徐 丹，齊 菲，吳 超，孫野青

（大連海事大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院環(huán)境系統(tǒng)生物學(xué)研究所，大連116026）

免疫磁珠對(duì)紫外線引起CD4細(xì)胞γ?H2AX相對(duì)熒光強(qiáng)度變化的影響

徐 丹，齊 菲，吳 超，孫野青?

（大連海事大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院環(huán)境系統(tǒng)生物學(xué)研究所，大連116026）

針對(duì)免疫磁珠技術(shù)中磁珠大小對(duì)免疫檢測(cè)結(jié)果的影響問(wèn)題，以三種免疫磁珠為研究對(duì)象，分析了單個(gè)細(xì)胞結(jié)合不同大小磁珠的數(shù)量情況，利用流式細(xì)胞術(shù)分析了γ?H2AX相對(duì)熒光強(qiáng)度變化與輻射劑量的變化關(guān)系，探討了免疫磁珠與細(xì)胞結(jié)合對(duì)紫外線UVC誘發(fā)CD4細(xì)胞γ?H2AX相對(duì)熒光強(qiáng)度變化的影響。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞與磁珠比為1∶10時(shí)單個(gè)細(xì)胞至少可以結(jié)合一個(gè)磁珠，結(jié)合數(shù)量與磁珠大小有關(guān)；UVC輻照引起CD4細(xì)胞γ?H2AX相對(duì)熒光強(qiáng)度變化與輻射劑量呈線性正相關(guān)，小磁珠（50 nm）和中磁珠（2.8μm）與細(xì)胞結(jié)合γ?H2AX熒光強(qiáng)度與輻射劑量之間仍具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，但大磁珠（4.5μm）與細(xì)胞結(jié)合會(huì)導(dǎo)致γ?H2AX相對(duì)熒光強(qiáng)度與輻射劑量的線性關(guān)系不明顯。結(jié)果可為今后將免疫磁珠用于輻射誘導(dǎo)的DNA損傷評(píng)估奠定基礎(chǔ)。

免疫磁珠；流式細(xì)胞術(shù)；UVC；γ?H2AX；劑量效應(yīng)關(guān)系

1 引言

免疫磁珠（Immunomagnetic Bead，IMB，簡(jiǎn)稱磁珠）技術(shù)是免疫學(xué)和磁載體技術(shù)結(jié)合而發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)，其基本原理是：首先免疫磁珠與抗體結(jié)合形成抗體載體；隨后磁珠上抗體與特異性抗原物質(zhì)結(jié)合，形成抗原?抗體?吸住免疫復(fù)合物；這種復(fù)合物可以在磁力的作用下發(fā)生力學(xué)移動(dòng)，使復(fù)合物與其他物質(zhì)分離，達(dá)到分離特異性抗原的目的［1］。免疫磁珠由于具有高效、快速、操作簡(jiǎn)單、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，在細(xì)胞分選［2］、蛋白提純［3］、病原體檢測(cè)［4］等領(lǐng)域都得到了廣泛地應(yīng)用。然而，磁珠的大小是影響此技術(shù)成功的關(guān)鍵因素，不同大小的磁珠結(jié)合能力、磁力強(qiáng)弱、分離效果及對(duì)目的抗原檢測(cè)的影響都不盡相同，因此，在利用免疫磁珠技術(shù)進(jìn)行免疫檢測(cè)時(shí)有必要探討最適合的磁珠大小，評(píng)價(jià)結(jié)合效率和特異性。

目前，γ?H2AX被公認(rèn)為是反映輻射引起DNA損傷的生物標(biāo)志物［5］。組蛋白H2AX在DNA損傷修復(fù)中起重要的作用，H2AX磷酸化形成γ?H2AX，后者聚集多種修復(fù)因子在DNA雙鏈斷裂位點(diǎn)，使DNA雙鏈斷裂得以修復(fù)［6?8］。近年來(lái)，對(duì)γ?H2AX的檢測(cè)方法主要包括免疫熒光法和流式細(xì)胞術(shù)。與免疫熒光法檢測(cè)γ?H2AX fo?ci［5］相比，利用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞內(nèi)γ?H2AX的表達(dá)水平具有檢測(cè)操作簡(jiǎn)便、快速和高通量等特點(diǎn)，可以排除人為的因素，得到的結(jié)果更加客觀準(zhǔn)確，且γ?H2AX相對(duì)熒光強(qiáng)度與輻射劑量存在良好的劑量效應(yīng)關(guān)系［9?10］。

