張?jiān)柒妨崃?，?利，陳鴻鵠，張俊彥，陳建才，張 政

克羅諾桿菌(Cronobacterspp.)是嬰幼兒奶粉中常見的檢出菌，患兒感染后多有發(fā)熱、腹痛、腹瀉、嘔吐、粘血便等癥狀，嚴(yán)重者可致壞死性小腸結(jié)腸炎、敗血癥和腦膜炎，病死率達(dá)40%～80%[1-5]。國(guó)標(biāo)GB10765-2010中規(guī)定嬰幼兒配方食品中不得檢出克羅諾菌。克羅諾菌檢測(cè)目前主要采用生化檢測(cè)法。該法特異性高，但耗時(shí)長(zhǎng)。不利于對(duì)檢測(cè)周期有高要求的工作。適配子是人工合成的單鏈DNA或RNA，可以和靶物質(zhì)高特異性結(jié)合，具有抗體無法比擬的優(yōu)勢(shì)：靶物質(zhì)范圍廣；更高的親和力和特異性；制備中不需進(jìn)行動(dòng)物免疫，成本低；該技術(shù)出現(xiàn)以來已經(jīng)在臨床檢驗(yàn)、食源性致病菌檢測(cè)等方面表現(xiàn)出了很好的應(yīng)用效果[6-9]。

在目前的細(xì)菌分類學(xué)中，克羅諾桿菌屬包含7個(gè)種，分別為阪崎克羅諾菌(Cronobactersakazakii)、丙二酸鹽克羅諾菌(Cronobactermalonaticus)、蘇黎世克羅諾菌(Cronobacterturicensis)、莫金斯克羅諾菌(Cronobactermuytjensii)、Cronobactercondimenti、Cronobacteruniversalis和Cronobacterdublinensis。其中，阪崎克羅諾菌在環(huán)境、食品和病人樣本中的分布最為廣泛[10-11]。在本研究中，我們通過SELEX(指數(shù)富集配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù))篩選出阪崎克羅諾菌特異性適配子，為建立基于適配子技術(shù)的阪崎克羅諾菌快速檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)，并對(duì)適配子的二級(jí)空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1生物信息學(xué)分析 使用BLAST 2.2.25、ClustalX軟件對(duì)40株阪崎克羅諾菌的基因組序列進(jìn)行比較分析，菌株具體信息見表1。核心基因組參數(shù)設(shè)定：氨基酸序列覆蓋度和相似度均為50%。使用pSORTb 軟件分析蛋白亞細(xì)胞定位,使用SignalP 和TMHMM進(jìn)行蛋白信號(hào)肽和跨膜區(qū)預(yù)測(cè)。

