陳嘉鑫,馮建國(guó),賈 靜,劉 行,王曉斌

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科,瀘州 646000;*通訊作者,E-mail:wang-xiaobin67@163.com)

傳統(tǒng)抗抑郁藥物起效慢,一般在開始治療數(shù)周后才顯現(xiàn)明顯的治療效果[1-3],因此,臨床上迫切需要開發(fā)快速、有效的抗抑郁新藥。相關(guān)基礎(chǔ)和臨床研究均表明氯胺酮具有快速而明顯的抗抑郁作用[4-6],但其機(jī)制不清楚,闡明其快速抗抑郁機(jī)制,對(duì)今后開發(fā)快速起效的抗抑郁新藥具有重要意義。

18F-脫氧葡萄糖正電子發(fā)射斷層掃描(18F-fluorodeoxyglucose positron emission tomography,18F-FDG PET)研究發(fā)現(xiàn),抑郁癥大鼠相關(guān)腦區(qū)葡萄糖代謝率明顯低于正常大鼠[7]。與健康志愿者相比,抑郁癥患者的局部腦葡萄糖代謝率(regional cerebral metabolic rate of glucose,rCMRglu)也明顯降低[8,9]。有趣的是,Mishra等[10]發(fā)現(xiàn)氯胺酮在快速緩解抑郁癥大鼠抑郁癥狀的同時(shí),還伴隨神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞葡萄糖代謝的增加,然而氯胺酮通過(guò)什么途徑增加腦葡萄糖代謝,進(jìn)而發(fā)揮快速抗抑郁作用尚不清楚。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是數(shù)量最多、作用最廣泛的膠質(zhì)細(xì)胞[11],是整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組成部分,并發(fā)揮許多復(fù)雜的功能[12]。星形膠質(zhì)細(xì)胞周圍包裹著大腦的微血管,且分布著大量葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(glucose transporters,GLUTs)[13]。葡萄糖是神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的主要能量底物,星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體負(fù)責(zé)葡萄糖的吸收[14]。因此,本研究主要探討氯胺酮對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞葡萄糖吸收、GLUTs、相關(guān)信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、GLUT1、磷酸化AMPK、總ERK1/2、磷酸化ERK1/2抗體及BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天公司;GLUT3及GLUT4抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;磷酸化AKT及總AKT購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司;GAPDH,β-actin抗體、羊抗鼠二抗及羊抗兔二抗購(gòu)自中國(guó)Proteintech公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞株(HA1800)購(gòu)自中國(guó)博士德生物公司；細(xì)胞在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、以及100 μg/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)箱環(huán)境維持在37 ℃、5% CO2條件。

1.3 葡萄糖吸收檢測(cè)

熒光D-葡萄糖同系物2-(N-7-硝基-2,1,3-苯并惡二唑-4-氨基)-2-脫氧-D-葡萄糖(2-NBDG)(購(gòu)自美國(guó)APExBIO公司)用于細(xì)胞葡萄糖吸收檢測(cè)。HA1800細(xì)胞接種在24孔板中,待細(xì)胞匯合度達(dá)到50%時(shí),進(jìn)行如下處理:①將細(xì)胞分為對(duì)照組(0 h)、50 μmol/L氯胺酮組分別處理0.5,3,6,12,24 h;②將細(xì)胞分為對(duì)照組(0 μmol/L),氯胺酮組分別用10,25,50,100,200 μmol/L的氯胺酮處理6 h。待上述作用結(jié)束后,再用100 μmol/L 2-NBDG在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次終止2-NBDG繼續(xù)吸收,用4%多聚甲醛固定20 min后,再用PBS洗3次后立即用熒光顯微鏡觀察(購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司)。利用ImageJ軟件對(duì)熒光進(jìn)行分析。

