劉 暢,鄭榮華,溫 武,朱敏輝*

(1上海市中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院耳鼻喉科,上海 200032;2第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院耳鼻喉科;*通訊作者,E-mail:zhuminhui197915@163.com)

鼻咽癌是發(fā)生于鼻咽腔頂部和側(cè)壁的惡性腫瘤,由多種因素誘發(fā),如遺傳變異、環(huán)境因素和Epstein-Barr(EBV)病毒感染[1]。據(jù)GLOBOCAN數(shù)據(jù)庫顯示,2012年全世界報告8萬多例鼻咽癌新病例,其中中國、東南亞、北非和太平洋島嶼的發(fā)病率最高。與大多數(shù)其他惡性腫瘤不同,由于鼻咽癌的解剖位置和放射敏感性,放療是鼻咽癌的主要治療方法[2]。白花蛇舌草是茜草科植物之一,是我國古代著名的藥用植物?，F(xiàn)有證據(jù)表明白花蛇舌草成分具有多種生物功能,包括抗血管生成、抗炎、抗氧化、促凋亡等[3]。更重要的是,白花蛇舌草提取物在許多臨床前癌癥研究中顯示出顯著的抗癌活性[4,5]。然而,白花蛇舌草提取物在鼻咽癌細胞中潛在作用的相關(guān)研究在文獻檢索范圍內(nèi)鮮有報道。本研究擬在體外進行白花蛇舌草提取物對鼻咽癌細胞CNE-1放療增敏的實驗研究,以探討白花蛇舌草提取物在放療增敏中的作用機制,從而為臨床鼻咽癌放療增敏提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

白花蛇舌草水提物:白花蛇舌草(江西天師中藥集團余江制藥廠)30 g加蒸餾水3 000 ml溫火煎煮60 min,加熱沸騰30 min,網(wǎng)篩過濾去渣,離心取上清液濃縮為300 ml,0.2 μm過濾除菌,備用。RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購自Gibco公司;抗LASP1抗體和抗β-actin抗體和辣根過氧化物標記的二抗購自英國Abcam公司;BCA法蛋白濃度檢測試劑盒、Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染試劑盒和CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

鼻咽癌細胞系CNE-1購自中國科學院上海細胞研究所。細胞培養(yǎng)于添加有10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 U/ml)的RPMI1640培養(yǎng)基中,且在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細胞增殖檢測

采用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖。將處于對數(shù)生長期的鼻咽癌細胞CNE-1制成細胞懸浮液,以1×103個/孔細胞的量接種至96孔板內(nèi),重復(fù)3孔。培養(yǎng)24 h后,各孔加入不同濃度白花蛇舌草(100,200,400 μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)24,48,72 h,或者不同劑量的射線(2,4,6,8 Gy)照射24 h。離心棄去培養(yǎng)液,每孔加入含10%的CCK-8試劑的培養(yǎng)液繼續(xù)震蕩培養(yǎng)20-30 min,450 nm處檢測各孔OD值并記錄結(jié)果。細胞活性=(試驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)。細胞生長抑制率=1-腫瘤細胞存活率(%)。根據(jù)此實驗結(jié)果,我們進一步選擇2 Gy射線及400 μg/ml白花蛇舌草水提物處理細胞,將細胞分為空白對照組、射線組、白花蛇舌草組、射線+白花蛇舌草組。

1.4 細胞凋亡檢測

對數(shù)生長期的CNE-1細胞(1×103個/孔)接種到6孔細胞培養(yǎng)板中,隨機分為4組:空白對照組、射線組、白花蛇舌草組、射線+白花蛇舌草組。細胞分別經(jīng)過白花蛇舌草、放射線以及白花蛇舌草和放射線聯(lián)合處理24 h后,消化離心收集細胞,加入5 μl的Annexin Ⅴ-FITC和10 μl的PI染料,輕輕混勻后室溫避光孵育10 min,于流式細胞儀檢測。

1.5 RNA提取與熒光定量PCR

CNE-1細胞隨機分為4組:空白對照組、射線組、白花蛇舌草組、射線+白花蛇舌草組。采用TRIzol法提取各組細胞中總RNA,檢測RNA的純度及濃度。以總RNA為模板,利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒擴增得到cDNA。采用SYBR Green PCR試劑盒,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參進行熒光定量PCR檢測LASP1 mRNA水平。根據(jù)2-ΔΔCt方法計算LASP1的相對表達水平,每組設(shè)置3個平行。RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR條件與反應(yīng)體系均按照對應(yīng)說明書進行操作。