表1 40株阪崎克羅諾菌基因組信息
Tab.1 Genomic profiles of 40Cronobactersakazakiistrains

菌株號(hào)基因組長(zhǎng)度/Mb基因數(shù)基因組序列①Cronobacter sakazakii ATCC 295444.664520GCA_000982825.1Cronobacter sakazakii 6964.995212GCA_000316155.1Cronobacter sakazakii 7014.855096GCA_000319595.1Cronobacter.sakazakii 6804.364324GCA_000319615.1Cronobacter sakazakii E7644.444264GCA_000409245.1Cronobacter sakazakii 21514.384093GCA_000409265.1 Cronobacter sakazakii 7034.624466GCA_001309375.1Cronobacter sakazakii 6994.674549GCA_001309095.1Cronobacter sakazakii 7084.674544GCA_001309385.1Cronobacter sakazakii 6904.674552GCA_001309155.1Cronobacter sakazakii 6914.544435GCA_001309215.1Cronobacter sakazakii 767 4.514386GCA_001308955.1Cronobacter sakazakii 7094.544441GCA_001309035.1Cronobacter sakazakii 705 4.544442GCA_001309055.1Cronobacter sakazakii 6954.554437GCA_001309015.1Cronobacter sakazakii 7064.564475GCA_001309045.1Cronobacter sakazakii 692 4.544432GCA_001309295.1Cronobacter sakazakii 7024.564432GCA_001308935.1Cronobacter sakazakii 6944.544421GCA_001309135.1Cronobacter sakazakii 7074.544442GCA_001308965.1Cronobacter sakazakii 7114.574481GCA_001309415.1Cronobacter sakazakii 7304.544456GCA_001309275.1Cronobacter sakazakii 6984.544428GCA_001309225.1Cronobacter sakazakii 700 4.644562GCA_001309115.1 Cronobacter sakazakii 6934.564459GCA_001309175.1Cronobacter sakazakii ES354.354151GCA_000409405.1Cronobacter sakazakii 83994.654542GCA_000467775.2表1(續(xù))菌株號(hào)基因組長(zhǎng)度/Mb基因數(shù)基因組序列①Cronobacter sakazakii NM12404.494409GCA_000974965.1Cronobacter sakazakii ATCC BAA-8944.534382GCA_000017665.1Cronobacter sakazakii ES15 4.274084GCA_000263215.1Cronobacter sakazakii SP2914.524390GCA_000339015.1 Cronobacter sakazakii ES7134.554364GCA_001971035.1Cronobacter sakazakii NCIMB 82724.574450GCA_000463095.2Cronobacter sakazakii HPB51744.444291GCA_000698225.1Cronobacter sakazakii 7124.424320GCA_001308945.1Cronobacter sakazakii 7134.554446GCA_001309345.1Cronobacter sakazakii 7144.554455GCA_001309305.1Cronobacter sakazakii 7154.564473GCA_001309185.1Cronobacter sakazakii 716 4.804723GCA_001309235.1Cronobacter sakazakii NCTC81554.614471GCA_001277275.1

①：基因組序列來自NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome)。

1.2基因表達(dá)量測(cè)定 使用RNA 抽提試劑盒(TaKaRa, 中國(guó))和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa, 中國(guó))進(jìn)行C.sakazakiiATCC 29544菌株的RNA提取和反轉(zhuǎn)錄，使用SYBR green PCR試劑盒(Qiagen, 德國(guó))檢測(cè)表達(dá)量。

1.3候選靶蛋白的克隆、表達(dá)和純化 基因克隆引物見表2，表達(dá)載體使用pet28a，表達(dá)誘導(dǎo)條件：0.1～0.5 mmol/L IPTG。Ni親和層析柱純化蛋白。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定蛋白純度。

表2 基因克隆引物
Tab.2 Primers for gene clone

基因引物(5'-3')酶切位點(diǎn)WP_071601484.1_2838F:GGAATTCCATATGGCCAGCCAGAGCGACGACTACGTGCNdeI, HindIIIR:CCCAAGCTTTTAGTGATGATGATGGTGATGAGGCACCGGTGCCAGCAGWP_029039202.1_2678F:GGAATTCCATATGCTGGAAGGCGACGACGCGCTGCCGCNdeI, HindIIIR:CCCAAGCTTTTAGTGATGATGATGGTGATGTGGCGTACCCTCGCGAWP_007892488.1_775F:GGAATTCCATATGATGAAAAACAGGTTTCGCCAGGGAGANdeI, XhoIR:CCCTCGAGTTAGTGATGATGATGGTGATGTCCGGCCGTGAGCGCCWP_007892506.1_762F:CTAGTCTAGAATGATAAAAAAAATCTCGCTGCTGAXbaI, HindIIIR:CCCAAGCTTTTAGTGATGATGATGGTGATGGAAGGTGTAGCTGCCTWP_007865575.1_4015F:GGAATTCCATATGTCGGCGCTGGAAGCGCCACGCACCGNdeI, HindIIIR:CCCAAGCTTTTAGTGATGATGATGGTGATGAAACTGCAAGCGCAGC

下劃線序列為不同限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的核苷酸序列

1.4蛋白偶聯(lián) 候選靶蛋白和BioMagPlus羧基磁珠(Polysciencss，美國(guó))偶聯(lián)，活化及偶聯(lián)過程按BioMagPlus說明書進(jìn)行。紫外分光光度計(jì)測(cè)定偶聯(lián)前后280 nm吸光度，計(jì)算磁珠包被蛋白的效率。包被效率=(OD偶聯(lián)前-OD偶聯(lián)后)/OD偶聯(lián)前×100%。

