石麗媛，丁奕博，張海鵬，郭 英，段存娟，譚紅麗，董珊珊，鐘佑宏，王 鵬

劍川縣隸屬云南省大理白族自治州，東鄰鶴慶縣，南接洱源縣，西與蘭坪縣、云龍縣接壤，北與麗江市毗連?？h境東西橫距58 km，南北縱長55 km，面積約2 250 km2。劍川縣記載的鼠疫流行史最早可以追溯到1898年金華鎮(zhèn)一帶發(fā)生鼠疫流行[1]；1950年甸南鎮(zhèn)有流行；1954年沙溪鎮(zhèn)大長樂村出現(xiàn)多例腺鼠疫病例；1975年從沙溪鎮(zhèn)石龍村1只自斃小林姬鼠分離到鼠疫菌，證實(shí)了劍川縣存在野鼠鼠疫疫源地[2]。該疫源地1975—1990年期間流行較為活躍，每年都有動物間鼠疫流行[3]，但未發(fā)現(xiàn)人間病例。1998年至今，該疫源地處于相對靜息期，未監(jiān)測到動物鼠疫流行信息。2017年4月從金華鎮(zhèn)慶華村委大慶村居民區(qū)撿獲1只自斃黃胸鼠，從鼠及其寄生棕形額蚤各分離到1株鼠疫菌[4]。這是劍川縣鼠間流行靜息20年后，從距離原疫點(diǎn)-石龍村約25 km的地方發(fā)現(xiàn)的新的動物間鼠疫。

上世紀(jì)50年代分離菌株與70年代后分離菌株有何關(guān)系，2017年新疫點(diǎn)分離菌株與之前流行的菌株之間又是什么關(guān)系，弄清這些問題，對于全面認(rèn)識劍川疫源地的性質(zhì)有著重要意義。本研究對劍川縣幾十年累積保存的鼠疫菌株進(jìn)行基因組多態(tài)性研究，以闡明該疫源地鼠疫菌的種群演化及與毗鄰疫源地菌株之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系。

1 材料與方法

1.1菌株來源及其DNA制備 按時間分布隨機(jī)選取劍川縣境內(nèi)分離菌株，兼顧不同疫點(diǎn)、不同分離源，共計24株，菌株具體信息見表1。同時選擇其他鼠疫菌株26株作為對照：包括云南家鼠疫源地保山、德宏、普洱、臨滄、版納、紅河、文山菌株各1株，云南毗鄰的貴州、廣西家鼠疫源地菌株各2株及麗江野鼠疫源地菌株15株。菌株DNA提取制備采用Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit 試劑盒進(jìn)行。EV76作為PCR反應(yīng)的陽性對照。

1.2差異區(qū)段(Different region，DFR)分型 包括23對DFR分型引物(DFR01-23)和質(zhì)粒驗(yàn)證引物(PMT1)[5]。擴(kuò)增條件：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃(DFR18、DFR19用56 ℃)30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.3規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPRs)分型 共有YPa、YPb及YPc 3對引物[6]。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。將產(chǎn)物測序，利用在線工具(http://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/)查找spacers[7]，再對應(yīng)Spacers庫識別出spacer的類型。

表1 24株劍川縣境內(nèi)分離菌株信息表
Tab.1 Information of 24 strains isolated from Jianchuan County

分離年 疫點(diǎn)信息數(shù)量 分離源1954劍川縣沙溪鎮(zhèn)長樂村大長樂3大絨鼠1,黃胸鼠1,病人11957劍川縣甸南鎮(zhèn)獅河村下河1絨鼠怪蚤1975劍川縣沙溪鎮(zhèn)石龍村1小林姬鼠1977劍川縣沙溪鎮(zhèn)長樂村鵝頸山1方葉櫛眼蚤1979劍川縣羊岑鄉(xiāng)新松村1大足鼠1979劍川縣沙溪鎮(zhèn)石龍村1棕形額蚤1980劍川縣沙溪鎮(zhèn)石龍村1特新蚤指名亞種1982劍川縣沙溪鎮(zhèn)石龍村1齊氏姬鼠1983劍川縣沙溪鎮(zhèn)石龍村2大絨鼠1,大足鼠11984劍川縣沙溪鎮(zhèn)石龍村4齊氏姬鼠1,特新蚤指名亞種1,銳額狹臀蚤1,黃胸鼠11985劍川縣沙溪鎮(zhèn)石龍村2齊氏姬鼠1,方葉櫛眼蚤11989劍川縣沙溪鎮(zhèn)馬坪關(guān)2齊氏姬鼠1,大絨鼠11990劍川縣沙溪鎮(zhèn)石龍村1大耳林姬鼠2017劍川縣金華鎮(zhèn)慶華村大慶3特新蚤指名亞種1,棕形額蚤1,黃胸鼠1