1.6 Western blot分析

收集各組細胞培養(yǎng)液,離心后加入蛋白裂解液反應(yīng)30 min,提取細胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度,采用SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì),采用濕法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上。經(jīng)5%脫脂牛奶/TBST封閉,一抗過夜孵育后,TBST清洗后加入二抗,室溫下孵育90 min。加入ECL顯色劑后置于凝膠成像儀檢測目標蛋白水平。

1.7 統(tǒng)計學分析

結(jié)果以均數(shù)±標準差表示,采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行分析,組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)和Tukey檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 白花蛇舌草水提物對鼻咽癌細胞CNE-1的抑制作用

鼻咽癌細胞CNE-1經(jīng)不同濃度(100,200,400 μg/ml)白花蛇舌草水提物分別處理24,48,72 h后,CCK-8實驗檢測白花蛇舌草對CNE-1細胞的抑制作用。結(jié)果顯示,隨著白花蛇舌草水提物濃度增加,其對CNE-1細胞活性的抑制率逐漸增加(見圖1),表明白花蛇舌草水提物對CNE-1細胞活性的抑制具有濃度依賴性。在同一濃度下隨著處理時間的延長,其對CNE-1細胞活性的抑制率也逐漸增加(見圖1),表明白花蛇舌草水提物對CNE-1細胞活性的抑制具有時間依賴性。后續(xù)實驗中,我們選擇400 μg/ml白花蛇舌草水提物處理細胞24 h,研究其在射線影響鼻咽癌細胞活性中的作用。

與100 μg/ml相比,*P<0.05;與24 h相比,#P<0.05圖1 白花蛇舌草水提物對鼻咽癌細胞CNE-1的抑制作用Figure 1 The effect of Hedyotis Diffusa on CNE-1 cell proliferation

2.2 白花蛇舌草水提物增強射線對細胞活性的抑制

CNE-1細胞經(jīng)2,4,6,8 Gy射線單獨處理24 h后,CCK-8試驗檢測細胞活性發(fā)現(xiàn),與對照組相比,2,4,6,8 Gy射線照射后相對細胞活性分別為94.7%±1.6%,85.0%±1.7%,78.2%±1.6%,71.6%±3.1%,表明射線單獨處理細胞可抑制細胞活性。隨后,將CNE-1細胞分為4組:對照組、射線組、白花蛇舌草水提物組、射線+白花蛇舌草組,然后檢測白花蛇舌草水提物結(jié)合射線對細胞活性的影響。結(jié)果顯示射線聯(lián)合白花蛇舌草水提物處理細胞后,對細胞活性的抑制作用顯著增強,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖2)。

與對照組相比,*P<0.05;與射線組相比,#P<0.05圖2 白花蛇舌草水提物聯(lián)合射線對細胞活性的影響Figure 2 The effect of Hedyotis Diffusa combined with irradiation on cell proliferation

2.3 白花蛇舌草水提物結(jié)合射線對細胞凋亡的影響

將CNE-1細胞分為4組:對照組、射線組、白花蛇舌草水提物組、射線+白花蛇舌草水提物組,流式細胞儀檢測細胞凋亡。射線和白花蛇舌草單獨處理細胞時,均可促進細胞凋亡,聯(lián)合處理顯著增加細胞凋亡率,差異具有統(tǒng)計學意義(見圖3)。

圖3 白花蛇舌草水提物結(jié)合射線對細胞凋亡的影響Figure 3 The effect of Hedyotis Diffusa combined with irradiation on cell apoptosis

2.4 白花蛇舌草水提物結(jié)合射線對LIM和SH3蛋白1(LASP1)蛋白表達的影響

熒光定量PCR檢測和Western blot分別檢測不同處理組細胞中LASP1 mRNA和蛋白表達變化。結(jié)果顯示,射線和白花蛇舌草水提物單獨處理細胞可不同程度增加LASP1的表達,聯(lián)合處理可顯著增加LASP1的表達水平,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖4)。