1.5ssDNA文庫(kù)的構(gòu)建和引物合成 用于WP_007892506.1_762蛋白適配子篩選的文庫(kù)和引物序列見表3。

表3 用于WP_007892506.1_762蛋白適配子篩選的文庫(kù)和引物序列
Tab.3 Library and primers for adaptor screening of protein WP_007892506.1_762

文庫(kù)和引物名稱序列(5'-3')文庫(kù)ATACCAGCTTATTCAATTCG-N40-AGATAGTAAGTGCAATCTGG引物 P1-2ATACCAGCTTATTCAATTCG引物 P2-2CCAGATTGCACTTACTATCT引物 P3-2triple Biotin- CCAGATTGCACTTAC-TATCT

1.6SELEX 篩選 ssDNA文庫(kù)變性處理后與候選靶蛋白包被的羧基磁珠混勻，加入酵母tRNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，反應(yīng)體系置磁力架，吸棄上清。緩沖液洗去未結(jié)合的 ssDNA，重復(fù)洗滌2 次。結(jié)合了 ssDNA 的羧基磁珠中加入去離子水，100 ℃加熱 5 min，置磁力架 3～4 min，取上清為 PCR 模板。反應(yīng)體系：模板 5 μL，P1-1或P1-2 (10 μmol/L)1 μL，P3-1或P3-2 (10 μmol/L) 1μL，dNTP(各2.5 mmol/L) 4 μL，10×Buffer 5 μL，Taq DNA聚合酶 0.25 μL，ddH2O 36.75 μL，共50 μL。PCR產(chǎn)物使用DNA純化試劑盒 (Qiagen,德國(guó))進(jìn)行純化。純化后的一端標(biāo)有生物素的dsDNA與鏈霉親和素磁珠結(jié)合，堿分離獲得不帶生物素的另一條ssDNA，測(cè)定核酸濃度，作為下一輪篩選的富集庫(kù)。重復(fù)以上步驟進(jìn)行篩選。從第三輪每輪使用空磁珠反篩。每隔1輪使用OliGreen 熒光染料標(biāo)記ssDNA 文庫(kù)，TBS-380熒光儀測(cè)試篩選前后的熒光強(qiáng)度，計(jì)算ssDNA與靶蛋白結(jié)合百分率。

1.7適配子克隆和測(cè)序 WP_007892506.1_762第10輪篩選產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系：模板 2 μL，P1-1或P1-2(10 μmol/L)1 μL，P2-1或P2-2(10 μmol/L)1 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，加ddH2O 至50 μL。擴(kuò)增產(chǎn)物2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收純化。純化產(chǎn)物與pMD19-T載體(Invitrogen, 美國(guó))連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取陽(yáng)性單克隆于LB(Amp 100 μg/mL)37 ℃過夜。送上海生工測(cè)序。

1.8適配子結(jié)構(gòu)分析 使用RNA structure軟件模擬適配子二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.9單個(gè)適配子的獲得 根據(jù)候選適配子的核酸序列，人工合成5’端標(biāo)記地高辛的候選適配子。

1.10適配子與靶蛋白的親和力測(cè)定 分別配制50 μg/mL候選靶蛋白、BSA溶液，取100 μL于微孔板， 4 ℃過夜。封閉液37 ℃封閉1 h。棄去孔內(nèi)液體， 200 μL PBS洗滌4遍。地高辛適配子濃度500 nmol/L變性處理后每孔加入100 μL，37 ℃孵育1 h。棄去孔內(nèi)液體，200 μL PBST洗滌4遍。每孔加入100 μL(1∶1 000)堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體,37 ℃孵育30 min，200 μL PBST洗滌3遍。加入100 μL底物，37 ℃顯色10 min，加入50 μL終止液，酶標(biāo)儀405 nm讀數(shù)。

1.11生物素化適配子和鏈霉親和素磁珠偶聯(lián)試驗(yàn)

根據(jù)Dynabeads M-280 鏈霉親和素磁珠(Thermo Fisher Scientific, 美國(guó))單鏈寡核苷酸偶聯(lián)劑量,每毫克磁珠偶聯(lián)200 pmol/L的生物素化適配子，偶聯(lián)步驟按說明書進(jìn)行。

