王 斌,肖 何,張志敏,羅 佳,金 豐,王 閣,宋 揚(yáng)

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院腫瘤中心,重慶 400042;*通訊作者,E-mail:songyang84zhu@163.com)

膀胱癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)腫瘤,主要以手術(shù)切除和化療等治療方式為主,由于膀胱癌具有高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移的臨床特點(diǎn),多數(shù)患者的預(yù)后并不理想[1]。隨著人口老齡化,膀胱癌的發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)[2]。探究膀胱癌發(fā)病機(jī)制,尋找新的生物標(biāo)志物和分子治療靶點(diǎn),一直是膀胱癌研究領(lǐng)域的重要方向。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA,lncRNA)是一類(lèi)非編碼、內(nèi)源性的小分子RNA,長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸[3]。lncRNA可通過(guò)影響啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄、mRNA穩(wěn)定性和mRNA翻譯效率等多種方式調(diào)控基因的表達(dá)[4]。近年的研究表明,lncRNA在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和血管形成等多種病理過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[5]。lncRNA的表達(dá)改變和其生物學(xué)功能是近年來(lái)腫瘤包括膀胱癌研究領(lǐng)域的新方向。最新的研究表明,LINC00665在胃癌、肺癌、肝癌等腫瘤進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[6-8]。LINC00665在膀胱癌中的表達(dá)和生物學(xué)功能尚不明確。本研究首先檢測(cè)LINC00665在膀胱癌細(xì)胞株中的表達(dá),通過(guò)在表達(dá)量最高的膀胱癌細(xì)胞中干擾LINC00665的表達(dá),研究LINC00665對(duì)膀胱癌細(xì)胞侵襲和增殖能力的影響和作用機(jī)制,為膀胱癌的靶向治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑

膀胱癌細(xì)胞株(T24、BIU-87、5637、UM-UC-3、J82)和正常膀胱上皮細(xì)胞(SV-HUC-1)購(gòu)于上海信然生物技術(shù)有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;陰性對(duì)照慢病毒、攜帶LINC00665抑制序列(si-LINC00665正義鏈:5′-AAUAGCCCAA GACUGAGGACUCACA-3′,反義鏈:3′-UGUGAGUCCUCAGUCUUGGGCUAUU-5′)的慢病毒購(gòu)于上海吉瑪生物科技有限公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;基質(zhì)膠購(gòu)于美國(guó)Life Technologies公司;Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Corning公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)試劑盒購(gòu)于日本TaKaRa公司;Trizol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;超敏ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo公司;一抗p-P13K、p-AKT、p-mTOR、S100A13、GAPDH購(gòu)于美國(guó)Abcam公司;二抗(羊抗兔)購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和感染

T24、BIU-87、5637、J82細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),UM-UC-3、SV-HUC-1細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2,隔天換液。接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期UM-UC-3細(xì)胞至6孔板,當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)進(jìn)行慢病毒感染,分別感染攜帶LINC00665抑制序列的慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒,定義為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。感染復(fù)數(shù)均為40,實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照慢病毒感染說(shuō)明書(shū)操作。觀察細(xì)胞狀態(tài),更換新鮮培養(yǎng)基。

1.3 qPCR檢測(cè)LINC00665和S100A13 mRNA的表達(dá)量

采用Trizol試劑盒提取膀胱癌細(xì)胞株和正常膀胱上皮細(xì)胞總RNA,整個(gè)提取過(guò)程處于無(wú)RN酶的環(huán)境中。采用qPCR試劑盒檢測(cè)LINC00665和S100A13 mRNA的相對(duì)表達(dá)量,以GAPDH作內(nèi)參。LINC00665上游引物:5′-GGTGCAAAGTGGGAAGTGTG-3′,下游引物:5′-CGGTGGACGGATGAGAAACG-3′;S100A13上游引物:5′-GATAGCCTCAGCGTCAACGAG-3′,下游引物:5′-CCTGATTCACATCCAAGCTCTT-3′;GAPDH上游引物:5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,下游引物:5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。qPCR反應(yīng)條件:初始95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,62 ℃退火25 s,72 ℃延伸25 s,共40個(gè)循環(huán)。所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt計(jì)算LINC00665和S100A13的表達(dá)量。

1.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)感染UM-UC-3細(xì)胞的侵襲能力

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩組UM-UC-3細(xì)胞消化后,采用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細(xì)胞密度,每組分別加入200 μl細(xì)胞懸液至預(yù)鋪基質(zhì)膠的Transwell上室,加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基至Transwell下室。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,取出Transwell上室,利用棉簽輕輕擦去多余基質(zhì)膠和未穿過(guò)底膜的細(xì)胞。利用4%多聚甲醛在室溫下固定20 min,利用0.1%結(jié)晶紫染液在室溫下染色20 min。流水沖洗并晾干,光鏡下計(jì)數(shù)每組侵襲的細(xì)胞數(shù),代表UM-UC-3細(xì)胞的侵襲能力。

