姚 越,張 沖,韓 兵,湯玉銳,熊言駿,汪 盛

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科,蚌埠 233000;*通訊作者,E-mail:bydoctorw@163.com)

前列腺癌(prostate cancer)是老年男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性癌癥之一[1],目前國際上在治療前列腺癌方面已經(jīng)取得了重要的治療進(jìn)展,恩雜魯胺、阿比特龍和卡巴他賽等藥物已擴(kuò)大了治療藥庫[2]。研究報道,我國前列腺癌的發(fā)病率和死亡率近年來呈逐漸上升趨勢[3,4],前列腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚未完全闡明[5,6],仍然缺乏持續(xù)有效的治療策略,嚴(yán)重威脅患者的身心健康,因此,尋找新的能夠治療前列腺癌的藥物成為關(guān)鍵。

近來,已經(jīng)對癌細(xì)胞中的葡萄糖代謝進(jìn)行了深入研究。據(jù)報道,幾乎所有癌細(xì)胞都可以激活葡萄糖的攝取[7,8],癌細(xì)胞對葡萄糖攝取異常增加,并且對葡萄糖濃度的變化敏感[9]。因此,靶向消耗腫瘤細(xì)胞的葡萄糖是開發(fā)更有效抗癌藥物的有前途的方法[10-12]。癌細(xì)胞中葡萄糖攝取的增加主要歸因于葡萄糖轉(zhuǎn)運體1(glucose transporter 1,GLUT1)的上調(diào),這幾乎是所有細(xì)胞類型中基礎(chǔ)葡萄糖轉(zhuǎn)運上升的原因[13,14]。

STF-31是一種特異性靶向GLUT-1抑制劑,能夠特異性地與GLUT1相互結(jié)合而抑制細(xì)胞葡萄糖攝取進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前尚未有STF-31對前列腺癌PC-3細(xì)胞作用的實驗研究,本實驗旨在研究STF-31對PC-3細(xì)胞增殖抑制及凋亡的影響,并探討其誘導(dǎo)凋亡可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑

人前列腺癌PC-3細(xì)胞購自上海細(xì)胞庫,STF-31購自Selleck中國公司,DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司,胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自浙江天杭生物科技股份有限公司,MTT試劑、乳酸、葡萄糖攝取試劑盒、ATP試劑盒、Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染試劑盒購于上海碧云天有限責(zé)任公司,Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白抗體購自美國CST公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人前列腺癌PC-3細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素、100 U/ml青霉素的DMEM培養(yǎng)基中,放置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 MTT測定細(xì)胞增殖

將PC-3細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,每孔1×104個細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞貼壁,加入濃度分別為0,4,8,16 μmol/L的STF-31,于24,48,72 h時每孔加入15 μl MTT溶液,放入培養(yǎng)箱中孵育4 h,小心吸去培養(yǎng)液,每孔加入150 μl DMSO,置于37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育30 min待甲臜完全溶解,在490 nm波長處用酶聯(lián)免疫檢測儀測吸光度值(OD490 nm),計算細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率(%)=實驗組OD490 nm/對照組OD490 nm×100%。取各組數(shù)據(jù)的平均值繪制藥物時間劑量效應(yīng)圖,利用SPSS21.0統(tǒng)計軟件計算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.4 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡

將PC-3細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,每孔3×105個細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞貼壁,加入濃度分別為0,4,8,16 μmol/L的STF-31,給藥24 h收集細(xì)胞,離心后每孔加入500 μl緩沖液重懸細(xì)胞,加入10 μl Annexin Ⅴ-FITC混勻,冰上孵育15 min,之后每孔加15 μl PI染色劑,1 h內(nèi)檢測細(xì)胞凋亡情況,并將實驗重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞內(nèi)ATP水平的檢測