人外周血淋巴細(xì)胞常用來(lái)進(jìn)行輻射損傷檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估［11］，人CD4＋T淋巴細(xì)胞簡(jiǎn)稱為CD4細(xì)胞，是T淋巴細(xì)胞的一種，表面有CD4分子，屬于人體免疫系統(tǒng)中重要的免疫細(xì)胞。紫外線輻射是目前誘導(dǎo)DNA損傷最簡(jiǎn)便有效的方法［12］，本研究利用紫外線（UVC）進(jìn)行CD4細(xì)胞輻照處理，利用免疫磁珠能與CD4細(xì)胞特異性結(jié)合的特性，采用流式細(xì)胞術(shù)分析比較三種不同大小的磁珠與CD4細(xì)胞結(jié)合對(duì)紫外線引起γ?H2AX相對(duì)熒光強(qiáng)度變化的影響，為今后將免疫磁珠技術(shù)用于從外周血分離淋巴細(xì)胞進(jìn)行輻射誘導(dǎo)的DNA損傷評(píng)估奠定基礎(chǔ)。

2 材料和方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人CD4＋T淋巴細(xì)胞，購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司，懸浮培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液中，外加10%滅活胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素，置于5% CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，每四天按1∶4傳代一次。

2.2 輻照處理

取出CD4＋T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)瓶，收集培養(yǎng)2天指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，離心去除細(xì)胞上清液，然后加入適量PBS溶液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106／mL－1，吹打混勻后接種到含有1 mL培養(yǎng)液的60 mm培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放到避光的UVC燈（功率：1100μW／cm2）輻射箱子里，打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋子垂直照射，輻照時(shí)間為0、2.5 min、5 min、10 min（對(duì)應(yīng)的輻射劑量為0、16 J／m2、32 J／m2、64 J／m2），輻照后蓋上培養(yǎng)皿蓋子，將培養(yǎng)皿置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃恢復(fù)培養(yǎng)30 min。

2.3 細(xì)胞與磁珠結(jié)合

與CD4＋T淋巴細(xì)胞結(jié)合的磁珠有三種：小磁珠（CD4 Microbeads，50 nm）來(lái)自Miltenyi Biotec公司，中磁珠（Dynabeads，2.8μm）和大磁珠（Dynabeads，4.5μm）來(lái)自Life technologies公司。由于中磁珠和大磁珠在普通顯微鏡下可見(jiàn)，因此進(jìn)行了細(xì)胞與磁珠比例為1∶5和1∶10時(shí)單個(gè)細(xì)胞結(jié)合磁珠數(shù)量的情況分析，隨機(jī)選取5個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)量，不少于100個(gè)，統(tǒng)計(jì)單個(gè)細(xì)胞結(jié)合磁珠數(shù)量為1、2、3、4及以上的細(xì)胞數(shù)，分析與未結(jié)合磁珠的細(xì)胞組相比是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

按照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞與磁珠的結(jié)合，即取適量能與CD4特異性結(jié)合的磁珠原液，用PBS緩沖液對(duì)磁珠進(jìn)行沖洗，將輻照處理或未處理的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按照細(xì)胞與磁珠比例1∶10，將細(xì)胞與磁珠在回旋器上（10 rpm）混合孵育15～20 min，充分結(jié)合后進(jìn)行固定和γ?H2AX的熒光標(biāo)記染色。

2.4 樣本固定、熒光標(biāo)記

利用γ?H2AX的熒光標(biāo)記染色試劑盒（Up?state，Catalog＃17?344）進(jìn)行固定和染色，具體操作是取出2×106CD4細(xì)胞，加入1 mL的1×Fix?ation solution進(jìn)行重懸；冰上培養(yǎng)20 min固定；用2 mL的1×PBS離心沖洗兩次；用1 mL的1×Permeabilization Solution重懸細(xì)胞破膜；取出50μL細(xì)胞于新的tube管中，加3.5μL的anti?phospho?Histone H2AX（Ser139）和FITC conjugate（Upstate，Catalog＃16?202），冰上培養(yǎng)20 min，并偶爾輕彈；加100μL的1×Wash Solution對(duì)其進(jìn)行沖洗，重懸在450μL的PBS中，轉(zhuǎn)移至流式檢測(cè)專用管中，用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)設(shè)定3個(gè)重復(fù)樣品，以單獨(dú)加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG（二抗陰性對(duì)照）和未加任何抗體的空白管（空白對(duì)照）作為對(duì)照。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