1.12適配子磁珠吸附性能比較 使用C.sakazakiiATCC29544的培養(yǎng)物對(duì)適配子磁珠的吸附能力進(jìn)行比較。制備一定濃度的菌液，平板菌落計(jì)數(shù)。同時(shí)，各取1 mL菌液加入0.5 mg適配子磁珠中，37 ℃孵育1 h，磁力架分離磁珠，取上清進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。吸附率=(吸附前菌落數(shù)-吸附后菌落數(shù))/吸附前菌落數(shù)×100%。

1.13適配子磁珠捕獲目標(biāo)菌特異性實(shí)驗(yàn) 選取非目標(biāo)菌：大腸埃希氏菌ATCC29522、腸炎沙門氏菌ATCC54001、福氏志賀氏菌ATCC12022、蠟樣芽孢桿菌CMCC63033進(jìn)行磁珠捕獲特異性研究，菌株處理方法和吸附率計(jì)算同1.12。

2 結(jié) 果

2.1阪崎克羅諾菌核心基因組分析和編碼蛋白亞細(xì)胞定位 阪崎克羅諾菌核心基因組分析顯示共包括2 188個(gè)核心基因。使用pSORTb 3.0 軟件對(duì)核心基因編碼蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，其中34個(gè)蛋白位于外膜(表4)。選擇其中15個(gè)在阪崎克羅諾菌種內(nèi)氨基酸序列相似度≥90%,與其它22種常見食源性細(xì)菌(Escherichiacoli、Salmonellaenteritidis、Salmonellatyphimurium.、Shigelladysenteriae、Shigellaflexneri、Shigellaboydii、Shigellasonnei、Bacilluscereus、Bacillusthuringiensis、Bacillusmycoides、Staphylococcusaureus、Yersiniapseudotuberculosis、Yersinia.enterocolitica、Vibrioparahaemolyticus、Vibriovulnificus、Vibriofluvialis、Vibrioalginolyticus、Campylobacterjejuni、Listeriamonocytogenes、Listeriainnocua、Clostridiumperfringens、Pseudomonasaeruginosa)氨基酸序列最高相似度≤70%的編碼蛋白作為篩選適配子的候選靶蛋白。

表4 阪崎克羅諾菌核心基因組中的外膜蛋白編碼基因
Tab.4 Outer membrane protein encoding genes in core genome ofCronobactersakazakii

序號(hào)基因編碼蛋白序列ID1nlpENlpEWP_007896680.1_742bmaABamAWP_004386130.1_923traTTraTWP_004388372.1_1444-Hypothetical proteinWP_071601447.1_2405-chitinaseWP_007889641.1_2556fecAFecAWP_007898891.1_4257-Sucrose porinWP_007896602.1_5128-phospholipase AWP_004388410.1_7129-outer membrane vitamin B12 receptor①②WP_007892506.1_76210papCPilus assembly protein PapC①②WP_007892488.1_77511papCPilus assembly protein PapCWP_029039177.1_101412envCmurein hydrolase activator EnvCWP_032975803.1_105213hofQDNA transporter HofQ①②WP_071601442.1_125214-maltoporinWP_007888874.1_137915-hemolysin activator proteinWP_029039409.1_139716blcOuter membrane lipoprotein BlcWP_071844239.1_145217-fimbrial assembly proteinWP_029039348.1_151418-murein transglycosylase AWP_029039229.1_176519-host specificity protein①②WP_046623022.1_217120mlaAphospholipid-binding lipoprotein MlaAWP_004387036.1_220321-phage tail length tape measure proteinWP_029039590.1_235222-inverse autotransporter beta-barrel domain-containing protein①②WP_052367211.1_239223-fimbrial assembly protein①②WP_029039202.1_267824-hypothetical protein①②WP_007888065.1_277725-invasin①②WP_071601484.1_283826-TonB-dependent siderophore receptor①②WP_029039152.1_287327-transporter①②WP_029039384.1_298028-Autotransporter domain-containing esterase①WP_007900185.1_313629-Hypothetical proteinWP_029039106.1_319230-Hypothetical protein①WP_029038961.1_340331mipAMltA-interacting protein MipA①②WP_007893938.1_348432-host specificity protein①WP_046623084.1_352033-phospholipid: lipid A palmitoyltransferase①WP_007865575.1_401534-TonB-dependent siderophore receptorWP_029039173.1_4042