1.5 MTT法檢測(cè)感染UM-UC-3細(xì)胞的增殖能力

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩組UM-UC-3細(xì)胞消化,采用DMEM培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細(xì)胞密度,以3 000個(gè)/孔接種于96孔板。分別于接種后第1-5天行MTT實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)時(shí),每孔加20 μl 5 g/L MTT試劑,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清,每孔加130 μl二甲基亞砜并振蕩,酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(A495)值。

1.6 Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩組UM-UC-3細(xì)胞采用蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白,每組以相同的蛋白上樣量行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜后在5%脫脂牛奶中封閉。孵育一抗S100A13(稀釋比為1 ∶2 000)、p-P13K(稀釋比為1 ∶1 000)、p-AKT(稀釋比為1 ∶2 000)、p-mTOR(稀釋比為1 ∶2 000)和GAPDH一抗(稀釋比均為1 ∶3 000),4 ℃下過(guò)夜。在室溫下孵育二抗(稀釋比為1 ∶10 000)3 h。漂洗后,在膜上均勻滴加超敏ECL發(fā)光試劑,凝膠成像系統(tǒng)中曝光、顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌細(xì)胞株中LINC00665的表達(dá)

qPCR結(jié)果顯示,膀胱癌細(xì)胞株(T24、BIU-87、5637、UM-UC-3、J82)和正常膀胱上皮細(xì)胞(SV-HUC-1)中LINC00665的相對(duì)表達(dá)量分別為4.14±0.31,3.05±0.36,1.77±0.15,6.65±0.40,5.00±0.32和1.01±0.09,膀胱癌細(xì)胞株中LINC00665的相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常膀胱細(xì)胞(P<0.05),UM-UC-3細(xì)胞中的表達(dá)最高(P<0.01,見(jiàn)圖1)。

與SV-HUC-1細(xì)胞比較,*P<0.05,**P<0.01圖1 膀胱癌細(xì)胞和正常膀胱上皮細(xì)胞中LINC00665的相對(duì)表達(dá)量Figure 1 Expression of LINC00665 in bladder cancer cells and normal bladder epithelial cell

2.2 UM-UC-3細(xì)胞感染攜帶LINC00665抑制序列慢病毒的效率

qPCR結(jié)果顯示,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組UM-UC-3細(xì)胞中LINC00665的相對(duì)表達(dá)量分別為1.02±0.06和0.20±0.05,實(shí)驗(yàn)組LINC00665的相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照組的19.61%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.72,P<0.01,見(jiàn)圖2)。

與對(duì)照組比較,**P<0.01圖2 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組UM-UC-3細(xì)胞中LINC00665的相對(duì)表達(dá)量Figure 2 Expression of LINC00665 in UM-UC-3 cells in control group and experimental group

2.3 低表達(dá)LINC00665對(duì)UM-UC-3細(xì)胞侵襲能力的影響

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中穿膜UM-UC-3細(xì)胞數(shù)分別為(83.90±6.28)個(gè)和(33.78±5.27)個(gè)。與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組穿膜UM-UC-3細(xì)胞數(shù)明顯較少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.11,P<0.01),低表達(dá)LINC00665具有抑制膀胱癌UM-UC-3細(xì)胞侵襲的能力(見(jiàn)圖3)。

2.4 低表達(dá)LINC00665對(duì)UM-UC-3細(xì)胞增殖能力的影響

MTT法結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組UM-UC-3細(xì)胞在感染后第3,4,5天的A值均低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(第3天:t=3.03,P<0.05;第4天:t=4.23,P<0.05;第5天:t=5.39,P<0.01,見(jiàn)圖4),表明低表達(dá)LINC00665具有抑制膀胱癌UM-UC-3細(xì)胞增殖的能力。在第1,2天的A值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為0.38,2.66,均P>0.05)。

2.5 低表達(dá)對(duì)LINC00665對(duì)S100A13 mRNA表達(dá)的影響

qPCR結(jié)果顯示,低表達(dá)LINC00665后的實(shí)驗(yàn)組UM-UC-3細(xì)胞中S100A13 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.28±0.05vs1.02±0.12,t=5.73,P<0.01),表明低表達(dá)LINC00665可有效降低S100A13 mRNA的相對(duì)表達(dá)。

2.6 S100A13和P13K/AKT/mTOR信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平

Western blot結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)組UM-UC-3細(xì)胞中,S100A13蛋白表達(dá)降低,P13K/AKT/mTOR信號(hào)通路蛋白p-P13K、p-AKT、p-mTOR表達(dá)明顯降低(見(jiàn)圖5),表明P13K/AKT/mTOR信號(hào)通路被抑制。

