呂成鵬,倪 華,馬 銳,李 龍,劉 斌,劉彥普

(1陜西省人民醫(yī)院口腔科,西安 710068;2空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科;3空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院組織工程研發(fā)中心;4陜西省西安市兒童醫(yī)院麻醉科;5廣東省深圳市南山區(qū)蛇口人民醫(yī)院口腔科;6空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心;*通訊作者,E-mail:liuyanpu@fmmu.edu.cn)

脂肪移植后的吸收一直是困擾口腔頜面外科和整形科的問題,由于脂肪吸收的不確定性,對(duì)于自體脂肪移植通常需要多次注射和超量注射來平衡脂肪吸收所帶來的問題[1]。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展,軟組織修復(fù)重建迎來新的希望。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),采用脂肪基質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)復(fù)合移植脂肪組織能夠降低脂肪移植后的吸收率[2],但對(duì)于ADSCs在脂肪移植后的組織分布缺乏研究。CM-DiI是一種羰花青熒光染料,能與細(xì)胞膜結(jié)合,發(fā)出強(qiáng)大的紅色熒光,細(xì)胞毒性極低,尤其適合標(biāo)記和示蹤干細(xì)胞[3]。本研究擬探討CM-DiI對(duì)ADSCs的體外標(biāo)記,并觀察標(biāo)記后的干細(xì)胞在脂肪移植組織中的分布與轉(zhuǎn)歸。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

高糖DMEM(Gibco,USA),胎牛血清(Gibco,USA),I型膠原酶(Sigma,USA),β-甘油磷酸鈉(Sigma,USA),3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)(Peprotech,USA),吲哚美辛(Peprotech,USA),茜素紅(Peprotech,USA),小鼠抗兔CD29-IgG抗體(Abcam,USA),小鼠抗兔CD31-IgG抗體(Abcam,USA),羊抗小鼠IgG FITC(Abcam,USA),CM-DiI(Invitrogen,USA),Hoechst(Thermo,USA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6月齡雄性新西蘭大白兔3只,體質(zhì)量2.5-3 kg,6周齡雌性BALB/c裸鼠6只,約30 g,中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.3 ADSCs的分離和培養(yǎng)

取新西蘭兔雙側(cè)腹股溝及頸背部的皮下脂肪,清理并剔除其內(nèi)的結(jié)蹄組織,剪碎切取的脂肪組織,用DMEM高糖配制1% Ⅰ型膠原酶37 ℃消化1 h;1 000 r/min離心5 min,棄上清。加入DMEM培養(yǎng)基(含青霉素和鏈霉素,10%胎牛血清,292 mg/L的谷氨酰胺,50 mg/L的維生素C)重懸;接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中,5%CO2,37 ℃飽和濕度培養(yǎng),培養(yǎng)3 d換液,后隔日換液;5-7 d按照1 ∶2比例傳代,第二代細(xì)胞以1 ∶3傳代。

1.4 ADSCs的成脂、成骨多向分化能力檢測(cè)

成脂分化能力檢測(cè):取第3代的ADSCs細(xì)胞,1×105/cm2接種于1.2 cm×1.2 cm的蓋玻片上,加入DMEM培養(yǎng)基,細(xì)胞密度達(dá)80%后加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基,3 d換液1次,接種7 d用4%的多聚甲醛固定15 min,PBS洗3次,60%異丙醇淋洗。浸入油紅O染液10 min,60%異丙醇分色至背景無色,雙蒸水洗1次,蘇木精復(fù)染,晾干,甘油明膠封片,鏡檢。

成骨分化能力檢測(cè):取第3代的ADSCs細(xì)胞,1×105/cm2接種于1.2 cm×1.2 cm的蓋玻片上,加入DMEM培養(yǎng)基,細(xì)胞密度達(dá)80%以后加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基,每3 d換1次液,4周后用4%的多聚甲醛固定15 min,PBS洗3次,加1%茜素紅溶液,37 ℃染色30 min,雙蒸水洗去多余的染料,晾干,甘油明膠封片,鏡檢。

成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基：高糖DMEM 10%；胎牛血清;1 μmol/L地塞米松；10 μmol/L胰島素；0.5 mmol/L IBMX；200 μmol/L吲哚美辛；1%雙抗。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基：高糖DMEM；5%胎牛血清；0.1 μmol/L地塞米松；50 mg/L維生素C；10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉；1%雙抗。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)ADSCs表面標(biāo)記物

