李彩麗，王改麗，柳雨竹，艾曉敏，王真真，李 姿，關(guān)繼羽，賀文琦，高 豐，蘭云剛*，陸慧君*

(1.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062；2.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130062 )

豬血凝性腦脊髓炎(porcine hemagglutinating encephalomyelitis,PHE)是由豬血凝性腦脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)感染而引起仔豬的一種急性、高度接觸性傳染病[1]。PHEV是冠狀病毒科β冠狀病毒屬成員，也是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)能侵害外周中樞神經(jīng)系統(tǒng)的冠狀病毒[2-3]，主要侵害哺乳期仔豬。感染仔豬臨床主要表現(xiàn)嘔吐、食欲廢絕與典型的神經(jīng)癥狀[4-5]。近年來(lái)PHEV引起的仔豬發(fā)病率與病死率在逐年增加，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。深入研究PHEV的致病機(jī)制能夠?yàn)镻HE的有效防控提供重要理論依據(jù)。

溶酶體是一種存在于所有真核細(xì)胞中的酸性膜結(jié)合細(xì)胞器，是內(nèi)吞作用、吞噬作用和自噬傳遞大分子降解和再循環(huán)的中心[6]。溶酶體還參與調(diào)控質(zhì)膜修復(fù)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞分解代謝等細(xì)胞內(nèi)多種生理過(guò)程[7]。研究發(fā)現(xiàn)，溶酶體體積增大和溶酶體功能紊亂與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生密切相關(guān)，在多種病毒的致病過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其功能與膜和管腔中的水解酶和酸化蛋白密切相關(guān)。神經(jīng)嗜性的PHEV侵入細(xì)胞后，神經(jīng)細(xì)胞釋放出的病毒粒子被臨近的膠質(zhì)細(xì)胞攝取后，溶酶體囊泡結(jié)構(gòu)將其包裹，可限制病毒進(jìn)一步擴(kuò)散[8-9]。然而，PHEV對(duì)神經(jīng)細(xì)胞溶酶體功能的影響及機(jī)制尚不明確。因此，本研究應(yīng)用PHEV感染神經(jīng)瘤母細(xì)胞(N2a細(xì)胞)的模型，研究溶酶體相關(guān)蛋白的變化及溶酶體對(duì)PHEV復(fù)制影響， 有助于揭示PHEV的分子致病機(jī)理，為進(jìn)一步研究PHE的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)并為該病的科學(xué)防控提供新思路。

1 材料與方法

1.1 病毒和細(xì)胞PHEV株P(guān)HEV-CC14(MF08-3115)[8]、小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞(N2a細(xì)胞)均由吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院病理解剖實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購(gòu)自GIBCO公司；胰蛋白酶購(gòu)自Sigma公司；5×SDS-PAGE Loading Buffer、RAPI蛋白裂解液(p0013-B)、抗熒光衰減封片劑均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；PageRuler預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自賽默飛公司；2×SYBR Green Master Mixture購(gòu)于Bimake公司；BafA1、Anti-mouse IgG (H+L),F(ab′)2 Fragment (Alexa Fluor?594 Conjugate) # 8890熒光二抗均購(gòu)自CST公司；GAPDH抗體、Fluorescein (FITC)-conjugated Affinipure Goat Anti-Rat IgG(H+L)488熒光二抗均購(gòu)自于Proteintech公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RRI、10 mmol/L dNTP、RNAiso Plus Total RNA提取試劑均購(gòu)自TaKaRa公司；溶酶體相關(guān)膜蛋白1(LAMP1)抗體購(gòu)自BD Pharmingen公司(美國(guó))；溶酶體熒光探針Lyso Tracker Red DND-99購(gòu)自Invitrogen公司(美國(guó))；PVDF膜(孔徑為0.45 μm)購(gòu)自Merck Millipore公司；PHEV多抗由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與病毒感染將N2a細(xì)胞接種于6孔板中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至細(xì)胞密度達(dá)到60%～80%時(shí)進(jìn)行PHEV感染試驗(yàn)，以確保接毒后的感染效率。用無(wú)血清的培養(yǎng)液先對(duì)細(xì)胞表面進(jìn)行清洗，之后向培養(yǎng)瓶中緩緩加入0.2 mL的PHEV病毒液(TCID50為10-4.5/0.1 mL)，將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中孵育1 h。隨后，加入含2%血清的DMEM培養(yǎng)液，按試驗(yàn)需求收集感染PHEV不同時(shí)間的細(xì)胞樣品。

