李 佳，黃達(dá)娜，張曉敏，牛 叢，萬(wàn)成松，張仁利1,

藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)(Giardialamblia)(賈第蟲(chóng))和微小隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidiumparvum)，簡(jiǎn)稱(chēng)“兩蟲(chóng)”，是兩種常見(jiàn)的寄生于人與動(dòng)物腸道的原蟲(chóng)，分別引起賈第蟲(chóng)病和隱孢子蟲(chóng)病，主要通過(guò)糞口途徑傳播，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡[1]。藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)主要寄生在宿主小腸，主要是十二指腸，可引起腹痛、腹瀉及吸收不良等癥狀。每年全球大約有2億人感染藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)，在旅游者中發(fā)病率較高，因此由藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)引起的腹瀉也稱(chēng)為“旅游者腹瀉”[2-3]。微小隱孢子蟲(chóng)是專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，主要寄生于小腸上皮細(xì)胞的刷狀緣納蟲(chóng)空泡內(nèi)，引起宿主腹瀉、腹痛，病程多為自限性。免疫缺陷患者的癥狀更為嚴(yán)重，多并發(fā)腸外器官隱孢子蟲(chóng)病，微小隱孢子蟲(chóng)感染也是艾滋病患者并發(fā)腹瀉死亡的原因之一[4-5]。WHO將隱孢子蟲(chóng)病和賈第蟲(chóng)病列為重要的人獸共患寄生蟲(chóng)病[6]；2006年，我國(guó)將“兩蟲(chóng)”列為《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》的非常規(guī)項(xiàng)目[7]。因此，建立“兩蟲(chóng)”的同步定量檢測(cè)方法具有重要的意義。目前，“兩蟲(chóng)”的檢測(cè)方法主要包括鏡檢法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法等。傳統(tǒng)的鏡檢法是“兩蟲(chóng)”檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但耗時(shí)耗力，且檢出率較低[8]。免疫學(xué)方法，如免疫熒光、ELISA，雖然靈敏度和特異性較傳統(tǒng)的鏡檢法有所提高，但前者不能區(qū)分蟲(chóng)種，后者易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，不能準(zhǔn)確定量，在輕度感染的糞便樣本中的應(yīng)用較差[9]。熒光定量PCR(FQ-PCR)法敏感性高，特異性好，能同時(shí)檢測(cè)大量樣本，是同時(shí)定量檢測(cè)“兩蟲(chóng)”的首選方法之一。本研究旨在建立TaqMan探針的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法，以實(shí)現(xiàn)“兩蟲(chóng)”靈敏快速的臨床檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1蟲(chóng)體及醫(yī)源性腹瀉樣本 藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)、微小隱孢子蟲(chóng)、異尖線(xiàn)蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)、肝吸蟲(chóng)、瘧原蟲(chóng)和廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)均分離自深圳市疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)門(mén)診部病人的留存樣本，由深圳市疾病預(yù)防控制中心病原生物所實(shí)驗(yàn)室保存。疑似“兩蟲(chóng)”感染病人的醫(yī)源性腹瀉樣本均來(lái)自深圳市疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)門(mén)診部。

1.2試劑與儀器 主要試劑：Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMDTM19-T載體、Ex Taq?Hot Start Version購(gòu)自寶生物工程有限公司；切膠回收試劑盒QIAquick Gel Extraction Kit、DNA提取試劑盒DNeasy Blood & Tissue Kit和QIAamp?Fast DNA Stool Mini Kit購(gòu)自QIAGEN公司；質(zhì)粒提取試劑盒E.Z.N.A.?Plasmid Midi Kit購(gòu)自O(shè)MEGA公司。主要儀器：ABI7500熒光定量PCR儀。

