誘導(dǎo)脾細(xì)胞的凋亡及壞死,CD34+HSPC可抑制地塞米松誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞的壞死。

圖4 慢性約束應(yīng)激過程中小鼠脾中出現(xiàn)綠色熒光標(biāo)記的CD34+HSPC (×100)Figure 4 Green fluorescent labeling of CD34+HSPC in spleen cells of mice during chronic constraint stress (×100)

與脾細(xì)胞單獨培養(yǎng)組比較,*P<0.05,**P<0.01;與脾細(xì)胞+地塞米松組比較,#P<0.05圖5 CD34+HSPC在體外抑制地塞米松誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞的壞死Figure 5 CD34+HSPC inhibits the necrosis of spleen cells induced by dexamethasone in vitro

3 討論

流行病學(xué)研究及實驗證據(jù)表明,應(yīng)激可對人的健康產(chǎn)生較大的影響[10]。身體和心理上的應(yīng)激是人類多種疾病的危險因素,如自身免疫疾病和癌癥[11]。

由于HSPC可用于許多疾病的細(xì)胞治療,如:過敏性疾病和自身免疫性疾病,因此本研究探究了HSPC在慢性約束應(yīng)激中的作用。本研究顯示,慢性約束應(yīng)激可引起小鼠脾細(xì)胞數(shù)量減少。HSPC體內(nèi)干預(yù)實驗結(jié)果表明,在慢性約束應(yīng)激的條件下,與未注射HSPC的小鼠相比,HSPC干預(yù)的小鼠脾細(xì)胞數(shù)量增加,表明HSPC可使小鼠脾細(xì)胞數(shù)量得到部分恢復(fù)。進(jìn)一步的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,慢性約束應(yīng)激引起小鼠脾細(xì)胞數(shù)量減少的機(jī)制可能為:引起脾細(xì)胞凋亡及壞死。HSPC干預(yù)可抑制慢性約束應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞的凋亡,但不能抑制其引起的細(xì)胞壞死,因此,HSPC在體內(nèi)是通過減少脾細(xì)胞凋亡而起作用的。另外,體內(nèi)示蹤試驗結(jié)果表明,在慢性約束應(yīng)激1-3 d過程中,CD34+HSPC均可遷移至脾中,可推測HSPC是遷移至脾中受損部位而發(fā)揮修復(fù)作用的。

由于慢性約束應(yīng)激可增加糖皮質(zhì)激素的產(chǎn)生,從而導(dǎo)致脾細(xì)胞數(shù)量減少,因此在本研究的體外實驗中,用地塞米松處理脾細(xì)胞。本研究結(jié)果表明,地塞米松在體外可引起脾細(xì)胞的凋亡及壞死。但HSPC在體外不能抑制脾細(xì)胞的凋亡,卻能顯著減少脾細(xì)胞的壞死,因此,HSPC在體外是通過減少脾細(xì)胞壞死而起作用的。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),HSPC在體內(nèi)外均能在慢性應(yīng)激中起保護(hù)作用,但作用機(jī)制不同,其原因需要進(jìn)行進(jìn)一步的探究。

綜上所述,本研究的體內(nèi)和體外實驗均表明,CD34+HSPC可改善慢性約束應(yīng)激引起的小鼠脾細(xì)胞數(shù)量的減少。但CD34+HSPC在慢性應(yīng)激中起保護(hù)作用的具體細(xì)胞及分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的探索和研究,如:HSPC有可能在脾中增殖分化,也有可能分泌細(xì)胞因子而起作用。本研究初步確定了HSPC在慢性約束應(yīng)激中的保護(hù)性作用,對于改善慢性應(yīng)激所引起免疫抑制的基礎(chǔ)研究具有一定的意義。