1.4 LysoTracker Red標(biāo)記與BafA1處理將N2a細(xì)胞接種于12孔板中無(wú)菌的細(xì)胞爬片上，培養(yǎng)至細(xì)胞的密度能夠達(dá)到60%左右時(shí)，加入0.1 mL PHEV病毒液(TCID50為10-4.5/0.1 mL)，感染48 h后使用50 μmol/L LysoTracker Red在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育45 min以標(biāo)記溶酶體，然后用37℃ PBS洗滌爬片，封片。

經(jīng)BafA1抑制劑(300 μmol/L)預(yù)處理1 h后的N2a細(xì)胞，接種PHEV并以等體積的DMEM作為對(duì)照，孵育1 h后，加入含有相同濃度BafA1的DMEM共培養(yǎng)24 h收集樣品，進(jìn)行后序操作。

1.5 Western blot檢測(cè)用含1 mmol/L PMSF的RAPI蛋白裂解液裂解1.3和1.4收集的細(xì)胞樣品，置于冰上孵育30 min充分裂解蛋白，然后將樣品以12 000 r/min 4℃離心10 min，以去除雜質(zhì)；最后加入上樣緩沖液，于微波爐中煮沸10 min 獲得蛋白樣品。進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳后并電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，10%脫脂奶粉37℃封閉1 h后，分別加入LAMP1、PHEV、GAPDH抗體4℃孵育過(guò)夜；TBST清洗5 min/次，洗5次膜后使用HRP標(biāo)記的二抗孵育，洗膜后ECL顯色，并利用Image J軟件對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析。

1.6 熒光定量PCR檢測(cè)按照1.3和1.4方法處理細(xì)胞后，根據(jù)RNAiso Plus Total RNA提取試劑說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在GenBank中查找編碼PHEV N蛋白的基因(AY078417)，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。PHEV-NFP、5′-CCGGAATTCGGTC-TTTCACTCCTGGCAAG-3′和PHEV-NRP：5′-CG-GGGTACCTTATATTTCTGAGGTATC-3′，將引物序列交由庫(kù)美生物合成。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，回收目的條帶連入pMD18-T載體中，再進(jìn)行質(zhì)粒提取，D260 nm值定量，將質(zhì)粒倍比稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。同時(shí)用同樣的方法設(shè)計(jì)PHEV特異性引物：上游引物5′-TCTGGGAATCCTGACGAG-3′，下游引物5′-AGGCGCTGCAACACTTAC-3′，檢測(cè)PHEV的mRNA表達(dá)水平。熒光定量PCR反應(yīng)體系如下：2×SYBR Green Master Mix 10 μL、cDNA模板2 μL、上下游引物各1 μL、蒸餾水補(bǔ)充至20 μL。反應(yīng)條件：95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。所得數(shù)據(jù)由QuantstudioTMDesign & Analysis Software version 1.5.1軟件分析。

1.7 間接免疫熒光將N2a細(xì)胞接種于含有細(xì)胞爬片的12孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到60%左右時(shí)，接種PHEV并設(shè)置未處理組為空白對(duì)照。48 h后棄去培養(yǎng)基，并用PBS洗3次，使用4%多聚甲醛室溫下固定15 min， 然后PBS洗3次，置于含有0.05%TritonX-100的5%脫脂奶粉37℃透膜封閉1 h 后，加入稀釋好的一抗于4℃孵育過(guò)夜；次日，PBS洗3次后，加入熒光二抗，37℃避光孵育1 h；PBS清洗細(xì)胞爬片，清洗擦干凈后滴加含有DAPI染核的封片劑進(jìn)行封片。最后，根據(jù)不同的染料選擇不同波段的激發(fā)光，使用激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 PHEV感染N2a細(xì)胞后LAMP1蛋白表達(dá)變化收集PHEV感染N2a細(xì)胞48 h后的蛋白樣品，通過(guò)Western blot方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，與空白對(duì)照組相比，接毒組LAMP1蛋白表達(dá)量顯著升高。

2.2 PHEV與溶酶體的共定位分析按照1.7的方法處理PHEV感染48 h的N2a細(xì)胞，用特異性LAMP1單抗和PHEV多抗進(jìn)行標(biāo)記，并且以正常N2a細(xì)胞作為陰性對(duì)照。結(jié)果如圖2A所示，對(duì)照組N2a細(xì)胞中的LAMP1呈現(xiàn)彌散且大小均勻分布，但在感染PHEV的細(xì)胞中，定位于細(xì)胞核周圍的LAMP1聚集呈現(xiàn)明亮的較大囊泡樣，并且與PHEV共定位表達(dá)。此外，通過(guò)對(duì)形態(tài)大小>1 μm的溶酶體數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PHEV感染致溶酶體體積增大(圖2B)。上述結(jié)果表明，PHEV能與神經(jīng)細(xì)胞溶酶體共定位，并使溶酶體體積增大。