1.3 方法

1.3.1引物和TaqMan探針的設(shè)計(jì)和合成 在GenBank中查找微小隱孢子蟲(chóng)cowp基因序列(GenBank序列號(hào)：AB514064.1)和藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)gdh基因序列(GenBank序列號(hào)：KM190761.1)，根據(jù)其保守區(qū)域，用Primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì)引物和探針，并對(duì)所設(shè)計(jì)的引物和探針在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)探針5’端標(biāo)記VIC熒光基團(tuán)，微小隱孢子蟲(chóng)5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)(表1)。引物和探針在生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 熒光定量PCR的引物和TaqMan探針
Tab.1 Primer and TaqMan probe for FQ-PCR

Target SpeciesGenePrimer/probeSequence(5'-3')Length/bpGiardia lambliagdhGIA-FACTCCAACGGGACCATTGTC156GIA-RAGCACTCCCAAGGCTTCTTGGIA-PVIC-CAACGAGGAGAAGCTGGCCCACC-BHQ1Cryptosporidium parvumcowpCRY-FTTGCATTCACTATGCCTGAAAAA115CRY-RAGTATAGTGCCTGGAGGACATTCTGCRY-PFAM-CCCCCAGGATTCGTTTTTTCTGGAAA-TAMRA

1.3.2蟲(chóng)體基因組DNA的提取 醫(yī)源性腹瀉樣本參照試劑盒QIAamp?Fast DNA Stool Mini Kit說(shuō)明書(shū)提取DNA；分離的蟲(chóng)體參照試劑盒DNeasy Blood & Tissue Kit說(shuō)明書(shū)提取DNA，提取的DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以引物GIA-F/R對(duì)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)以引物CRY-F/R對(duì)微小隱孢子蟲(chóng)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。普通PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL，體系組分包括：HS Enzyme 0.25 μL、10x EX Taq buffer 5 μL、dNTP 4 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、DEPC H2O 35.75 μL、DNA模板3 μL。反應(yīng)條件為：98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。

1%瓊脂糖凝膠電泳后對(duì)目的片段進(jìn)行切膠回收，將回收后的片段連接至pMDTM19-T載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落由生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)定濃度后作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4引物和探針濃度的優(yōu)化 根據(jù)ABI7500儀器使用說(shuō)明書(shū)構(gòu)建反應(yīng)體系，分別對(duì)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)和微小隱孢子蟲(chóng)的引物和探針濃度進(jìn)行優(yōu)化。FQ-PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，體系組分包括：Premix Ex Taq?(Probe qPCR) 10 μL、上下游引物(GIA-F/R、CRY-F/R)終濃度分別為0.2、0.4和0.6 μmol/L、探針(GIA-P、CRY-P)終濃度分別為0.1、0.2和0.3 μmol/L、ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μL、DNA模板2 μL，DEPC H2O補(bǔ)足體積20 μL。實(shí)驗(yàn)分組如下：第①②③組的探針濃度為0.1 μmol/L，引物濃度分別為0.2、0.4和0.6 μmol/L；第④⑤⑥組的探針濃度為0.2 μmol/L，引物濃度分別為0.2、0.4和0.6 μmol/L；第⑦⑧⑨組的探針濃度為0.3 μmol/L，引物濃度分別為0.2、0.4和0.6 μmol/L。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s(收集熒光)，共40個(gè)循環(huán)。熒光定量PCR后通過(guò)比較Ct值、ΔRn值和擴(kuò)增曲線(xiàn)確定最終的引物和探針濃度。

1.3.5雙重FQ-PCR體系的建立 根據(jù)2.4中的結(jié)果確定體系最優(yōu)的引物和探針濃度，構(gòu)建雙重FQ-PCR體系。

1.3.6雙重FQ-PCR體系靈敏度的評(píng)價(jià)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 以含有藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)目的片段的質(zhì)粒DNA pMDTM19-T-GIA和含有微小隱孢子蟲(chóng)目的片段的質(zhì)粒DNA pMDTM19-T-CRY為模板，進(jìn)行倍比稀釋使其終濃度為100～109copies/μL，將兩種模板同時(shí)加入同一個(gè)反應(yīng)管中，用建立的雙重FQ-PCR體系進(jìn)行反應(yīng)，確定其靈敏度，同時(shí)以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.7雙重FQ-PCR體系特異性的評(píng)價(jià) 分別以藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)、微小隱孢子蟲(chóng)、質(zhì)粒DNA pMDTM19-T-GIA、質(zhì)粒DNA pMDTM19-T-CRY、弓形蟲(chóng)、異尖線(xiàn)蟲(chóng)、肝吸蟲(chóng)、瘧原蟲(chóng)、廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)DNA為模板，同時(shí)設(shè)立DEPC H2O作為陰性對(duì)照，用建立的雙重FQ-PCR體系進(jìn)行反應(yīng)，評(píng)價(jià)其特異性。