與對(duì)照組相比,**P<0.01圖3 低表達(dá)LINC00665對(duì)UM-UC-3細(xì)胞侵襲能力的影響Figure 3 Effect of down-regulated LINC00665 on the invasion ability of UM-UC-3 cells

與對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01圖4 低表達(dá)LINC00665對(duì)UM-UC-3細(xì)胞增殖能力的影響Figure 4 Effect of down-regulated LINC00665 on the proliferation of UM-UC-3 cells

圖5 低表達(dá)LINC00665對(duì)S100A13蛋白和P13K/AKT/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effect of down-regulated LINC00665 on the expression of S100A13 protein and P13K/AKT/mTOR signaling pathway proteins

3 討論

近年來(lái),隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,靶向治療已成為膀胱癌重要的輔助治療方式[9]。尋找有效的膀胱癌分子治療靶點(diǎn)對(duì)改善膀胱癌患者的預(yù)后具有重要的臨床意義。越來(lái)越多的研究顯示,lncRNA在腫瘤組織中存在顯著的異常表達(dá),廣泛參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的分化、增殖、侵襲、凋亡等活動(dòng),其異常表達(dá)與患者的臨床分期、分級(jí)及預(yù)后明顯相關(guān)[10]。lncRNA如CASC15、LINC00978、GClnc1在膀胱癌組織呈高表達(dá),通過(guò)多種方式顯著促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[11-13]。LINC00665是一種新明確的lncRNA,其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中均具有調(diào)控作用。Qi等[14]的研究表明,LINC00665在胃癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)明顯升高,與患者TNM分期、組織學(xué)分級(jí)及預(yù)后不良有關(guān)。抑制LINC00665的表達(dá)可顯著降低胃癌細(xì)胞的增殖活力和侵襲能力。Shan等[6]研究顯示,在肝癌組織和細(xì)胞中LINC00665的表達(dá)升高,LINC00665表達(dá)水平越高的肝癌患者的總生存期越短,干擾LINC00665的表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬。LINC00665在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮癌基因的作用。LINC00665對(duì)膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響未見(jiàn)報(bào)道。

本研究中,通過(guò)qPCR法檢測(cè)LINC00665在膀胱癌細(xì)胞株中的表達(dá),相比正常膀胱上皮,LINC00665在膀胱癌細(xì)胞株中的表達(dá)明顯升高,LINC00665可能在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮癌基因作用。本研究通過(guò)將攜帶LINC00665抑制序列的慢病毒感染膀胱癌UM-UC-3細(xì)胞,抑制LINC00665的表達(dá),結(jié)果進(jìn)一步表明,低表達(dá)LINC00665可明顯抑制膀胱癌UM-UC-3細(xì)胞的侵襲能力和增殖能力,表明LINC00665在膀胱癌的生長(zhǎng)過(guò)程中可能具有促進(jìn)作用。鈣結(jié)合蛋白A13(calcium binding protein A13,S100A13)基因定位于人類(lèi)染色體1q21,包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子,S100A13蛋白屬于S100蛋白家族成員,由98個(gè)氨基酸構(gòu)成[15]。S100A13蛋白在人體多種組織中均可表達(dá),主要通過(guò)影響細(xì)胞非經(jīng)典跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)通路調(diào)控細(xì)胞因子的跨膜運(yùn)動(dòng),在組織修復(fù)、血管生成、腫瘤生長(zhǎng)等多種生理、病理過(guò)程中具有重要作用[16]。S100A13在多種腫瘤組織中異常高表達(dá),具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用,與患者的不良預(yù)后相關(guān)[17]。qPCR和Western blot顯示,低表達(dá)LINC00665后,S100A13基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)明顯降低。P13K/AKT/mTOR信號(hào)通路是腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的重要作用機(jī)制,具有明顯的促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用[18]。P13K/AKT/mTOR信號(hào)通路蛋白如p-P13K、p-AKT、p-mTOR表達(dá)明顯降低,表明P13K/AKT/mTOR信號(hào)通路被抑制。LINC00665調(diào)控S100A13基因表達(dá)的確切機(jī)制尚不明確,有待深入研究。

綜上所述,相較于正常膀胱上皮細(xì)胞,膀胱癌細(xì)胞株LINC00665的表達(dá)明顯升高,低表達(dá)LINC00665可明顯抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力,其作用機(jī)制是LINC00665表達(dá)水平降低后,S100A13基因表達(dá)降低,進(jìn)而抑制P13K/AKT/mTOR信號(hào)通路的活化。LINC00665在膀胱癌中發(fā)揮“癌基因”功能,有望成為膀胱癌治療潛在的靶點(diǎn)。