1.4 Western blot檢測(cè)GLUTs以及ERK1/2、AKT、AMPK信號(hào)通路蛋白表達(dá)

HA1800細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中,在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h,將細(xì)胞分為對(duì)照組(0 μmol/L),氯胺酮組分別用10,25,50,100 μmol/L的氯胺酮處理6 h,上述作用結(jié)束后,用PBS洗滌細(xì)胞3次后加入RIPA細(xì)胞裂解液(按1 ∶100加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑),放置冰上裂解細(xì)胞。蛋白濃度用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定。將每組樣本的細(xì)胞總蛋白等量進(jìn)行SDS-PAGE電泳后恒流轉(zhuǎn)膜1 h,轉(zhuǎn)印后的NC膜用5%的脫脂牛奶封閉1 h,TBST洗滌3次后,分別用GLUT1(1 ∶500)、GLUT3(1 ∶100)、GLUT4(1 ∶200)、t-ERK1/2(1 ∶1 000)、p-ERK1/2(1 ∶1 000)、t-AKT(1 ∶1 000)、p-AKT(1 ∶1 000)、p-AMPK(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶2 500)、β-actin(1 ∶5 000)的第一抗體在4 ℃孵育NC膜過(guò)夜。第2天重復(fù)洗滌后,分別用羊抗鼠二抗(1 ∶2 500)或羊抗兔二抗(1 ∶5 000)孵育1 h,在NC膜上加入ECL顯色劑后檢測(cè)目標(biāo)蛋白變化。利用ImageJ軟件對(duì)條帶灰度進(jìn)行分析。

1.5 細(xì)胞免疫熒光

免疫熒光用于檢測(cè)p-ERK1/2在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。HA1800接種于24孔板中并在37 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜。將細(xì)胞分為對(duì)照組(0 μmol/L)、氯胺酮組用50 μmol/L氯胺酮處理,作用6 h后立即用4%多聚甲醛固定20 min,再用PBS洗滌細(xì)胞3次。用1%胎牛血清蛋白在室溫下封閉1 h,孵育p-ERK1/2(1 ∶1 000)一抗在4 ℃搖床過(guò)夜。第二天用PBS洗滌細(xì)胞3次后,在室溫下避光孵育羊抗鼠(1 ∶2 500)二抗及細(xì)胞核染料DAPI,用抗熒光猝滅劑封片后立即于熒光顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 氯胺酮增加HA1800細(xì)胞葡萄糖吸收

葡萄糖吸收檢測(cè)顯示,與0 h相比,50 μmol/L氯胺酮在6 h時(shí)2-NBDG吸收差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018,見(jiàn)圖1)。與0 μmol/L相比,25,50,100 μmol/L濃度的氯胺酮作用6 h后2-NBDG攝取差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為0.003 3,0.000 1,0.007 4,見(jiàn)圖2)。氯胺酮對(duì)2-NBDG吸收的促進(jìn)作用在50 μmol/L濃度時(shí)到達(dá)高峰,然而當(dāng)濃度≥200 μmol/L以及≤10 μmol/L時(shí)對(duì)2-NBDG攝取的增加具有限制作用(P分別為0.792 8,0.140 6,見(jiàn)圖2)。

與0 h比較,*P<0.05圖1 50 μmol/L氯胺酮作用不同時(shí)間對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞葡萄糖吸收的影響Figure 1 Effect of 50 μmol/L ketamine on glucose uptake in astrocytes at different time points

與0 μmol/L比較,**P<0.01,***P<0.001圖2 不同濃度氯胺酮作用6 h對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞葡萄糖吸收的影響Figure 2 Effect of different concentrations of ketamine for 6 h on glucose uptake in astrocytes

2.2 氯胺酮增加HA1800細(xì)胞GLUT3表達(dá)

經(jīng)不同濃度氯胺酮處理6 h后,One-way ANOVA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)只有GLUT3響應(yīng)氯胺酮的刺激(F4,10=3.610,P=0.045 4),其中與0 μmol/L組相比,只有50 μmol/L氯胺酮組的GLUT3表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.014,見(jiàn)圖3)。

與0 μmol/L比較,*P<0.05圖3 氯胺酮對(duì)GLUT1、3、4表達(dá)的影響Figure 3 The effect of ketamine on the expression of GLUT 1, 3, 4 in HA1800 cells

2.3 氯胺酮增加HA1800細(xì)胞內(nèi)磷酸化ERK1/2表達(dá)水平

one-way ANOVA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)不同濃度氯胺酮作用6 h后,p-ERK1/2表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F4,10=5.598,P=0.012 5),與0 μmol/L相比,50 μmol/L氯胺酮處理后p-ERK1/2表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006 9,見(jiàn)圖4)。然而與0 μmol/L相比,p-AKT以及p-AMPK表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)圖4)。

與0 μmol/L比較,**P<0.01圖4 氯胺酮對(duì)p-ERK1/2、p-AKT以及p-AMPK表達(dá)的影響Figure 4 The effect of ketamine on the expression of phospho-ERK1/2, phospho-AKT, and phospho-AMPK

2.4 氯胺酮調(diào)節(jié)磷酸化ERK1/2細(xì)胞內(nèi)亞定位

與對(duì)照組(0 μmol/L)比較,免疫熒光檢測(cè)顯示經(jīng)50 μmol/L氯胺酮作用6 h后,p-ERK1/2由HA1800細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),聚集明顯(見(jiàn)圖5)。