1.3.8雙重FQ-PCR體系穩(wěn)定性和重復(fù)性的評(píng)價(jià)

分別選取濃度為109～105copies/μL的藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)和微小隱孢子蟲(chóng)質(zhì)粒DNA作為模板，將兩種模板同時(shí)加入同一個(gè)反應(yīng)管中，用建立的雙重FQ-PCR體系進(jìn)行反應(yīng)，每個(gè)濃度進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，評(píng)價(jià)其批內(nèi)穩(wěn)定性。同時(shí)在一周內(nèi)選取5 d，分別進(jìn)行檢測(cè)，每次進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算5次結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，評(píng)價(jià)其批間重復(fù)性。

1.3.9雙重FQ-PCR和單重FQ-PCR方法一致性的評(píng)價(jià) 分別選取濃度為102～108copies/μL的藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)和微小隱孢子蟲(chóng)質(zhì)粒DNA作為模板，同時(shí)進(jìn)行雙重FQ-PCR和單重FQ-PCR檢測(cè)，每個(gè)濃度進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，評(píng)價(jià)雙重FQ-PCR和單重FQ-PCR方法的一致性。

1.3.10雙重FQ-PCR體系的實(shí)際應(yīng)用評(píng)價(jià) 分別將來(lái)自寄生蟲(chóng)門(mén)診部的疑似“兩蟲(chóng)”感染病人的醫(yī)源性腹瀉樣本編號(hào)為1～6，分別提取核酸作為模板，使用本研究建立的雙重FQ-PCR體系進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)使用商品化金標(biāo)層析試紙條進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)價(jià)此體系的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2 結(jié) 果

2.1標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的濃度測(cè)定 經(jīng)測(cè)定，藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)質(zhì)粒DNA pMDTM19-T-GIA和微小隱孢子蟲(chóng)質(zhì)粒DNA pMDTM19-T-CRY的濃度分別為77.13 ng/μL和66.57 ng/μL。經(jīng)下列公式換算成拷貝數(shù)分別為4.51×1011copies/μL和5.28×1011copies/μL?？截?μL=濃度(ng/μL)×阿伏伽德羅常數(shù)×10-9/(660×堿基數(shù))

2.2引物和探針濃度的優(yōu)化結(jié)果 分別選取濃度為4.51×108copies/μL的藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)質(zhì)粒DNA pMDTM19-T-GIA和濃度為5.28×108copies/μL的微小隱孢子蟲(chóng)質(zhì)粒DNA pMDTM19-T-CRY作為模板，根據(jù)1.3.4所述的實(shí)子分組進(jìn)行引物和探針濃度的優(yōu)化。由圖1和圖2可知，根據(jù)ΔRn值最高、Ct值最低的原則，兩對(duì)引物的最優(yōu)濃度均為0.4 μmol/L，兩對(duì)探針的最優(yōu)濃度均為0.3 μmol/L。

Note: 1為⑧, 2為⑨, 3為⑦, 4為⑥, 5為④, 6為⑤; 7為①, 8為②, 9為③圖1 藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)特異性引物(GIA-F/R)和探針(GIA-P)的濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Optimization results of Giardia lamblia specific primers and probes

Note: 1為⑧, 2為⑨, 3為⑤, 4為⑥, 5為⑦, 6為④, 7為②, 8為③, 9為①圖2 微小隱孢子蟲(chóng)特異性引物(CRY-F/R)和探針(CRY-P)的濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Optimization results of Cryptosporidium parvum specific primers and probes