將PC-3細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,每孔3×105個細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞貼壁,加入濃度分別為0,4,8,16 μmol/L的STF-31,作用6 h,離心收集細(xì)胞,棄去上清液。每個孔加入200 μl裂解液裂解20 min,劇烈渦旋以完全裂解細(xì)胞。使用4 ℃離心機(jī)以12 000 r/min將混合物離心5 min,并將上清液(保留在冰上)用于后續(xù)分析,裂解液中的蛋白質(zhì)濃度通過BCA蛋白測定試劑盒進(jìn)行定量,每個樣品中加入100 μl ATP工作液(ATP檢測原液 ∶稀釋液=1 ∶9),并在室溫下放置5 min(使反應(yīng)在黑暗中進(jìn)行),使背景ATP全部消耗,立即向每孔添加20 μl樣品,用酶標(biāo)儀測量吸光度,并將實驗重復(fù)3次。

1.6 乳酸的測定

將PC-3細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,每孔3×105個細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞貼壁,加入濃度分別為0,4,8,16 μmol/L的STF-31,給藥24 h,然后收集細(xì)胞,重懸于適量的裂解物中,并轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中。將細(xì)胞在-20 ℃下裂解3次,并在4 ℃下以12 000 r/min離心30 min,上清液參照乳酸測定試劑盒步驟(BioVision)進(jìn)行測試,并將實驗重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞葡萄糖攝取的檢測

將PC-3細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,每孔3×105個細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞貼壁,加入濃度分別為0,4,8,16 μmol/L的STF-31,給藥24 h,吸取原培養(yǎng)基,PBS洗兩次,換成不含葡萄糖的培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞2 h,每孔加入1 mg/ml 2-NBDG溶液50 μl,37 ℃孵育30 min,PBS洗兩次,使用多功能酶標(biāo)儀檢測(激發(fā)波長465 nm,發(fā)射波長540 nm),實驗重復(fù)3次。

1.8 Western blot法檢測Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平

將PC-3細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,每孔3×105個細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞貼壁,加入濃度分別為0,4,8,16 μmol/L的STF-31,給藥48 h收集細(xì)胞,冰上裂解30 min,12 000 r/min離心30 min,吸取上清液,每組樣取60 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳;蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜;快速封閉液封閉15 min;分別加一抗(Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3,抗體 ∶一抗稀釋液=1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜;二抗(兔抗)室溫下孵育2 h;ECL試劑盒暗室發(fā)光顯影,Bio-Rad-Image-Lab-6.0凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.9 統(tǒng)計分析方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組比較采用單因素方差分析及兩因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 STF-31對PC-3細(xì)胞增殖抑制作用

MTT分析結(jié)果表明,隨著STF-31濃度的增加,PC-3細(xì)胞的存活率下降(P<0.05),以及隨著STF-31作用時間的延長,PC-3細(xì)胞的存活率下降(P<0.05,見圖1),與0 μmol/L相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。不同濃度STF-31處理PC-3細(xì)胞24,48,72 h的IC50值分別為20.8 μmol/L,8.26 μmol/L,4.36 μmol/L。

2.2 STF-31對PC-3細(xì)胞凋亡的影響

Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法檢驗給藥后PC-3細(xì)胞凋亡,結(jié)果顯示,對照組總凋亡率為(4.36±0.39)%,4,8,16 μmol/L STF-31組總凋亡率分別為(8.21±2.8)%,(16.9±1.2)%,(34.2±1.7)%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。

與0 μmol/L比較,*P<0.05,**P<0.01圖1 STF-31對PC-3細(xì)胞增殖抑制作用Figure 1 Inhibitory effect of STF-31 on PC-3 cell proliferation

圖2 STF-31對PC-3細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 Effect of STF-31 on PC-3 cell apoptosis

2.3 STF-31對PC-3細(xì)胞葡萄糖攝取和ATP的影響

葡萄糖攝取測定的結(jié)果表明,隨著STF-31濃度的增加,PC-3細(xì)胞葡萄糖攝取逐漸減少。STF-31可以誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞中葡萄糖攝取的能力分別從基線的100%降至(84.3±1.1)%,(65.2±2.1)%和(53.7±2.4)%(P<0.05,見圖3)。同時,STF-31可以誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞中ATP水平分別從基線的100%降至(80.1±2.1)%,(60.2±1.9)%和(48.7±1.34)%(P<0.05,見圖3)。這些結(jié)果表明,STF-31可以通過抑制PC-3細(xì)胞葡萄糖攝取從而抑制PC-3細(xì)胞的能量代謝。