與對照組相比,*P<0.05;與射線組相比,#P<0.05圖4 白花蛇舌草水提物結(jié)合射線對LASP1 mRNA水平和蛋白表達的影響Figure 4 The effect of Hedyotis Diffusa combined with irradiation on LASP1 mRNA and protein levels

3 討論

鼻咽癌是鼻咽組織形成的惡性腫瘤,是一種罕見的頭頸癌,在中國南部和東南亞尤為常見。與其他以手術(shù)為主的頭頸部腫瘤不同,鼻咽癌的主要治療策略是放療。放射治療、人群篩查和有效的全身用藥等方面的進展顯著降低了鼻咽癌的死亡率。特別是調(diào)強適形放療的應(yīng)用,大大改善腫瘤控制,降低毒副作用[6]。然而,耐輻射誘導(dǎo)的局部失效仍然是鼻咽癌治療失敗的主要原因。此外,對治療的反應(yīng)因腫瘤細胞遺傳背景的個體間差異和變異而異。例如,總劑量為70-80 Gy射線照射后,部分患者鼻咽癌殘余病灶仍然存在,而其他患者僅照射40 Gy后,鼻咽癌完全緩解。因此,鼻咽癌的耐藥機制亟待闡明,以制定耐藥逆轉(zhuǎn)策略和增加生物標志物以指導(dǎo)個體化治療。

草藥已在亞洲多個國家得到應(yīng)用,已有大量研究報道天然草藥提取物的體外抗癌活性。白花蛇舌草是一種有價值的具有抗癌活性的傳統(tǒng)藥用植物。研究發(fā)現(xiàn),白花蛇舌草可顯著抑制肝癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移和促進凋亡,且白花蛇舌草通過調(diào)節(jié)肝功能、葡萄糖代謝和轉(zhuǎn)移來增強抗腫瘤作用[7,8]。白花蛇舌草通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9和細胞間黏附分子-1的表達和ERK1/2 MAPK途徑抑制乳腺癌MCF-7細胞的轉(zhuǎn)移潛能,誘導(dǎo)其凋亡[9]。近來,Song等[10]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法探討白花蛇舌草對前列腺癌的潛在作用機制,發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草可靶向多種分子抑制前列腺癌,如VEGFA、STAT3和CXCL8等。還有研究發(fā)現(xiàn),白花蛇舌草的多糖可通過EGFR/Akt/ERK信號通路抑制肺腺癌A549細胞的轉(zhuǎn)移潛能[11]。然而,白花蛇舌草在鼻咽癌細胞中的作用尚不清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著白花蛇舌草水提物濃度增加和作用時間延長,其對CNE-1細胞活性的抑制率逐漸增加,表明白花蛇舌草水提物對CNE-1細胞活性的抑制作用具有濃度依賴性和時間依賴性。射線單獨處理細胞可抑制細胞活性,而射線聯(lián)合白花蛇舌草水提物處理細胞,對細胞活性的抑制作用顯著增強。射線和白花蛇舌草單獨處理細胞時,均可促進細胞凋亡,聯(lián)合處理顯著增加細胞凋亡率。進一步研究發(fā)現(xiàn),射線和白花蛇舌草水提物聯(lián)合處理顯著增加LASP1的表達水平。也有研究表明,白花蛇舌草對鼻咽癌細胞株CNE1有顯著的增殖抑制作用,其中以親脂類提取物的作用最為明顯[12]。

LIM和SH3結(jié)構(gòu)域蛋白1(LASP1)是LIM蛋白和肌動蛋白結(jié)合蛋白家族的成員,是依賴cAMP和cGMP的信號蛋白,可以在細胞膜延伸處與肌動蛋白骨架結(jié)合。最近的研究表明,LASP1在多種惡性腫瘤中表達上調(diào),如肝癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌和腎癌[13]。LASP1已被證明與鼻咽癌細胞增殖、遷移與侵襲有[14,15]。本研究結(jié)果顯示,射線和白花蛇舌草水提物聯(lián)合處理可顯著增加LASP1的表達水平,表明LASP1可能參與白花蛇舌草水提物對鼻咽癌細胞放療增敏的作用。

綜上所述,本研究證實白花蛇舌草對鼻咽癌細胞具有放射增敏作用,且LASP1可能參與白花蛇舌草水提物對鼻咽癌細胞放療增敏的作用。