注：分離源后的數(shù)字代表菌株數(shù)量。

1.4多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列 (Multiple-locus variable -number tandem repeat analysis，MLVA)分型 采用MLVA“14+12”分型策略[8]的26個可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(Variable Number of Tandem Repeats，VNTR )位點(diǎn)。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min， 52/55/60 ℃ 1min(不同引物退火溫度不同)，72 ℃ 1min，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。將產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測大小，將產(chǎn)物堿基數(shù)與上下游序列堿基數(shù)的差值除以核心序列的長度算出重復(fù)數(shù)。

1.5聚類分析 將上述3種方法的數(shù)據(jù)導(dǎo)入BioNumerics 6.6。將50株實(shí)驗(yàn)鼠疫菌株及2株外圍對照株(0.PE 布氏田鼠鼠疫菌91001、L1970015)的DFR和CRISPRs數(shù)據(jù)(在“Experiments”中同時選中“DFR”和“CRISPRs”)，運(yùn)行“Clustering”下的“Advanced cluster analysis”下的“MST for categorical data ”生成最小生成樹(Minimum spanning tree analysis，MST)。再將基于DFR+CRISPRs的MST中的簇進(jìn)行MLVA26分型，再次生成該簇的MST。

2 結(jié) 果

2.1基于DFR+CRISPRs的MST 50株實(shí)驗(yàn)鼠疫菌株被分成3個簇和1個獨(dú)立株(劍川菌株YNJC20)，如圖1所示。24株劍川疫源地菌株中有20株菌聚為一個簇(紅色底色)，稱為劍川野鼠鼠疫簇；15株麗江野鼠疫源地菌株全部聚為一個簇(綠色底色)，稱為麗江野鼠鼠疫簇，劍川2017年疫情分離3株菌位于該簇中；11株家鼠鼠疫疫源地菌株全部聚為一個簇(藍(lán)色底色)，稱為家鼠鼠疫簇。 與外圍菌株0.PE關(guān)系最近的麗江野鼠鼠疫簇。

注：以菌株分離地點(diǎn)創(chuàng)建Group賦予不同顏色，圓的大小代表菌株數(shù)量，同一圓內(nèi)的菌株具有相同的DFR&CRISPRs基因型，有相同底色的圓為一個簇，同一簇內(nèi)的位點(diǎn)差異數(shù)不超過1。圖1 50株實(shí)驗(yàn)鼠疫菌及2株0.PE菌株基于DFR和CRISPRs位點(diǎn)生成的MSTFig.1 Minimum spanning tree analysis of DFR & CRISPRs to 50 experimental strains and 2 0.PE strains

2.2劍川野鼠鼠疫簇基于MLVA26的MST 劍川野鼠鼠疫簇共20株菌，全部分離自大理州劍川縣，分離時間為上個世紀(jì)50、70、80、90年代(按照不同分離年代賦予顏色)。如圖2所示，整體而言，鄰近菌株間位點(diǎn)差異不超過3，50年代菌株與其鄰近的80年代菌株間位點(diǎn)差異也未超過3。

注：以菌株分離年代創(chuàng)建Group賦予不同顏色，同一圓內(nèi)的菌株具有相同的MLVA基因型。圖2 20株劍川野鼠鼠疫簇菌株基于MLVA26的MSTFig.2 Minimum spanning tree analysis of MLVA26 to 20 strains in Jianchuan Wild Rodents Plague Cluster