與0 μmol/L比較,*P<0.05,**P<0.01圖3 STF-31對PC-3細(xì)胞葡萄糖攝取和ATP的影響Figure 3 Effect of STF-31 on glucose uptake and ATP in PC-3 cells

2.4 STF-31對PC-3細(xì)胞乳酸的影響

隨著STF-31濃度的增加,PC-3細(xì)胞胞內(nèi)乳酸逐漸減少,乳酸含量分別從基線的100%降至(90.1±2.1)%,(75.4±1.3)%和(63.4±2.7)%(P<0.05,見圖4)。

與0 μmol/L比較,*P<0.05,**P<0.01圖4 STF-31對PC-3細(xì)胞乳酸的影響Figure 4 Effect of STF-31 on lactic acid in PC-3 cells

2.5 STF-31對PC-3細(xì)胞Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步研究STF-31對PC-3細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制,通過蛋白質(zhì)印跡評估了凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3的表達(dá),隨著STF-3濃度的增加,凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3(caspase-3的裂解產(chǎn)物)和促凋亡蛋白Bax的蛋白水平增加,而抑凋亡蛋白Bcl-2減少(P<0.05,見圖5),表明STF-31可以誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡,其凋亡機(jī)制與凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)和Bax、cleaved caspase-3表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

3 討論

與正常的非增殖細(xì)胞相比,癌細(xì)胞顯示出了特殊的代謝要求[15,16],近年來,抑制癌細(xì)胞特異性代謝成為治療癌癥的熱點[17]。首先集中在Warburg效應(yīng)上,癌細(xì)胞通過低效率的葡萄糖發(fā)酵生成乳酸鹽而不是通過線粒體氧化三羧酸循環(huán)或氧化磷酸化來生存[18]。目前,在糖酵解過程中靶向葡萄糖轉(zhuǎn)運及其代謝被認(rèn)為是一種有前景的癌癥治療策略[19]。在人類中,GLUT(葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白)家族由13個與結(jié)構(gòu)相關(guān)的成員組成,其中GLUT1在正常細(xì)胞中最普遍表達(dá)[20],在癌癥中,GLUT1是葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的主要過表達(dá)亞型[21]。

STF-31作為一種特異性靶向GLUT-1抑制劑,能夠特異性與GLUT1結(jié)合而抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運,在本實驗中,STF-31同樣可以抑制PC-3細(xì)胞的葡萄糖攝取,而影響PC-3細(xì)胞ATP的產(chǎn)生,正常的非增殖細(xì)胞僅在厭氧條件下會產(chǎn)生大量的乳酸,而大多數(shù)癌細(xì)胞卻會在無氧條件下和線粒體功能正常的情況下產(chǎn)生乳酸。大量的乳酸會使腫瘤細(xì)胞處于酸性環(huán)境,與病人體內(nèi)腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移和較短的總體生存期具有相關(guān)性[22]。癌細(xì)胞通常利用乳酸作為生長增殖和線粒體代謝的物質(zhì),并可生成丙氨酸和谷氨酰胺[23]。

與0 μmol/L比較,*P<0.05圖5 STF-31對PC-3細(xì)胞Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effect of STF-31 on Bax, Bcl-2, cleaved caspase-3 protein expression in PC-3 cells

本研究結(jié)果表明,STF-31能夠抑制PC-3細(xì)胞乳酸的產(chǎn)生,而且STF-31能夠顯著誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡,為了驗證出STF-31誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡可能機(jī)制,使用Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3的表達(dá),結(jié)果表明,STF-31能夠抑制PC-3細(xì)胞中Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3的表達(dá)。綜上,STF-31對PC-3具有增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用,凋亡機(jī)制可能為:STF-31通過抑制PC-3細(xì)胞葡萄糖攝取而抑制PC-3細(xì)胞的能量代謝達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的目的。