劉城成，唐天才，塔 英，林寶山，袁東波，郭 莉，侯 巍，莫 茜，陽愛國，郝力力，李 銳

斑點熱群立克次體 (spotted fever group rickettsia, SFGR) 屬于立克次體目(Rickettsiales) 、立克次體科 (Rickettsiaceae) 、立克次體屬(Rickettsia)，是一類專性細胞內寄生的革蘭氏陰性原核微生物，多數(shù)為人獸共患病病原體，其引起的立克次體病在世界各地均有發(fā)生。人感染立克次體的病例在歐洲[1]、美洲[2]、澳洲[3]等國家均有報道，在我國的新疆[4]、黑龍江[5]、河南[6]等地區(qū)也從人體內分離到了具有致病性的立克次體。四川省石渠縣(35°58′ 50.77″N, 98°06′10.58″E)是隸屬于四川省甘孜州的純牧業(yè)縣，位于青藏高原東南緣，境內平均海拔4 200 m，轄區(qū)面積25 191 km2。牦牛是當?shù)刂饕募倚?，由于?jīng)濟發(fā)展相對滯后以及傳統(tǒng)生活方式等因素影響，養(yǎng)殖方式粗放，驅蟲意識淡薄，牦牛體表蜱蟲寄生嚴重。由于當?shù)啬撩裨诜拍吝^程中與牦牛接觸頻繁，增加了感染相關蜱傳病的風險。目前對該地區(qū)蜱種類以及斑點熱群立克次體流行狀況的研究均為空白。因此，本研究以牦牛體表寄生蜱為研究對象開展調查，以期掌握當?shù)仳绲姆N類及其斑點熱群立克次體感染的情況，為該地區(qū)蜱傳病的防控提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1蜱采集 于2018年3-8月從石渠縣麻甲鄉(xiāng)、德榮瑪鄉(xiāng)、阿日扎鄉(xiāng)及長須干瑪鄉(xiāng)的牦牛體表采集蜱，裝入收集管，塞入潮濕脫脂棉，放入75%酒精溶液中，并置于4 ℃冰箱保存待檢。

1.1.2主要試劑 組織基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit)、Trans 2K Plus DNA maker、2x EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金公司)、1xTAE溶液、瓊脂糖、引物合成、測序均由生工生物工程技術服務有限公司(成都公司)完成。

1.1.3主要器材 電泳儀電源(DYY-6C型)購于北京六一儀器廠,Leica S9D體式顯微鏡購于中輝徠博(北京)儀器有限公司,臺式高速離心機(eppendorf 5402型) 購于南京學靜生物科技有限公司,Bio-Rad伯樂梯度PCR擴增儀(PTC240型)購于南京學靜生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1蜱形態(tài)分類 根據(jù)《中國經(jīng)濟昆蟲志》[7]，采用體式顯微鏡對蜱初步進行形態(tài)學鑒定，鑒定后選取每個地點不同種類蜱的20%進行分子生物學鑒定，最終確定種類。

1.2.2DNA提取 取出用75%酒精保存的樣品，無菌水洗滌晾干后延縱向中軸線切割，分別裝入EP管，半只于-80 ℃冰箱凍存，另外半只于玻璃研磨器中研碎。采用EasyPure Genomic DNA Kit按照說明書提取DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3PCR檢測 蜱及斑點熱群立克次體的分子鑒定分別采用郭麗萍[8]和Oteo、Fernández de Mera[9-10]建立的方法，引物見表1。兩種引物擴增均采用25 μL的反應體系，2x EasyTag PCR SuperMix 12.5 μL、上下游引物各1 μL(10 μmol/L)、模板1 μL、ddH2O 9.5 μL混勻。設陽性對照(Rickettsia slovaca DNA由本實驗室保存)和陰性對照(去離子水)。蜱16S rRNA基因擴增程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸8 min；16 ℃保溫；立克次體ompA基因擴增程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸8 min；16 ℃保溫；立克次體ompB基因擴增程序為：94 ℃預變性4 min；94℃變性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸8 min; 16 ℃保溫。取2 μL PCR擴增產物于1.2%瓊脂糖凝膠中100 V電泳30 min，凝膠成像儀中觀察結果。