取第3代ADSCs細(xì)胞,培養(yǎng)密度達(dá)到80%后,消化并進(jìn)行CD29和CD31免疫組化染色,通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)其陽性率。取1×106個(gè)細(xì)胞,PBS洗2次,加入一抗孵育30 min,離心后,棄上清,PBS洗2次,加入FITC標(biāo)記羊抗小鼠二抗孵育30 min,PBS洗2次,流式細(xì)胞儀檢測(cè);對(duì)照組未加入一抗。

1.6 CM-DiI標(biāo)記ADSCs及體外觀測(cè)

第3代ADSCs細(xì)胞消化后,PBS洗2次,3 min/次。用不含胎牛血清的DMEM重懸細(xì)胞,加入CM-DiI使其終濃度為1 μg/ml,37 ℃孵育5 min,4 ℃孵育15 min。800 r/min,離心5 min,棄上清,PBS漂洗2次。加入新鮮培養(yǎng)基重懸,接種于蓋玻片。待細(xì)胞貼壁后,用Carnoy固定液固定,PBS漂洗5 min,加入Hoechst工作液,室溫15 min,PBS漂洗3次,5 min/次。封片,熒光顯微鏡下觀察。

1.7 脂肪移植裸鼠模型的建立及冰凍切片的制備

3%戊巴比妥鈉1 ml/kg兔耳緣靜脈注射,待麻醉后,固定、消毒、鋪巾。切取新西蘭兔頸背部的皮下脂肪,放入無菌培養(yǎng)皿中,PBS沖洗2次,修剪去除多余的血管及纖維結(jié)蹄組織,剪碎脂肪組織。將剪碎的脂肪顆粒與CM-DiI標(biāo)記的ADSCs混合制備脂肪移植混合物。

取1 ml針管配18號(hào)白色針頭吸取脂肪移植物;在裸鼠背部皮下利用針頭潛行分離,注射脂肪復(fù)合體0.3 ml(ADSCs為3×105個(gè))。

裸鼠脂肪移植4周,頸椎脫臼法處死裸鼠,取新鮮脂肪移植物,于制冷切片機(jī)上立即冰凍切片,切片厚度為5-10 μm,熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs的體外培養(yǎng)及多向誘導(dǎo)能力檢測(cè)

ADSCs經(jīng)過原代培養(yǎng)8 h開始貼壁,24 h完全貼壁,72 h更換培養(yǎng)液,生長細(xì)胞呈多角形、短梭形(見圖1A),傳代后逐漸變成均質(zhì)的長梭形細(xì)胞(見圖1B)。取第3代的ADSCs細(xì)胞進(jìn)行成脂肪、成骨誘導(dǎo)。加入成脂誘導(dǎo)液后,細(xì)胞開始變?yōu)槎嘟切?加入成脂誘導(dǎo)液3 d細(xì)胞內(nèi)可見較小的脂滴形成,7 d時(shí)脂滴變大。油紅O染色見脂肪滴染色呈紅色陽性(見圖1C)。加入成骨誘導(dǎo)液后3 d,細(xì)胞逐漸變成短梭形,加入成骨誘導(dǎo)液4周茜素紅染色陽性(見圖1D)。

2.2 ADSCs標(biāo)志物的流式細(xì)胞儀檢測(cè)

ADSCs的CD29表達(dá)陽性細(xì)胞比例為84.52%±4.91%,CD31表達(dá)陽性細(xì)胞比例為2.13%±0.95%,對(duì)照組均為陰性(見圖2)。

圖2 ADSCs標(biāo)志物的流式細(xì)胞儀檢測(cè)Figure 2 Flow cytometry detection of CD29 and CD31 in ADSCs

2.3 熒光顯微鏡所見CM-DiI標(biāo)記的ADSCs

熒光顯微鏡下觀察,視野中ADSCs胞漿為紅色熒光,細(xì)胞核經(jīng)Hoechst染色呈藍(lán)色熒光(見圖3)。

2.4 ADSCs在脂肪移植組織內(nèi)的分布

脂肪移植組織行冰凍切片,直接顯微鏡下觀察,可見脂肪細(xì)胞空腔樣結(jié)構(gòu);在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),ADSCs紅色熒光在脂肪移植組織中表達(dá)陽性,且紅色熒光分布符合脂肪組織結(jié)構(gòu)呈多孔樣(見圖4),提示ADSCs可能分化為脂肪細(xì)胞。