2.3劍川2017年分離菌株基于MLVA26的MST 劍川2017年菌株在DFR+CRISPRs分型中被劃分到了麗江野鼠鼠疫簇中，利用MLAV26對其與麗江15株菌進(jìn)行聚類分析如圖3所示。從圖中可以看出劍川2017年分離的3株菌株具有相同的MLVA基因型，與麗江2017年從玉龍縣鹿子村分離的菌株(2017LZ)僅有2個VNTR位點(diǎn)的差異(N2577，M23)。

注：以菌株不同來源創(chuàng)建Group賦予不同顏色，同一圓內(nèi)的菌株具有相同的MLVA基因型。圖3 劍川2017年分離菌株與麗江野鼠鼠疫簇菌株基于MLVA26個位點(diǎn)生成的MSTFig.3 Minimum spanning tree analysis of MLVA26 to isolates from Jianchuan outbreak in 2017 and Lijiang Wild Rodents Plague Cluster

3 討 論

細(xì)菌基因組多態(tài)性產(chǎn)生有著不同的遺傳機(jī)制，基因水平轉(zhuǎn)移和缺失、短重復(fù)序列、極性化記錄噬菌體入侵事件等分別對應(yīng)DFR、MLVA、CRISPRs這3種分型方法，從不同角度描述細(xì)菌基因組多態(tài)性[9]。云南鼠疫菌以往的分子分型研究[10-12]表明，DFR、MLVA、CRISPRs分型能區(qū)分菌株生態(tài)型，尤其是MLVA，其包含大量多態(tài)性信息，能夠識別個體特征，是三者中分辨率最高的。本研究將3種分型方法整合，以DFR+CRISPRs兩種分型數(shù)據(jù)先行大尺度分類，再以MLVA26進(jìn)行細(xì)微遺傳差別分析，闡釋了劍川鼠疫菌在云南鼠疫菌中的分型位置及其種群的演化。

3.1劍川2017年新發(fā)動物鼠疫疫情是劍川縣 新的一種鼠疫類型 劍川2017年新發(fā)疫情位于金華鎮(zhèn)慶華村，與上世紀(jì)70—90年代劍川野鼠鼠疫好發(fā)疫點(diǎn)沙溪鎮(zhèn)石龍村之間直線距離25.5 km。在DFR+CRISPRs分型中，劍川2017年菌株被劃分到了麗江野鼠鼠疫簇，在后續(xù)與麗江菌株的MLVA聚類分析中，與麗江菌株僅有2個VNTR位點(diǎn)的差異。說明該次疫情并非上世紀(jì)70—90年代劍川野鼠鼠疫(石龍村為中心)的傳播復(fù)燃，而是麗江野鼠鼠疫向南進(jìn)一步擴(kuò)散的結(jié)果。事實(shí)上，在劍川2017年疫情發(fā)生之時，麗江和大理州鶴慶也發(fā)現(xiàn)了鼠間疫情，且鶴慶分離菌株分子溯源上與麗江菌株高度同源，也僅有2個VNTR位點(diǎn)的差異[13]。因此認(rèn)為，劍川2017年疫情是劍川縣一種新的鼠疫類型。

3.2上世紀(jì)50年代的劍川鼠疫疫情具備劍川野鼠鼠疫遺傳特征 劍川野鼠疫源地(滇西山地齊氏姬鼠、大絨鼠鼠疫自然疫源地)的發(fā)現(xiàn)源自1975年從劍川沙溪石龍一自死小林姬鼠體內(nèi)分離出鼠疫菌。據(jù)既往文獻(xiàn)記載，1954年劍川沙溪長樂村鼠疫流行中從患者、大絨鼠、黃胸鼠體內(nèi)分離出的鼠疫菌為家鼠鼠疫菌株。本研究3種分型方法表明50年代劍川流行株與70年代以后的流行株在分子分型上是同一類型的菌株，即同為劍川野鼠鼠疫性質(zhì)的菌株。據(jù)我所內(nèi)部資料表明1954年劍川沙溪長樂村鼠疫流行中分離的3株菌在初次生化檢測中發(fā)現(xiàn)甘油發(fā)酵-，麥芽糖+，與家鼠菌株生化特性一致，且由于同時期在大理州的其他4市/縣(大理、祥云、彌渡、巍山)也發(fā)生了人間鼠疫，因此把50年代劍川菌株定性為家鼠鼠疫性質(zhì)。但內(nèi)部資料也表明，后來再次檢測這些菌株發(fā)現(xiàn)甘油發(fā)酵+，麥芽糖+，王鵬等[14]對這些菌的檢測結(jié)果也是甘油發(fā)酵+，麥芽糖發(fā)酵陽性/陰性菌落數(shù)各有一半(固體平皿法)，這個生化特征趨向于劍川野鼠鼠疫的性質(zhì)。結(jié)合表型與基因型的特征，本研究認(rèn)為劍川50年代的菌株為野鼠鼠疫性質(zhì)，據(jù)此，劍川野鼠疫源地的發(fā)現(xiàn)可以往前推至上個世紀(jì)50年代。