表1 PCR引物
Tab.1 PCR primers

鑒定物種引物序列(5'-3')靶基因 產物大小 /bp參考文獻蜱Tick16S+1:CTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCGG16S-1:CCGGTCTGACAGATCAAGT16S rRNA460[10]立克次體Rr190.70p:ATGGCGAATATTTCTCCAAAAompA530 [11]Rickettsia sppRr190.602n:AGTGCAGCATTCGCTCCCCCTompB-F:GGGTGCTGCTACACAGCAGAAompB618[12]ompB-R:CCGTCACCGATATTAATTGCC

1.2.4序列分析及統(tǒng)計分析 陽性樣品送生工測序，所得序列用DNA Star軟件進行拼接分析，在NCBI中blast進行比對，再應用MEGA6.0軟件以Neighbor-Joining法(bootstrap值1000)構建系統(tǒng)進化樹，并用SPSS軟件中pearson卡方檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。P<0.05差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1蜱采集數(shù)量及形態(tài)鑒定 在石渠縣4個鄉(xiāng)共采集到蜱818只，分別是長須干瑪鄉(xiāng)234只，麻甲鄉(xiāng)224只、德榮瑪鄉(xiāng)192只及阿日扎鄉(xiāng)168只，經(jīng)鑒定，青海血蜱172只，西藏革蜱646只，形態(tài)特征分別如圖1、圖2所示。

A為青海血蜱背面；B為青海血蜱腹面圖1 青海血蜱形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of Haemaphysalis qinghaiensis

A為西藏革蜱背面；B為西藏革蜱腹面圖2 西藏革蜱形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of Dermacentor everestianus

2.2蜱16S rRNA基因擴增與遺傳進化分析 以提取的蜱組織DNA為模板，擴增蜱16S rRNA基因片段，均出現(xiàn)目的條帶，部分樣本片段大小約430 bp，與預期相符。蜱16S rRNA基因序列經(jīng)拼接、比對后共得7條，其中4條屬于西藏革蜱，3條屬于青海血蜱，分別命名為D.everestianus.shiqu1-4、H.qinghaiensis.shiqu1-3。選取BLAST比對后同源性最高的序列1-2條以確定種，即青海血蜱和西藏革蜱，再選取不同地點分離到的青海血蜱和西藏革蜱的16S rRNA序列，最后選取部分不同種類的血蜱和革蜱的16S rRNA序列等作為參考序列，構建進化樹。如圖3所示，4個革蜱分離株與西藏的西藏革蜱(KJ599809、KJ599803)親緣關系最近，同源性達98.83%～98.89%。血蜱分離株則與甘肅臨洮(MF629859)、甘肅永靖(MF629848)同源性最高，達99.08%～99.31%；與青海湟源(MF629882)同源性達98.33%～98.83%。

圖3 基于16S rRNA基因蜱種系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of ticks based on 16S rRNA gene

2.3立克次體ompA、ompB基因PCR擴增 以提取的蜱組織DNA為模板，擴增立克次體ompA、ompB基因片段，長須干瑪鄉(xiāng)部分樣本電泳如圖4所示，ompA基因片段大小約530 bp，ompB基因片段大小約618 bp，與預期相符。

2.4立克次體PCR檢測結果 立克次體檢測結果如表2所示，在818只蜱中，有408只蜱檢測到斑點熱群立克次體，感染率為49.8%(408/818)，選擇100個陽性樣本進行測序并比對，其中未定種的立克次體約5%，勞氏立克次體約95%。在4個調查點中，德榮瑪鄉(xiāng)感染率最高，達58.3%, 其余依次是麻甲53.5%、長須干瑪44.4%及阿日扎鄉(xiāng)42.8%。德榮瑪鄉(xiāng)蜱斑點熱群立克次體感染率高于其他3個調查點(χ2=7.175，P<0.05)。在麻甲鄉(xiāng)青海血蜱斑點熱群立克次體的感染率高于西藏革蜱(χ2=6.216，P<0.05)。

M：DL 5000 marker；1：陽性對照；2-9：蜱樣本；10：陰性對照圖4 長須干瑪鄉(xiāng)部份樣本ompA、ompB基因PCR反應后電泳圖Fig.4 PCR products of ompA and ompB gene of some samples in Changxuganma Village