①：在阪崎克羅諾菌種內(nèi)氨基酸序列相似度≥90%的蛋白, 與其它種細(xì)菌氨基酸序列最高相似度≤70%的蛋白。

②：無跨膜區(qū)蛋白。

2.2候選靶蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè) 因?yàn)橥饽さ鞍椎目缒^(qū)位于外膜的內(nèi)部，如果和適配子結(jié)合的部位位于這個(gè)部分，則會(huì)影響適配子和目標(biāo)菌的結(jié)合效果。因此使用TMHMM v2.0軟件對(duì)15個(gè)候選蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè)，選擇跨膜區(qū)少或沒有的蛋白作為進(jìn)一步的候選蛋白。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：13個(gè)蛋白不具有跨膜區(qū)(表4)，做為下步試驗(yàn)候選蛋白。

2.3候選蛋白表達(dá)量測(cè)定 以阪崎克羅諾菌ATCC 29544培養(yǎng)物為檢測(cè)對(duì)象。檢測(cè)上述13個(gè)候選蛋白的表達(dá)量，以16S rDNA為內(nèi)參(表5)，選擇表達(dá)量最高的WP_071601484.1_2838，WP_029039202.1_2678，WP_029039152.1_2873，WP_007892506.1_762，WP_007865575.1_4015進(jìn)行基因克隆和表達(dá)。

表5 候選蛋白編碼基因熒光定量PCR檢測(cè)引物及檢測(cè)結(jié)果
Tab.5 Primers and detection results of fluorescence PCR

基因上游引物(5'-3')下游引物(5'-3')Ct①WP_007892506.1_762GCGTGGGTGGGCTTTCTGTGGCAGTCACAATTTCGACCA23.25WP_007892488.1_775TATCCTGGCGTGTTTGTGGCTACTTTCTGCGACGTGTTCT32.27WP_071601442.1_1252TCGCTGGTGGCGGATGAAAGACGACGCCCTCAACACCC35.68WP_046623022.1_2171AGGCGGTCAGCGGTCGTAATTCCAGGTGCCGTCGTTGTTGUNWP_052367211.1_2392TGATTTCCTGGCTCCGTTCTTACCGCCGAACATCCAGT29.17WP_029039202.1_2678GGCACGCATCACGCTTATTCCTGCTGTACCGTCACTTTGC21.20WP_007888065.1_2777ATGCCGCCACAGCCTATCCGGTTACTACGGTCTGAACCTG33.25WP_071601484.1_2838GACGCTGTCGGTATTCCTTGCCGGCGTCAGGCTCAGCGC26.17WP_029039152.1_2873CAGACGCCGACGATTACGACTGGCGTTGCTGTTGCTGTT27.26WP_029039384.1_2980 TCCCGCAGATTCAGCACCGCAACGACGACGGCAACT30.66WP_007893938.1_3484CGCAAAGCAACGCTGATGCCGTTGGTGTAGCGATAGAG33.49WP_046623084.1_3520AAGTGGAAGCGGTGATGGACGAAACTCACCATCCGGTC35.02WP_007865575.1_4015ATCCCGATTCCGCTGGTGCGCAGCCAGGCGAAGTAA25.1116SrDNAATGGACGCAAGTCTGATGGTGACTTTCTGGTTGATTACCG9.16

①Ct為兩次實(shí)驗(yàn)的平均值。

2.4基因克隆、表達(dá)、蛋白純化及羧基磁珠包被 5個(gè)基因通過克隆，蛋白表達(dá)和Ni柱純化后，WP_007892506.1_762基因獲得大量純化蛋白，SDS-PAGE電泳檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)明顯的非特異性條帶(圖1)，選擇WP_007892506.1_762編碼蛋白進(jìn)行適配子篩選。使用500 μg WP_007892506.1_762蛋白包被10 mg羧基磁珠，包被效率為93%。

圖1 WP_007892506.1_762純化蛋白SDS-PAGE電泳檢測(cè)圖Fig.1 SDS-PAGE of WP_007892506.1_762 purified protein