2.3雙重FQ-PCR體系的建立 根據(jù)2.2引物和探針濃度優(yōu)化的結(jié)果，最終確定雙重FQ-PCR體系，體系組分包括：Premix Ex TaqTM(Probe qPCR) 10 μL、GIA-F(10 μmol/L) 0.8 μL、GIA-R(10 μmol/L) 0.8 μL、CRY-F(10 μmol/L) 0.8 μL、CRY-R(10 μmol/L) 0.8 μL、GIA-P(10 μmol/L) 0.6 μL、CRY-P(10 μmol/L) 0.6 μL、ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μL、兩蟲(chóng)DNA模板各2 μL，DEPC H2O補(bǔ)足體積至20 μL。用雙重FQ-PCR體系檢測(cè)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)和微小隱孢子蟲(chóng)樣本的結(jié)果見(jiàn)圖3，結(jié)果表明該體系能同時(shí)檢測(cè)兩蟲(chóng)或任意一種蟲(chóng)種。

Note: 1,5: Giardia lamblia; 2,4: Giardia lamblia+Cryptosporidium parvum; 3,6: Cryptosporidium parvum; 7,8: DEPC H2O. Red curve was the VIC detection channel (Giardia lamblia); black curve was the FAM detection channel (Cryptosporidium parvum)圖3 雙重FQ-PCR體系的建立Fig.3 Establishment of duplex FQ-PCR system

2.4雙重FQ-PCR體系的靈敏度和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 以梯度稀釋后濃度分別為4.51×109copies/μL～4.51×100copies/μL的質(zhì)粒DNA pMDTM19-T-GIA和5.28×109copies/μL～5.28×100copies/μL的質(zhì)粒DNA pMDTM19-T-CRY作為模板，以DEPC H2O作為陰性對(duì)照，進(jìn)行雙重FQ-PCR，擴(kuò)增曲線(xiàn)見(jiàn)圖4，結(jié)果表明該體系對(duì)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)和微小隱孢子蟲(chóng)檢測(cè)的靈敏度分別為45.1 copies/μL和52.8 copies/μL。以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖5。雙重FQ-PCR體系檢測(cè)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：Ct=-3.08×LOG(copies)+41.57，R2=0.99，擴(kuò)增效率為111%；檢測(cè)微小隱孢子蟲(chóng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Ct=-3.2×LOG(copies)+42.17，R2=0.99，擴(kuò)增效率為105%。結(jié)果表明該體系在濃度為109copies/μL～101copies/μL之間具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.5雙重FQ-PCR體系的特異性 利用雙重FQ-PCR體系同時(shí)檢測(cè)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)、微小隱孢子蟲(chóng)、質(zhì)粒DNA pMDTM19-T-GIA(濃度為4.51×107copies/μL)、質(zhì)粒DNA pMDTM19-T-CRY(濃度為5.28×107copies/μL)、弓形蟲(chóng)、異尖線(xiàn)蟲(chóng)、肝吸蟲(chóng)、瘧原蟲(chóng)、廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)DNA，以DEPC H2O作為陰性對(duì)照，擴(kuò)增曲線(xiàn)見(jiàn)圖6。結(jié)果表明該體系能分別或同時(shí)檢測(cè)出藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)和微小隱孢子蟲(chóng)的DNA，且對(duì)其它蟲(chóng)種DNA檢測(cè)結(jié)果均為陰性，體系特異性良好。

Note: The concentration of the plasmid standard from left to right in the amplification curve was 4.51×109 copies/μL～4.51×100 copies/μL(Giardia lamblia) and 5.28×109 copies/μL～5.28×100 copies/μL(Cryptosporidium parvum). The bottom line was DEPC H2O. The blue curve was the FAM detection channel (Cryptosporidium parvum); the red curve was the VIC detection channel (Giardia lamblia)圖4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線(xiàn)Fig.4 Plasmid standard amplification curve

Note: The blue line is the standard curve of Cryptosporidium parvum; the red line is the standard curve of Giardia lamblia.圖5 雙重FQ-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.5 Standard curve of duplex FQ-PCR