表2 石渠縣蜱立克次體PCR檢測結果統(tǒng)計
Tab.2 Detection results of ticks-borneRickettsiain Shiqu County

調查點樣本數(shù)陽性數(shù)感染率青海血蜱西藏革蜱合計青海血蜱西藏革蜱合計青海血蜱(%)西藏革蜱(%)合計(%)阿日扎0168168072720.0042.842.8麻甲172522241002012058.138.453.5*德榮瑪019219201121120.0058.358.3長須干瑪023423401041040.0044.444.4合計17264681810030840858.1*47.649.8

*P<0.05。

2.5立克次體ompA、ompB基因遺傳進化分析 將立克次體ompA基因序列拼接、比對后共得4條序列(約530 bp)，分別命名為UnculturedRickettsiasp.shiqu1、R.raoultii.shiqu2-4，其中UnculturedRickettsiasp.shiqu1與R.raoultii.shiqu2、R.raoultii.shiqu3、R.raoultii.shiqu4有31個堿基的差異；R.raoultii.shiqu2與R.raoultii.shiqu3、R.raoultii.shiqu4僅有1個堿基差異；R.raoultii.shiqu3與R.raoultii.shiqu4僅有1個堿基差異。將其與GenBank中已有勞氏立克次體ompA基因進行同源性比較并且選取不同種類立克次體的ompA基因序列構建系統(tǒng)進化樹，對種系親緣關系進行分析。如圖5所示，其中UnculturedRickettsiasp.shiqu1與我國青海未定種的unculturedRickettsiasp.(MG228270)同源性達100%，與分離自韓國的長角立克次體CandidatusRickettsialongicornii(MG906676)同源性為98.21%，兩者有9個堿基差異；R.raoultii.shiqu2、R.raoultii.shiqu3、R.raoultii.shiqu4與分離自意大利的Rickettsiaroutliiz164(MH532249)、分離自我國北京的IM16株(KY474554)和分離自我國黑龍江Rickettsiaroutlii(JX885458)聚于同一分支，同源性為98.80%～99.39%；其中R.raoultii.shiqu2、R.raoultii.shiqu4與我國西藏分離到的RickettsiaroutliiLYG32(JQ792137)同源性分別為99.6%、99.8%，R.raoultii.shiqu3與其同源性達100%；R.raoultii.shiqu2、R.raoultii.shiqu3與RickettsiaroutliiWYG68(JQ792162)同源性為99.80%，R.raoultii.shiqu4與其同源性達100%。

圖5 基于ompA基因立克次體系統(tǒng)進化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree of Rickettsia based on the ompA gene

將立克次體ompB基因序列拼接、比對后共得4條序列(約618 bp)，分別命名為UnculturedRickettsiasp.shiqu1、R.raoultii.shiqu2-4,其中UnculturedRickettsiasp.shiqu1與R.raoultii.shiqu2、R.raoultii.shiqu3、R.raoultii.shiqu4存在32個堿基差異；R.raoultii.shiqu2與R.raoultii.shiqu3、R.raoultii.shiqu4僅有1個堿基差異；R.raoultii.shiqu3、R.raoultii.shiqu4僅有一個堿基差異，將其與GenBank中已有勞氏立克次體ompB基因進行同源性比較并且選取不同種類立克次體的ompB基因序列構建系統(tǒng)進化樹，對種系親緣關系進行分析。如圖6所示，其中UnculturedRickettsiasp.shiqu1與韓國分離到未定種的Rickettsiasp.(KC888953)和CandidatusRickettsialongicornii(MG906675)同源性達100%；R.raoultii.shiqu2、R.raoultii.shiqu3、R.raoultii.shiqu4與在俄國分離到的哈巴洛夫斯克株Rickettsiaraoultiistrain Khabarovsk(DQ365798)同源性分別為99.47%、99.31%、99.48%；與分離自意大利的Rickettsiaraoultiiz164(MH532272)同源性分別為99.30%、99.13%、99.31%。

圖6 基于ompB基因立克次體系統(tǒng)進化樹分析Fig.6 Phylogenetic tree of Rickettsia based on the ompB gene