調(diào)整FSC和SSC，選取CD4待測(cè)細(xì)胞群，以FL1通道獲取FITC信號(hào)，收集1×104CD4細(xì)胞，獲取幾何平均熒光強(qiáng)度，使用相對(duì)熒光強(qiáng)度（實(shí)驗(yàn)組幾何平均熒光強(qiáng)度／二抗陰性對(duì)照的幾何平均熒光強(qiáng)度）來(lái)反映γ?H2AX表達(dá)水平。以輻射劑量為橫坐標(biāo)，γ?H2AX相對(duì)熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，建立劑量?效應(yīng)曲線，線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.95認(rèn)為線性關(guān)系極明顯，0.85≤R2＜0.95認(rèn)為線性關(guān)系明顯，R2＜0.85認(rèn)為線性關(guān)系不明顯。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS軟件包（18.0）進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，p?＜0.05代表有顯著差異，p??＜0.01代表有極顯著差異。

3 結(jié)果與討論

3.1 UVC輻照引起CD4細(xì)胞γ?H2AX熒光強(qiáng)度變化

利用UVC輻照CD4細(xì)胞，分析γ?H2AX相對(duì)熒光強(qiáng)度與輻照劑量的劑量效應(yīng)關(guān)系，如圖1所示，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)R2值為0.922，提示γ?H2AX相對(duì)熒光強(qiáng)度與輻照劑量具有明顯的線性正相關(guān)。

3.2 小磁珠與細(xì)胞結(jié)合對(duì)紫外線引起γ?H2AX熒光強(qiáng)度變化的影響

由于小磁珠直徑僅50 nm太小，因此，在普通倒置顯微鏡下無(wú)法觀察到細(xì)胞與小磁珠的結(jié)合。當(dāng)小磁珠與CD4細(xì)胞結(jié)合時(shí)，UVC引起γ?H2AX相對(duì)熒光強(qiáng)度的變化與輻照劑量之間仍具有劑量效應(yīng)關(guān)系，如圖2所示，R2值為0.8596，提示γ?H2AX相對(duì)熒光強(qiáng)度與輻照劑量呈線性正相關(guān)。

3.3 中磁珠與細(xì)胞結(jié)合對(duì)紫外線引起γ?H2AX熒光強(qiáng)度變化的影響

在普通倒置顯微鏡下可以觀察到細(xì)胞與中磁珠的結(jié)合，對(duì)細(xì)胞與磁珠比例為1∶5和1∶10時(shí)分別進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)如表1，結(jié)果顯示兩種情況下細(xì)胞沒(méi)有結(jié)合磁珠的百分比只占統(tǒng)計(jì)總數(shù)的12%～13%，細(xì)胞與磁珠結(jié)合的細(xì)胞占統(tǒng)計(jì)總數(shù)的77%～78%，但結(jié)合磁珠數(shù)量比例不同。細(xì)胞與磁珠比為1∶5時(shí)單個(gè)細(xì)胞結(jié)合1～3個(gè)磁珠的所占比例較高，而細(xì)胞與磁珠比為1∶10時(shí)單個(gè)細(xì)胞結(jié)合4個(gè)以上磁珠比例增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，若從磁珠帶動(dòng)細(xì)胞角度上看，中磁珠在細(xì)胞與磁珠比為1∶10時(shí)在磁場(chǎng)中帶動(dòng)效果會(huì)更好。

當(dāng)CD4細(xì)胞與中磁珠結(jié)合（細(xì)胞與磁珠比為1∶10）時(shí)，UVC引起γ?H2AX相對(duì)熒光強(qiáng)度的變化（見(jiàn)圖3）雖然與單純細(xì)胞組相比略降低，但線性相關(guān)系數(shù)R2值為0.871，提示γ?H2AX相對(duì)熒光強(qiáng)度與輻照劑量具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，呈線性正相關(guān)。

表1 單個(gè)細(xì)胞結(jié)合中磁珠數(shù)量情況分析Table1 Analysisofthenumberofindividualcellscombinedwithmediumbeads