Note: 1,9: Plasmid DNA pMDTM19-T-CRY; 2,10: Cryptosporidium parvum; 3,11: Plasmid DNA pMDTM19-T-GIA; 4,12: Giardia lamblia; 5,7: Plasmid DNA pMDTM19-T-CRY+ Plasmid DNA pMDTM19-T-GIA; 6,8: Cryptosporidium parvum+Giardia lamblia; 13,14: Toxoplasma Gondii; 15,16: Anisakis; 17,18: Liver fluke; 19,20: Plasmodium; 21,22: Angiostrongylus cantonensis; 23,24: DEPC H2O. The black curve is the FAM detection channel (Cryptosporidium parvum); the red curve is the VIC detection channel (Giardia lamblia).圖6 雙重FQ-PCR的特異性擴(kuò)增曲線(xiàn)Fig.6 Specific amplification curve of duplex FQ-PCR

2.6雙重FQ-PCR體系穩(wěn)定性和重復(fù)性 雙重FQ-PCR的批內(nèi)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)見(jiàn)表2，結(jié)果顯示，藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)質(zhì)粒DNA每個(gè)稀釋度的3個(gè)平行反應(yīng)管Ct值的變異系數(shù)均在1.16%以下；微小隱孢子蟲(chóng)質(zhì)粒DNA每個(gè)稀釋度的3個(gè)平行反應(yīng)管Ct值的變異系數(shù)均在0.62%以下，證明該體系檢測(cè)兩蟲(chóng)的批內(nèi)穩(wěn)定性良好。雙重FQ-PCR的批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)見(jiàn)表3，結(jié)果表明，藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)質(zhì)粒DNA每個(gè)稀釋度5次實(shí)驗(yàn)中，3個(gè)平行反應(yīng)管Ct值的變異系數(shù)均在3.81%以下；微小隱孢子蟲(chóng)質(zhì)粒DNA每個(gè)稀釋度5次實(shí)驗(yàn)中，3個(gè)平行反應(yīng)管Ct值的變異系數(shù)均在3.39%以下，證明該體系檢測(cè)兩蟲(chóng)的批間重復(fù)性良好。

2.7雙重FQ-PCR和單重FQ-PCR方法的一致性

雙重FQ-PCR和單重FQ-PCR方法一致性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，兩種方法檢測(cè)微小隱孢子蟲(chóng)Ct值的變異系數(shù)在2.21%以下；檢測(cè)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)Ct值的變異系數(shù)在1.60%以下，證明該體系與單重FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果具有較好的一致性。

表2 雙重FQ-PCR的批內(nèi)穩(wěn)定性
Tab.2 Intra-assay stability of duplex FQ-PCR

SpeciesConcentration(copies/μL)Ct value123x±sCV(%)Cryptosporidium parvum5.28×10910.5310.5210.4310.49±0.040.385.28×10813.5613.6013.7213.63±0.070.515.28×10717.8717.7817.7117.79±0.070.395.28×10621.3121.1220.9821.13±0.130.625.28×10524.5524.3724.2324.38±0.130.53Giardia lamblia4.51×10911.3211.2011.0211.18±0.131.164.51×10814.7515.0614.8214.88±0.130.874.51×10718.8118.5518.8218.73±0.130.694.51×10622.2122.1122.4622.26±0.150.674.51×10525.5125.9025.8025.74±0.170.66

表3 雙重FQ-PCR的批間重復(fù)性
Tab.3 Inter-assay repeatability of duplex FQ-PCR

SpeciesConcentration(copies/μL)Ct value12345x±sCV(%)Cryptosporidium parvum5.28×10910.4410.499.9510.839.9210.33±0.353.395.28×10813.6313.6314.8513.8913.6613.93±0.473.375.28×10717.9017.7919.2718.0718.5918.32±0.553.005.28×10621.0321.1321.0821.3821.7421.28±0.261.225.28×10524.2724.3825.1025.1825.2724.84±0.421.69Giardia lamblia4.51×10911.1611.2110.1911.3511.1811.02±0.423.814.51×10814.3714.5015.5214.8214.8814.82±0.402.704.51×10718.2218.3418.3318.4718.7318.42±0.170.924.51×10621.4421.5321.3522.0722.2621.73±0.361.664.51×10524.7825.1225.4725.6925.7425.36±0.361.42