2.3 PHEV對(duì)溶酶體pH的影響PHEV感染N2a細(xì)胞48 h后，用溶酶體紅色熒光探針lysotracker進(jìn)行染色，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)熒光染色情況。結(jié)果如圖3A所示，對(duì)照組N2a細(xì)胞中，紅色斑點(diǎn)較少且黯淡，但在感染PHEV的細(xì)胞中，紅色斑點(diǎn)較多且明亮，并通過(guò)Image J軟件對(duì)照組和接毒組的單個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3B。結(jié)果表明，PHEV感染N2a細(xì)胞會(huì)使溶酶體酸性增強(qiáng)。

A.LysoTracker Red標(biāo)記PHEV感染的N2a細(xì)胞；B.單個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度

2.4 間接免疫熒光檢測(cè)BafA1抑制溶酶體酸化的效果按照1.4的方法使用BafA1處理細(xì)胞，使用溶酶體紅色熒光探針lysotracker 進(jìn)行染色45 min，然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞并用特異性LAMP1單抗和PHEV多抗進(jìn)行熒光標(biāo)記。結(jié)果如圖4所示，BafA1抑制劑處理后，溶酶體熒光探針Lyso TrackerRed的紅色熒光強(qiáng)度都減弱，表明用BafA1抑制劑處理后再接種病毒，BafA1抑制劑起到抑制溶酶體酸化的效果。

圖4 間接免疫熒光檢測(cè)BafA1抑制劑預(yù)處理N2a細(xì)胞

2.5 BafA1預(yù)處理N2a細(xì)胞后對(duì)PHEV復(fù)制的影響按照1.4的方法使用BafA1處理細(xì)胞，然后感染PHEV 24 h收集細(xì)胞裂解液樣品，通過(guò)Western blot方法檢測(cè)PHEV的表達(dá)水平。結(jié)果如圖5 A所示，經(jīng)BafA1預(yù)處理細(xì)胞后再感染PHEV，細(xì)胞裂解液中病毒的表達(dá)量明顯低于未處理的感染組。根據(jù)病毒的N基因拷貝數(shù)確定樣品中PHEV基因組RNA的拷貝數(shù)，熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)(圖5B)，胞內(nèi)的PHEV基因組RNA的拷貝數(shù)下降，病毒含量降低。該結(jié)果表明，經(jīng)BafA1抑制劑預(yù)處理N2a細(xì)胞后再感染PHEV，能夠阻礙PHEV在N2a細(xì)胞中的復(fù)制。

A.細(xì)胞裂解液中PHEV N蛋白表達(dá)變化；B.細(xì)胞裂解液中PHEV N基因拷貝數(shù)變化

3 討論

PHEV為β冠狀病毒屬的成員，主要侵害仔豬，尤其是3周齡以內(nèi)的哺乳仔豬感染率最高，被感染仔豬臨床上主要表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀、嘔吐和衰竭等[5,11]。近年來(lái)不斷有豬場(chǎng)暴發(fā)PHE的報(bào)道，豬感染PHEV非常普遍且呈世界性分布，PHEV對(duì)養(yǎng)豬業(yè)存在巨大的危害。此外，2015年美國(guó)密歇根州暴發(fā)新型PHEV，被感染成年豬表現(xiàn)出流感樣癥狀[12]，說(shuō)明PHEV還存在變異流行的風(fēng)險(xiǎn)。因此對(duì)PHEV致病機(jī)制的研究尤為重要。

溶酶體是真核細(xì)胞中廣泛存在的一種富含酸性水解酶的細(xì)胞器，由一個(gè)帶有膜蛋白和酸性管腔的單層脂質(zhì)組成，主要通過(guò)降解內(nèi)源和外源性大分子物質(zhì)來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡；而功能紊亂可導(dǎo)致致病相關(guān)蛋白的過(guò)度積累使正常的細(xì)胞功能逐漸喪失[13-14]。已有研究發(fā)現(xiàn)，溶酶體功能的紊亂與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。溶酶體功能紊亂可導(dǎo)致致病相關(guān)蛋白過(guò)度積累致使疾病發(fā)生[15]，如：溶酶體系統(tǒng)的改變，導(dǎo)致β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積進(jìn)而誘發(fā)阿爾茨海默癥(AD)；亨廷頓病(HD)是由突變亨廷頓蛋白在溶酶體中緩慢積累，改變了溶酶體活性，導(dǎo)致聚集的突變亨廷頓蛋白降解異常引起的。目前研究發(fā)現(xiàn)，溶酶體在多種病毒的致病過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，如：甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶(NA)直接結(jié)合溶酶體相關(guān)膜蛋白并誘導(dǎo)溶酶體破裂，進(jìn)一步導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡[7]。