3.4 大磁珠與細(xì)胞結(jié)合對(duì)紫外線引起γ?H2AX熒光強(qiáng)度變化的影響

在普通倒置顯微鏡下可以明顯觀察到細(xì)胞與大磁珠的結(jié)合，對(duì)細(xì)胞與磁珠比為1∶5和1∶10時(shí)分別進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)如表2，發(fā)現(xiàn)磁珠比例越少，細(xì)胞沒(méi)有結(jié)合磁珠的百分比越高，單個(gè)細(xì)胞結(jié)合大磁珠的數(shù)量以結(jié)合1個(gè)磁珠比例最高，分別占42%和38%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。若從磁珠帶動(dòng)細(xì)胞角度上看，大磁珠帶動(dòng)的細(xì)胞數(shù)太少，不適合在磁場(chǎng)中作為載體帶動(dòng)細(xì)胞。

表2 單個(gè)細(xì)胞結(jié)合大磁珠數(shù)量情況分析Table2 Analysisofthenumberofindividualcellscombinedwithbigbeads

當(dāng)CD4細(xì)胞與大磁珠結(jié)合（細(xì)胞與磁珠比為1∶10）時(shí)，UVC輻射在高劑量（64J／m2）下γ?H2AX相對(duì)熒光強(qiáng)度（見(jiàn)圖4）與單純細(xì)胞組相比降低明顯，導(dǎo)致γ?H2AX相對(duì)熒光強(qiáng)度與輻照劑量的線性關(guān)系不明顯，R2值僅為0.78。大磁珠與細(xì)胞結(jié)合對(duì)γ?H2AX相對(duì)熒光強(qiáng)度的變化影響較大。

4 結(jié)論

對(duì)于三種不同大小的免疫磁珠與細(xì)胞的結(jié)合情況，細(xì)胞與磁珠比為1∶10時(shí)單個(gè)細(xì)胞至少可以結(jié)合一個(gè)磁珠，結(jié)合數(shù)量與磁珠大小有關(guān)。中磁珠比大磁珠結(jié)合數(shù)量多，更適合在磁場(chǎng)中帶動(dòng)細(xì)胞，與小磁珠比，中磁珠磁力強(qiáng)，帶動(dòng)細(xì)胞的效果會(huì)更好。

對(duì)于免疫磁珠與CD4細(xì)胞結(jié)合是否會(huì)對(duì)紫外線引起γ?H2AX熒光強(qiáng)度變化產(chǎn)生影響方面：小磁珠（50nm）和中磁珠（2.8μm）與細(xì)胞結(jié)合γ?H2AX熒光強(qiáng)度與輻射劑量之間仍具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，但大磁珠（4.5μm）與細(xì)胞結(jié)合會(huì)導(dǎo)致γ?H2AX相對(duì)熒光強(qiáng)度與輻射劑量的線性關(guān)系不明顯。由此可以看出，大磁珠與細(xì)胞結(jié)合對(duì)γ?H2AX相對(duì)熒光強(qiáng)度的變化影響較大，而中小磁珠的影響不明顯，可以應(yīng)用于細(xì)胞分離后免疫熒光檢測(cè)等方面。

目前使用免疫磁珠發(fā)展起來(lái)的免疫磁性分離技術(shù)，具有簡(jiǎn)便、快速、分離純度高等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞分離、免疫檢測(cè)、基因工程和靶向釋藥等領(lǐng)域。此研究為將來(lái)此技術(shù)中磁珠的選擇提供的有力的參考價(jià)值，并為今后將免疫磁珠技術(shù)用于輻射誘導(dǎo)的DNA損傷評(píng)估奠定基礎(chǔ)。

（References）

［1］ 于露，孫秀蘭.免疫磁珠技術(shù)研究進(jìn)展［J］.糧食與油脂，2011（10）：17?19. Wang Lu，Sun Xiulan.Research progress of immunomagnetic beads technology［J］.Cereals＆Oils，2011（10）：17?19.（in Chinese）

［2］ Qiu Q，Todd NW，Li R，et al.Magnetic enrichment of bron?chial epithelial cells from sputum for lung cancer diagnosis［J］.Cancer，2008，114（4）：275?283.

［3］ Chiang CL，Chen CY，Chang LW.Purification of recombi?nant enhanced green fluorescent protein expressed in Esche?richia coli with new immobilized metal ion affinity magnetic absorbents［J］.Journal of Chromatography B，Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences，2008，864（1?2）：116?122.