2.8雙重FQ-PCR體系的實(shí)際應(yīng)用評(píng)價(jià) 雙重FQ-PCR體系對(duì)來(lái)自寄生蟲(chóng)門(mén)診部的疑似“兩蟲(chóng)”感染病人的醫(yī)源性腹瀉樣本所提取的核酸的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7，結(jié)果顯示，此方法不僅能有效地檢測(cè)出藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)或微小隱孢子蟲(chóng)陽(yáng)性樣本的核酸，且互不干擾，還能同時(shí)檢測(cè)出“兩蟲(chóng)”陽(yáng)性樣本的核酸。與此同時(shí)，我們同時(shí)用現(xiàn)有商品化的金標(biāo)層析法檢測(cè)了樣本，并與本實(shí)驗(yàn)所建立的雙重FQ-PCR方法進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表5，結(jié)果顯示兩種方法檢測(cè)樣本的符合率為100%，表明此體系有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

Note: 1,11: sample 1; 2,12: sample 3; 3,6: sample 2+sample 3; 4,13: sample 4; 5,14: sample 2; 7,9: sample 4+sample 5; 8,15: sample 5; 10,16: sample 6; 17,18: DEPC H2O. The orange curve is the FAM detection channel (Cryptosporidium parvum); the green curve is the VIC detection channel (Giardia lamblia).圖7 雙重FQ-PCR的實(shí)際應(yīng)用評(píng)價(jià)Fig.7 Practical evaluation of duplex FQ-PCR

表4 雙重FQ-PCR和單重FQ-PCR方法的一致性
Tab.4 Consistency of duplex FQ-PCR and single FQ-PCR methods

Cryptosporidium parvumGiardia lambliaConcentration(copies/μL)Mean of duplex FQ-PCR Ct valueMean of single FQ-PCR Ct valuex±sCV(%)Concentration(copies/μL)Mean of duplex FQ-PCR Ct valueMean of single FQ-PCR Ct valuex±sCV(%)5.28×10814.6515.2014.93±0.281.874.51×10814.7515.0614.90±0.161.075.28×10717.0417.7717.40±0.372.124.51×10717.4917.7517.62±0.130.745.28×10620.5221.3520.94±0.422.004.51×10620.8821.2221.05±0.170.815.28×10523.7824.5924.18±0.401.664.51×10523.9224.6924.31±0.391.605.28×10427.3928.6228.01±0.622.214.51×10427.6727.9027.79±0.110.405.28×10330.5931.6431.11±0.531.704.51×10330.5731.1230.84±0.280.915.28×10232.8434.0033.42±0.581.734.51×10233.8633.8133.83±0.030.09

表5 疑似“兩蟲(chóng)”感染的醫(yī)源性腹瀉樣本兩種檢測(cè)方法的比較
Tab.5 Comparison of two detection methods for iatrogenic diarrhea samples suspected of "two insects" infection

樣本編號(hào)(Sample number)金標(biāo)免疫層析法(gold immunochromat ographic assay)雙重?zé)晒舛縋CR法(duplex FQ-PCR)Giardia lambliaCryptosporidium parvumGiardia lambliaCryptosporidium parvum符合率(%)(Compliance rate)1+-+(Ct:26.2497)-1002-+-+(Ct:31.292)1003+-+(Ct:26.9952)-1004+-+(Ct:31.1229)-1005-+-+(Ct:33.5769)1006-+-+(Ct:34.5051)1002+3+++(Ct:27.9262)+(Ct:32.2412)1004+5+++(Ct:32.3277)+(Ct:33.6856)100