2.5WP_007892506.1_762蛋白適配子篩選 使用WP_007892506.1_762蛋白包被的羧基磁珠對(duì)人工合成的適配子文庫(kù)進(jìn)行篩選，經(jīng)過10輪篩選，結(jié)合率不再上升。最高結(jié)合率為43.2%(表6)。

表6 WP_007892506.1_762蛋白適配子篩選參數(shù)
Tab.6 Screening parameters of adaptor for WP_007892506.1_762

Selex輪數(shù)ssDNA文庫(kù)/pmol蛋白/μg結(jié)合率(%)1200010-21301012.139810-4120817.551108-6130823.17896-8120639.89966-10110643.2111206-1280436.8131404-1490433.4

2.6候選適配子一級(jí)結(jié)構(gòu) 在WP_007892506.1_762的TA克隆中各挑選20個(gè)克隆，測(cè)序，20個(gè)克隆中，1個(gè)為空載體，有3個(gè)不同的核酸序列(表7)。

表7 WP_007892506.1_762 蛋白候選適配子序列
Tab.7 Sequences of candidate adaptors for WP_007892506.1_762

序列號(hào)核酸序列自由能S1ATACCAGCTTATTCAATTCGCTAGGTCTGATAGACAGGACGGATGAC-TAGGACGGAGATAAGATAGTAAGTGCAATCTGG-6.1S2ATACCAGCTTATTCAATTCGAAAGCTAGATCAGGACTGAGACCTGAAT-CATGCACTAGCAAGATAGTAAGTGCAATCTGG-12.6S3ATACCAGCTTATTCAATTCGAATCAGGTTGGGTTTTGAGTCTGAGTA-AAGGTCGAGTCGAAGATAGTAAGTGCAATCTGG-10.5

下劃線序列為ssDNA文庫(kù)的保守序列區(qū)。

2.7靶蛋白和候選適配子親和力檢測(cè) 使用酶聯(lián)適配子直接檢測(cè)法鑒定靶蛋白與候選適配子的結(jié)合力，結(jié)果顯示：WP_007892506.1_762蛋白與適配子 S1結(jié)合后的吸光度值明顯高于 BSA 和空白對(duì)照組(P=0.0021;P=0.0020), 見表8。

表8 靶蛋白和候選適配子的結(jié)合親和力
Tab.8 Binding affinity between target protein and candidate adaptors

候選適配子空白BSAWP_007899202.1_762S10.088±0.002①0.115±0.008②0.796±0.075③S20.125±0.0270.136±0.0060.495±0.015S30.076±0.0100.098±0.0130.253±0.024

以上數(shù)值為3次實(shí)驗(yàn)的平均值

③和①、② 相比具有顯著性差異

2.8適配子磁珠吸附性能比較 阪崎克羅諾菌ATCC29544的培養(yǎng)物和S1、S2、S3適配子磁珠的吸附效率見表9, 結(jié)果表明：S3適配子磁珠不具有目標(biāo)菌吸附能力, S1適配子磁珠吸附效率較高,最高為23.1%。

表9 適配子磁珠吸附性能比較(%)
Tab.9 Adsorptivity of adaptors magnetic bead

原始菌量(CFU)S1適配子磁珠吸附率S2適配子磁珠吸附率S3適配子磁珠吸附率6.5×105---6.5×10420.015.5-6.5×10323.112.4-6.5×10215.4--

以上數(shù)值為兩次實(shí)驗(yàn)的平均值

2.9S1、S2 適配子磁珠菌體吸附特異性研究 選取非目標(biāo)菌：大腸埃希氏菌ATCC29522、腸炎沙門氏菌ATCC54001、福氏志賀氏菌ATCC12022、蠟樣芽孢桿菌CMCC63033進(jìn)行磁珠吸附特異性研究。原始菌量分別為2.1×105～2.1×102CFU, 8.5×105～8.5×102CFU, 5.2×105～5.2×102CFU和6.8×105～6.8×102CFU。結(jié)果表明：S1、S2 適配子磁珠對(duì)非目標(biāo)菌無吸附能力。

2.10適配子二級(jí)結(jié)構(gòu) 根據(jù)自由能最低原則，使用RNAstructure軟件對(duì)適配子S1和S2的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，結(jié)果顯示：適配子的二級(jí)結(jié)構(gòu)以莖環(huán)結(jié)構(gòu)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)為主(圖2)。