［4］ Yang H，Qu L，Wimbrow AN，etal.Rapid detection of List?eria monocytogenes by nanoparticle?based immunomagnetic separation and real?time PCR［J］.International Journal of Food Microbiology，2007，（2）：132?138.

［5］ Redon CE，Nakamura AJ，Martin OA，et al.Recent develop?ments in the use of gamma?H2AX asaquantitative DNA doub?le?strand break biomarker［J］.Aging，2011，3（2）：168?174.

［6］ Roch?Lefevre S，Mandina T，Voisin P，et al.Quantification of gamma?H2AX foci in human lymphocytes：amethod for bi?ological dosimetry after ionizing radiation exposure［J］.Radia?tion Research，2010，174（2）：185?194.

［7］ Hanasoge S，Ljungman M.H2AX phosphorylation after UV irradiation is triggered by DNA repair intermediates and isme?diated by the ATR kinase［J］.Carcinogenesis，2007，28（11）：2298?2304.

［8］ Halicka HD，Huang X，Traganos F，et al.Histone H2AX phosphorylation after cell irradiation with UV?B：relationship to cell cycle phase and induction of apoptosis［J］.Cell cycle，2005，4（2）：339?345.

［9］ Andrievski A，Wilkins RC.The response of gamma?H2AX in human lymphocytes and lymphocytes subsets measured in whole blood cultures［J］.International Journal of Radiation Biology，2009，85（4）：369?376.

［10］ Olive PL.Detection of DNA damage in individual cells by a?nalysis of histone H2AX phosphorylation［J］.Methods in Cell Biology，2004，75（14）：355?373.

［11］ Horn S，Barnard S，Brady D，et al.Combined analysis of gamma?H2AX／53BP1 foci and caspase activation in lympho?cyte subsets detects recent and more remote radiation expo?sures［J］.Radiation Research，2013，180（6）：603?609.

［12］ 王睿，郭周義，曾常春.紫外輻射引起DNA損傷的修復(fù)［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12（2）：348?352. Wang Rui，Guo Zhouyi，Zeng Changchun.Repair of DNA le?sions induced by ultraviolet irradiation［J］.Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research，2008，12（2）：348?352.（in Chinese）

Effects of Immunomagnetic Beads on UVC?induced Changes in Relative Fluorescence Intensity ofγ?H2AX in CD4 Cells

XU Dan，QIFei，WU Chao，SUN Yeqing?
（Institute of Environmental System Biology，College of Environment Science and Engineering，Dalian Maritime University，Dalian 116026，China）

The size of the beads has an impacton the results of the immunoassay in immunomagnetic bead technique.In this study，three kinds of immunomagnetic beads were selected as the research objects.The number of individual cells combined with the beadswas analyzed，the relationship be?tween the relative fluorescence intensity changes ofγ?H2AX and the radiation dose was studied by flow cytometry，and the effects of immunomagnetic beads on UVC?induced relative fluorescence in?tensity changes ofγ?H2AX in CD4 cellswere discussed.Itwas found that the single cell could com?bine at leastone bead when the ratio of cells andmagnetic beadswas1∶10.The number of beads on the cellswas dependent on the size of the beads.UVC?induced changes in the relative fluorescence intensity ofγ?H2AX were linearly correlated with the radiation dose.In the cases of small beads（50 nm）and medium beads（2.8μm），therewas dose?effect relationship between theγ?H2AX fluores?cence intensity and the radiation dose.While for themagnetic beads（4.5μm）combined with the cells，the linear correlation between the relative fluorescence intensity ofγ?H2AX and the radiation dose was not obvious.These resultsmay be helpful for the application of immunomagnetic beads in DNA damage assessment induced by radiation.

immunomagnetic bead；flow cytometry；UVC；γ?H2AX；dose?effect relationship

R811.5

A

1674?5825（2017）01?0114?04

2016?02?26；

2016?12?30

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（3132014306）；中國(guó)科學(xué)院空間科學(xué)戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)（XDA04020202?12）

徐丹，女，博士，副教授，研究方向?yàn)檩椛浼?xì)胞生物學(xué)。Email：jotan1995＠dlmu.edu.cn

?通訊作者：孫野青，女，博士，教授，研究方向?yàn)榭臻g輻射生物學(xué)。E?mail：yqsun＠dlmu.edu.cn