3 討 論

自20世紀(jì)以來(lái)，藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)和微小隱孢子蟲(chóng)在全球范圍內(nèi)均有報(bào)道，每年感染“兩蟲(chóng)”的患者約200萬(wàn)例[10]。發(fā)達(dá)國(guó)家中微小隱孢子蟲(chóng)感染率約為0.1%～9.1%，藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)感染率約為0.2%～29.2%；而在我國(guó)微小隱孢子蟲(chóng)感染率約為0.3%～16.1%，藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)感染率約為0.4%～16.2%[11-12]。近年來(lái)“兩蟲(chóng)”的感染形式愈發(fā)嚴(yán)峻，其宿主廣泛，進(jìn)入人體后會(huì)造成嚴(yán)重的健康損害，感染動(dòng)物后會(huì)造成畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確、特異的“兩蟲(chóng)”檢測(cè)方法是具有重要意義的。

相比于傳統(tǒng)的鏡檢法、免疫學(xué)方法等，F(xiàn)Q-PCR技術(shù)以其準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)應(yīng)用越來(lái)越廣泛的技術(shù)之一，也是“兩蟲(chóng)”檢測(cè)的首選方法之一。多重PCR通過(guò)使用一對(duì)以上引物同時(shí)識(shí)別一個(gè)以上靶序列，在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)靶序列，在提高通量的同時(shí)降低反應(yīng)成本[13]，早在1988年Chamberian[14]就首次采用了多重PCR技術(shù)；楊曉華等[15]曾建立分別檢測(cè)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)和微小隱孢子蟲(chóng)的FQ-PCR方法；Shin等[16]建立了同時(shí)檢測(cè)微小隱孢子蟲(chóng)、環(huán)孢子蟲(chóng)和藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)的多重FQ-PCR方法，方法檢測(cè)前兩者的靈敏度為2×101copies/μL，而檢測(cè)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)的靈敏度為2×103copies/μL；高宇航等[17]建立了實(shí)驗(yàn)用羊十二指腸賈第蟲(chóng)與微小隱孢子蟲(chóng)雙重PCR檢測(cè)方法，該方法最低可檢測(cè)每克樣品中5×102個(gè)十二指腸賈第蟲(chóng)和微小隱孢子蟲(chóng)的包(卵)囊。在本實(shí)驗(yàn)中，我們選取常用于分離鑒定寄生蟲(chóng)的基因作為靶基因：微小隱孢子蟲(chóng)的卵囊壁蛋白(cowp)和藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)的谷氨酸脫氫酶(gdh)基因[18-19]；采用FAM和VIC作為熒光報(bào)告基團(tuán)；同時(shí)設(shè)計(jì)了“變性—退火延伸”兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，整個(gè)過(guò)程僅需55 min，在提高反應(yīng)通量的同時(shí)縮短反應(yīng)時(shí)間。本研究建立的以TaqMan探針為基礎(chǔ)的雙重FQ-PCR檢測(cè)體系不僅能在同一反應(yīng)管中同時(shí)檢測(cè)“兩蟲(chóng)”，而且具有良好的特異性和靈敏性?！皟上x(chóng)”檢測(cè)的靈敏度分別為4.51×10 copies/μL和5.28×10 copies/μL，穩(wěn)定性和重復(fù)性均在3.81%以下。同時(shí)我們通過(guò)檢測(cè)疑似“兩蟲(chóng)”感染的醫(yī)源性腹瀉樣本，對(duì)建立的FQ-PCR體系和現(xiàn)已商品化的金標(biāo)層析法進(jìn)行比較，結(jié)果表明兩種具有較好的一致性，體現(xiàn)了建立的FQ-PCR體系較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

綜上，本研究建立的雙重FQ-PCR技術(shù)靈敏度高，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性和重復(fù)性好，可用于“兩蟲(chóng)”快速、特異、準(zhǔn)確的定量檢測(cè)。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：李佳， 黃達(dá)娜， 張曉敏，等.藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)和微小隱孢子蟲(chóng)雙重?zé)晒舛縋CR兩步法檢測(cè)技術(shù)的建立[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2020，36(1):32-39. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00. 191