A.Hoechst染細(xì)胞核(藍(lán)色);B.CM-DiI標(biāo)記的ADSCs,主要位于胞膜和胞質(zhì)中(紅色);C.合成圖像(×200)圖3 CM-DiI標(biāo)記的第3代ADSCsFigure 3 CM-DiI labeling of the third generation ADSCs

A.冰凍切片直接顯微鏡下觀察;B.CM-DiI標(biāo)記的細(xì)胞;C.合成圖(×50)圖4 脂肪移植4周后ADSCs在脂肪移植物的示蹤Figure 4 Distribution of ADSCs in fat graft tissues at 4 week after transplantation using fluorescence microscopy

3 討論

關(guān)于干細(xì)胞移植示蹤標(biāo)記的方法主要有核酸標(biāo)記法(BrdU)、基因標(biāo)記(GFP)、Y染色體標(biāo)記、磁標(biāo)記、熒光染料標(biāo)記(CM-DiI、PKH-26)等[4]。BrdU、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)能標(biāo)記細(xì)胞核的DNA,標(biāo)記效率較高,但隨著細(xì)胞分裂次數(shù)增加,標(biāo)記物會(huì)逐漸減弱消失;基因標(biāo)記法程序繁瑣、實(shí)驗(yàn)周期較長。CM-DiI是一種親脂性的熒光染料,能夠與蛋白質(zhì)的硫氫基相結(jié)合,通過胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),從而標(biāo)記整個(gè)細(xì)胞。CM-DiI熒光激發(fā)波長為553 nm,激發(fā)后可發(fā)出波長為570 nm的紅色熒光。CM-DiI廣泛用于各種干細(xì)胞的標(biāo)記[5,6]。研究表明,利用CM-DiI標(biāo)記骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)能夠在體內(nèi)示蹤長達(dá)6個(gè)月之久[7];Reichenberger等[8]利用CM-DiI標(biāo)記ADSCs證實(shí)ADSCs參與神經(jīng)損傷后的修復(fù)。

脂肪移植后的吸收常導(dǎo)致醫(yī)生對(duì)脂肪移植后軟組織恢復(fù)情況缺乏穩(wěn)定的預(yù)期[9]。如何減少脂肪移植后的吸收是需要解決的問題。隨著組織工程的發(fā)展,各種干細(xì)胞被用于組織修復(fù)重建[10-12]。脂肪基質(zhì)干細(xì)胞主要存在于脂肪組織中,具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能,在適宜的條件下,ADSCs可以分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞[13]。脂肪基質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)由于獲取容易、創(chuàng)傷小、數(shù)量多等優(yōu)勢(shì)[14]被廣泛應(yīng)用于缺血心肌的修復(fù)[15]、神經(jīng)損傷修復(fù)[16]、軟組織修復(fù)重建[17]等方面。本課題組研究發(fā)現(xiàn),通過ADSCs能夠減少脂肪移植后的吸收,促進(jìn)脂肪移植組織的修復(fù)[2],但內(nèi)在機(jī)制缺乏進(jìn)一步的研究。

本實(shí)驗(yàn)通過貼壁原代培養(yǎng)法獲得脂肪基質(zhì)干細(xì)胞,對(duì)脂肪基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成脂、成骨誘導(dǎo),通過油紅O染色和茜素紅染色證實(shí)其多向分化能力。流式細(xì)胞儀顯示ADSCs的CD29表達(dá)陽性率為84.52%±4.91%,CD31表達(dá)陽性率為2.13%±0.95%,證實(shí)了ADSCs的特異性。通過CM-DiI對(duì)第3代ADSCs進(jìn)行標(biāo)記,熒光顯微鏡觀察顯示標(biāo)記的ADSCs細(xì)胞胞質(zhì)呈紅色熒光,Hoechst標(biāo)記的細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光,CM-DiI能夠體外標(biāo)記ADSCs。將體外標(biāo)記的ADSCs移植入裸鼠模型,移植后4周在移植脂肪組織的冰凍切片中觀察到紅色熒光,并且紅色熒光分布呈脂肪組織多孔樣,進(jìn)一步證實(shí)ADSCs參與脂肪移植后的組織修復(fù),ADSCs可能分化為脂肪細(xì)胞。推測(cè)ADSCs的多向分化能力促進(jìn)了脂肪移植后的修復(fù),減少了脂肪移植后的吸收。