當(dāng)前新冠肺炎的暴發(fā)對(duì)全球人類健康造成了相當(dāng)大的危害，新冠病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)是其暴發(fā)的病原體[16]。SARS-CoV-2進(jìn)入細(xì)胞依賴于病毒刺突(S)蛋白與細(xì)胞受體的結(jié)合以及被宿主細(xì)胞蛋白酶裂解(比如組織蛋白酶L和組織蛋白酶B)的刺突蛋白，而組織蛋白酶L和組織蛋白酶B是溶酶體途徑的重要組成部分，2種酶幾乎都位于溶酶體中[17]。冠狀病毒通過(guò)S蛋白吸附到細(xì)胞表面受體后，溶酶體蛋白酶通過(guò)裂解冠狀病毒表面刺突蛋白，激活宿主和病毒膜的融合，幫助病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，溶酶體蛋白酶在冠狀病毒入侵中發(fā)揮關(guān)鍵作用，先是通過(guò)晚期核內(nèi)體/MVBs從高爾基體/TGN到溶酶體的直接途徑，第2種更迂回的途徑是通過(guò)逆行轉(zhuǎn)運(yùn)回到ER/ERGIC，病毒再到達(dá)溶酶體[18-19]。利用溶酶體中的組織蛋白酶L和組織蛋白酶B以及細(xì)胞外胰蛋白酶獨(dú)立激活S蛋白進(jìn)行膜融合[20]。研究發(fā)現(xiàn)，溶酶體酸化是溶酶體酶的穩(wěn)定性和酶的活性所必需的，即使pH值的微小增加也足以抑制這些酶并停止其關(guān)鍵的生物學(xué)功能[21]，如BafA1預(yù)處理細(xì)胞阻止溶酶體酸化，從而抑制了豬三角冠狀病毒(PDCoV)進(jìn)入細(xì)胞[22]。PHEV是一種嗜神經(jīng)性病毒，能夠侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)，引起急性感染和宿主神經(jīng)功能障礙，PHEV感染后溶酶體相關(guān)蛋白的變化及溶酶體酸性環(huán)境對(duì)PHEV的影響研究仍有待闡明。

在本研究中，首先我們利用Western blot的方法對(duì)PHEV感染N2a細(xì)胞后對(duì)溶酶體相關(guān)蛋白的影響進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PHEV感染后溶酶體相關(guān)膜蛋白1(LAMP1)重組蛋白總量顯著升高。溶酶體結(jié)構(gòu)和功能的完整性需要溶酶體相關(guān)膜蛋白以及腔內(nèi)組織蛋白酶的共同調(diào)節(jié)，由此推測(cè)PHEV感染可能引起了神經(jīng)細(xì)胞溶酶體功能的紊亂。為了進(jìn)一步明確PHEV感染對(duì)溶酶體的影響，我們進(jìn)行了間接免疫熒光分析，發(fā)現(xiàn)病毒能與神經(jīng)細(xì)胞溶酶體共定位，并使溶酶體體積增大，我們推測(cè)病毒感染改變了溶酶體的形態(tài)。隨后，我們用溶酶體熒光探針Lyso TrackerRed DND-99標(biāo)記PHEV感染48 h后的N2a細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒感染后會(huì)使溶酶體的酸性增強(qiáng)，提示溶酶體酸性微環(huán)境可能對(duì)PHEV的生命周期造成影響。為了進(jìn)一步明確溶酶體酸性微環(huán)境對(duì)PHEV復(fù)制的影響，我們使用BafA1預(yù)處理細(xì)胞使空泡型H+-ATP酶受到抑制進(jìn)而阻止溶酶體酸化，經(jīng)Western blot和熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，感染PHEV后胞內(nèi)病毒含量卻表現(xiàn)出明顯低于未經(jīng)BafA1處理的感染組。結(jié)果表明，在溶酶體酸化環(huán)境受到抑制時(shí)，PHEV復(fù)制也會(huì)受到阻礙，胞內(nèi)子代病毒含量顯著降低。具體相關(guān)調(diào)控機(jī)制研究仍有待開(kāi)展。

綜上，本研究結(jié)果表明PHEV感染神經(jīng)細(xì)胞能定位于溶酶體，影響溶酶體的形態(tài)和功能，并引起溶酶體相關(guān)蛋白和組織蛋白的變化及溶酶體酸性微環(huán)境改變對(duì)PHEV復(fù)制的作用。上述研究結(jié)果不僅有助于揭示PHEV的致病機(jī)制，以及為PHE的防制研究提供新思路，同時(shí)還可以為研究溶酶體在其他神經(jīng)系統(tǒng)病毒感染性疾病中的作用提供研究基礎(chǔ)。