3 討 論

本次調查中4個鄉(xiāng)均采集到西藏革蜱，而青海血蜱只在麻甲鄉(xiāng)采集到。每種蜱都有特定的生存環(huán)境，西藏革蜱主要生存于我國西藏和尼泊爾海拔3 500～4 500 m以上的高山荒漠地區(qū)，青海血蜱主要生存于我國青海海拔2 000～4 200 m的草叢灌木[7]。就海拔和地理位置而言，阿日扎、長須干瑪及德榮瑪位于雅礱江流域亞寒帶純牧區(qū)，海拔在4 300～4 600 m；麻甲鄉(xiāng)位于金沙江河谷寒溫帶半農牧區(qū)，海拔為3 799 m，兩區(qū)的海拔高度存在明顯的差異，這很可能是只在麻甲鄉(xiāng)發(fā)現(xiàn)青海血蜱的主要原因。

在斑點熱群立克次體的鑒定中，依據(jù)Fournie[11]建立的判定標準，ompA基因是斑點熱群立克次體的特異性蛋白基因，如檢出了ompA基因則可以判定為斑點熱群立克次體，如沒有，則判定斑點熱群立克次體必須符合下列4項標準的中的兩項：與16S rRNA同源性>98.8%、gltA同源性>92.7%、ompB同源性>85.8%、geneD同源性>82.2%。這是本研究以ompA及ompB基因作為靶基因檢測斑點熱群立克次體的依據(jù)。檢測結果表明該地區(qū)蜱中斑點熱群立克次體的感染率為49.8%。值得注意的是，在麻甲鄉(xiāng)采集到青海血蜱的數(shù)量明顯多于西藏革蜱，并且青海血蜱勞氏立克次體的感染率(58.1%)顯著高于西藏革蜱(38.4%)。

在本研究中，陽性樣本中勞氏立克次體占比高，勞氏立克次體于1999年首次分離自革蜱和扇頭蜱，根據(jù)基因庫中的信息，目前至少在19種蜱中檢測到勞氏立克次體，包括草原革蜱、短小扇頭蜱、嗜群血蜱、全溝硬蜱、鈍眼螺旋蜱和亞洲璃眼蜱等革蜱屬的蜱更多見攜帶勞氏立克次體[12]，但目前尚無關于西藏革蜱感染勞氏立克次體的數(shù)據(jù)。本課題首次在西藏革蜱中檢出了勞氏立克次體DNA，并且有很高的檢測陽性率。攜帶勞氏立克次體的血蜱主要有長角血蜱、短墊血蜱、草原血蜱[13]。在本次調查中，青海血蜱的勞氏立克次體感染率為58.1%遠遠高于高悅等[14]的檢出率(14.9%(11/74))。此次調查的陽性樣本中有5.0%為未定種立克次體Uncultured Rickettsia sp. shiqu 1，后期我們將應用諸如多位點序列分型(Multilocus sequence typing, MLST)等方法在種的水平上進一步鑒定。

2015―2016年，內蒙古、河南、山東省報道有26人感染勞氏立克次體[15]，從其中2例患者的血液中檢測到并分離到勞氏立克次體哈巴洛夫斯克株R. raoultii strain Khabarovsk，該致病株與本次在石渠縣牦牛體表寄生蜱中檢測到的勞氏立克次體具有很高的同源性。因此，在石渠縣西藏革蜱和青海血蜱勞氏立克次體高感染率的情況下，是否當?shù)鼐用駥ζ湟簿哂幸欢ǖ母腥韭视斜匾_展進一步的調查。

綜上所述，本次實驗首次對石渠縣牦牛體表寄生的蜱蟲種類及斑點熱群立克次體流行情況進行調查，結果表明該地區(qū)青海血蜱和西藏革蜱是當?shù)貍鞑谑狭⒖舜误w的重要媒介，并且首次鑒定出西藏革蜱也是攜帶勞氏立克次體的蜱種之一。石渠縣蜱立克次體較高的感染率極大增加了人感染的風險，后期應進一步加強對蜱蟲的控制及勞氏立克次體流行情況的監(jiān)測。

利益沖突：無

引用本文格式：劉城成，唐天才，塔英，等. 四川石渠縣牦牛源蜱感染斑點熱群立克次體分子流行病學調查[J].中國人獸共患病學報，2020，36(1):50-55. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.183