3 討 論

傳統(tǒng)的微生物學(xué)檢測(cè)方法步驟多，時(shí)間長(zhǎng)，較難滿足快速檢測(cè)的需要。分子生物學(xué)和免疫學(xué)檢測(cè)方法雖然快速、方便，但當(dāng)樣品中的目標(biāo)菌濃度較低時(shí)，仍需要較長(zhǎng)時(shí)間的前增菌過程。針對(duì)此種情況，免疫磁珠特異性富集樣品中目標(biāo)菌的方法得到快速發(fā)展，可以有效富集樣品中的目標(biāo)菌，縮短樣品的前處理過程[12-13]。免疫磁珠是利用超順磁性磁珠表面的功能基團(tuán)，主要包括氨基、羧基和巰基等結(jié)合相應(yīng)的抗體，再利用抗體和目標(biāo)菌的特異性結(jié)合來實(shí)現(xiàn)菌體的富集。但免疫磁珠的制備過程相對(duì)復(fù)雜，需要通過動(dòng)物免疫獲得相應(yīng)的特異性抗體，需要考慮動(dòng)物是否會(huì)對(duì)靶標(biāo)物質(zhì)產(chǎn)生免疫耐受，而且成本較高。適配子是體外人工合成的單鏈DNA或RNA分子，長(zhǎng)度一般為25-90nt, 具有一定的空間二級(jí)結(jié)構(gòu)。通過SELEX技術(shù)，研究人員可以從人工合成的隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中篩選針對(duì)靶物質(zhì)(蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物、金屬離子、藥物、細(xì)菌、病毒等)的適配子[14-16]。適配子可以和靶物質(zhì)高親和力、高特異性結(jié)合形成靶物質(zhì)-適配子復(fù)合物，具有傳統(tǒng)單克隆抗體無法比擬的優(yōu)勢(shì)如：靶物質(zhì)范圍更加廣泛；具有更高的親和力和特異性；隨機(jī)序列折疊形成的空間結(jié)構(gòu)具有高度的可變性和多樣性；在制備過程中不需進(jìn)行動(dòng)物免疫，成本較低。近年來，SELEX技術(shù)呈現(xiàn)跨越式的發(fā)展，磁珠分選-SELEX、細(xì)胞-SELEX、定量PCR-SELEX、流式細(xì)胞-SELEX、毛細(xì)管電泳-SELEX 、生物傳感器-SELEX等技術(shù)相繼出現(xiàn)[17-21]。目前，上述篩選方法的單一或聯(lián)合使用已經(jīng)使適配子的篩選效率極大提高。在新型SELEX技術(shù)應(yīng)用前提下，已有包括朊病毒、溶藻弧菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌毒素B(SEB)和金黃色葡萄球菌毒素A(SEA)等病原微生物和毒素蛋白的適配子得到篩選[8-9，22-23]，并應(yīng)用于相應(yīng)病原體和毒素的檢測(cè)。適配子技術(shù)在微生物檢測(cè)領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用空間。但是，目前對(duì)病原菌特異性適配子的篩選主要以病原菌菌體作為篩選的靶物質(zhì)。以菌體作為篩選靶標(biāo)，操作簡(jiǎn)單，但存在目標(biāo)位點(diǎn)過多，適配子特異性不強(qiáng)的問題。在本研究中，我們首次采用比較基因組學(xué)，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的方法選擇阪崎克羅諾菌適配子篩選的靶蛋白，以阪崎克羅諾菌中保守且較特異性存在的外膜蛋白為靶標(biāo)，成功篩選到阪崎克羅諾菌特異性適配子，為病原菌核酸適配子的篩選提供了新的思路。但篩選到的適配子捕獲目標(biāo)菌的效率與已廣泛應(yīng)用的免疫磁珠相比[12-13]存在較大差距。阪崎克羅諾菌特異性適配子SELEX篩選優(yōu)化工作需要進(jìn)一步進(jìn)行。

圖2 適配子S1、S2的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 Secondary structures of adaptors S1 and S2

利益沖突：無

引用本文格式：張?jiān)柒?，梅玲玲，?利，等.阪崎克羅諾菌特異性適配子篩選研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2020，36(1):12-19,24. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00. 192