圖5 氯胺酮調(diào)節(jié)P-ERK1/2亞細(xì)胞定位Figure 5 The effect of ketamine on subcellular location of phospho-ERK1/2

3 討論

氯胺酮具有快速而明顯的抗抑郁作用,但其抗抑郁機(jī)制尚不清楚[15,16]。有研究發(fā)現(xiàn)氯胺酮抗抑郁的同時(shí)伴隨腦內(nèi)葡萄糖代謝率(CMRGlc)升高[10],因此我們猜測(cè)CMRGlc升高可能是由于腦內(nèi)葡萄糖攝取增加所致。由于星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著許多重要且復(fù)雜的功能[12],且星形膠質(zhì)細(xì)胞及其相關(guān)標(biāo)志物的減少是抑郁癥病理學(xué)變化的關(guān)鍵特征[17,18],因此本實(shí)驗(yàn)觀察了不同濃度氯胺酮對(duì)人來(lái)源的正常星形膠質(zhì)細(xì)胞(HA1800)葡萄糖攝取的影響。我們的研究結(jié)果表明50 μmol/L氯胺酮(相當(dāng)于臨床亞麻醉劑量[19])作用6 h可顯著增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞葡萄糖吸收。但氯胺酮通過(guò)什么途徑誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞葡萄糖攝取增加尚不清楚。

相關(guān)研究表明葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUTs)在星形膠質(zhì)細(xì)胞葡萄糖攝取增加中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20],由于GLUT1、3、4在大腦葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用[21],因此我們檢測(cè)了GLUT1、3、4蛋白在HA1800細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。在生理?xiàng)l件下,培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞主要表達(dá)GLUT1,而GLUT3的表達(dá)水平相對(duì)較低,但在輕度缺血[22]、內(nèi)毒素脂多糖(LPS)[23]等應(yīng)激條件下GLUT3表達(dá)明顯增加。GLUT4是一種胰島素依賴的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,其調(diào)控機(jī)制與GLUT1或GLUT3的機(jī)制不同[24]。因此,本研究進(jìn)一步檢測(cè)了氯胺酮對(duì)HA1800細(xì)胞GLUT1、GLUT3和GLUT4的表達(dá),結(jié)果表明氯胺酮誘導(dǎo)HA1800細(xì)胞葡萄糖吸收增加是通過(guò)GLUT3而非GLUT1或GLUT4。由于GLUT3轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞外葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的速度大約是GLUT1的7倍[25],所以我們認(rèn)為氯胺酮處理后HA1800細(xì)胞GLUT3表達(dá)增強(qiáng)是可以解釋的。我們的結(jié)果與Tomioka等[26]發(fā)現(xiàn)氯胺酮通過(guò)對(duì)爪蟾卵母細(xì)胞GLUT3表達(dá)增加從而提高葡萄糖攝取的研究一致,此外,Iasevoli等[27]也發(fā)現(xiàn)氯胺酮可誘導(dǎo)大鼠GLUT3 mRNA的表達(dá)增加。但目前尚不清楚哪些信號(hào)通路與氯胺酮誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞GLUT3表達(dá)增加有關(guān)。

有研究表明激活ERK1/2,AKT和AMPK信號(hào)通路能促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞葡萄糖攝取[28,29]。我們的結(jié)果表明,氯胺酮處理星形膠質(zhì)細(xì)胞后只增加了p-ERK1/2的表達(dá),而不影響p-AKT和p-AMPK的表達(dá)水平,免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)也顯示氯胺酮可以誘導(dǎo)p-ERK1/2從細(xì)胞質(zhì)易位進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi),進(jìn)而產(chǎn)生誘導(dǎo)增殖、分化等生理過(guò)程[30,31],但p-ERK1/2進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)是否進(jìn)一步調(diào)控了GLUT3的表達(dá),需在今后研究中進(jìn)一步明確。

我們的研究證明氯胺酮可增加星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取,但尚不清楚進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖參與怎樣的代謝過(guò)程。Pellerin等[32]認(rèn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)糖酵解將葡萄糖轉(zhuǎn)化為能量底物乳酸,再傳送給周圍神經(jīng)元提供能量,即星形膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元乳酸穿梭模型(astrocyte-neuron lactate shuttle hypothesis,ANLS)。但氯胺酮是否可致星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放乳酸,以及乳酸后續(xù)是否為神經(jīng)元提供能量,尚需在今后研究中進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述,我們的研究結(jié)果表明氯胺酮通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路增加GLUT3表達(dá),從而促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取。