流行病學(xué)資料也顯示，1950-1955年期間，劍川縣累計發(fā)生人間鼠疫2次：1) 1950年，甸南鎮(zhèn)浉河村下河，發(fā)病8人，死亡6人；2) 1954年，沙溪鎮(zhèn)長樂村大長樂，發(fā)病34人，死亡14人。死亡率為47.6%，明顯高出同一時期家鼠疫源地死亡率(21.1%)[1]。因此，還認(rèn)為劍川野鼠鼠疫菌株對人的毒力強(qiáng)于家鼠鼠疫菌株。

3.3劍川野鼠鼠疫在云南鼠疫中的遺傳定位 麗江鼠疫由青藏高原喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地傳入，而云南鼠疫起源于麗江鼠疫[15]，并擴(kuò)散至劍川形成野鼠鼠疫，進(jìn)而再傳至滇西及滇南廣大區(qū)域而形成云南家鼠型鼠疫。本文中DFR+CRISPRs生成的MST也支持該觀點(diǎn)。劍川野鼠鼠疫流行于上世紀(jì)50—90年代，雖然時間跨度數(shù)十年，但從MLVA結(jié)果來看，鼠疫菌種群變異度不大，形成了較穩(wěn)定的克隆群，即便在流行中波及家鼠也未造成菌株遺傳特征的改變。劍川野鼠簇中有2株菌分離自黃胸鼠(1954年長樂村，1984年石龍村)，從基因組多態(tài)性位點(diǎn)來看，完全具備劍川野鼠菌株的基因特征，是野鼠鼠疫傳至家鼠所致。

劍川菌株中，唯有YNJC20較為特殊，該菌1957年分離于甸南鎮(zhèn)獅河村一褐家鼠體表寄生的絨鼠怪蚤，生化特征為麥芽糖發(fā)酵陽性，甘油發(fā)酵弱陽性[14]。在最初的DFR+CRISPRs分型中就以獨(dú)立株的形式獨(dú)立于各簇之外，與之最接近的不是劍川野鼠鼠疫簇而是家鼠鼠疫簇。將其分別與家鼠鼠疫簇和劍川野鼠簇進(jìn)行VNTR位點(diǎn)比較，發(fā)現(xiàn)其與家鼠鼠疫簇的位點(diǎn)差異至少有10個，與劍川野鼠簇位點(diǎn)差異至少有14個，且該菌株天然缺失了pPCP質(zhì)粒[16]。這體現(xiàn)了種群進(jìn)化中的特殊變異。

綜上，應(yīng)該認(rèn)為，云南劍川縣境內(nèi)發(fā)現(xiàn)2種類型的野鼠疫源地，除了以沙溪鎮(zhèn)石龍為中心的原劍川野鼠疫源地，還有以金華鎮(zhèn)慶華為疫點(diǎn)的另一新的野鼠疫源地。劍川野鼠疫源地的發(fā)現(xiàn)時間可往前推至上世紀(jì)50年代，同時疫情還擴(kuò)散至家鼠和人群，因此長期認(rèn)為劍川野鼠鼠疫從未波及人間的說法是不準(zhǔn)確的。劍川野鼠鼠疫的長期存在，及2種類型疫源地的并存，增加了其防控的復(fù)雜性，因此應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)鼠間鼠疫的動態(tài)監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)和處置鼠間疫情，防止其波及到人間。

利益沖突：無

引用本文格式：石麗媛，丁奕博，張海鵬，等.云南省劍川縣鼠疫疫源地分離菌株基因組多態(tài)性[J].中國人獸共患病學(xué)報，2020，36(1)：20-24. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.180