周淑姮，肖方震，劉維俊，劉 菁，韓騰偉，鄧艷琴，2

蜱是一類重要的醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)昆蟲，可傳播多種自然疫源性疾病，包括斑點(diǎn)熱、萊姆病、人粒細(xì)胞無形體病、人埃立克體病、森林腦炎、克里米亞-剛果出血熱、發(fā)熱伴血小板減小綜合征、Q熱等，給人類健康及畜牧業(yè)帶來很大危害,因此研究蜱類具有重要的醫(yī)學(xué)和經(jīng)濟(jì)學(xué)意義。蜱的種類繁多，全球已知18屬896種[1]，我國報(bào)道有2科10屬119種[2],同一種蜱可傳播多種不同疾病，確定蜱的種類是防制蜱和蜱傳疾病的首要任務(wù)[3]。

近年DNA條形碼鑒定技術(shù)由于不受物種發(fā)育階段及個體形態(tài)特征的影響，同時能發(fā)現(xiàn)形態(tài)學(xué)鑒定無法辨認(rèn)的隱存種，已作為一種新型手段在物種鑒定、生物多樣性研究等領(lǐng)域扮演著重要角色并被廣泛應(yīng)用[4]。線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I(COI)基因在保證有足夠變異的同時又能被通用引物擴(kuò)增，且擁有線粒體基因組很少存在插入和缺失的特點(diǎn)，片段長度也很適合解析親緣關(guān)系相近的分類類群[5]，因此，常被選作DNA條形碼鑒定系統(tǒng)的目標(biāo)基因，目前已被廣泛地應(yīng)用于昆蟲的種類鑒定以及發(fā)現(xiàn)隱存種。

目前，國內(nèi)外應(yīng)用COI基因鑒定蜱類的研究不多[6-13]，本研究對福建省常見的12種蜱進(jìn)行DNA條形碼鑒定，并結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定進(jìn)行分析，驗(yàn)證COI基因作為DNA條形碼在蜱類鑒定中的有效性。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 蜱標(biāo)本來源于2012年以來福建省鼠傳及蜱傳疾病(鼠疫、鉤端螺旋體病、流行性出血熱、發(fā)熱伴血小板減少綜合征等)疫源地調(diào)查及監(jiān)測工作。采集的標(biāo)本于95%酒精-80 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2蜱形態(tài)學(xué)鑒定 在體視顯微鏡(Olympus SZX9)下觀察蜱標(biāo)本，參照蜱分類檢索表及相關(guān)文獻(xiàn)[14-16]進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類鑒定。

1.3基因組DNA提取 取單只蜱標(biāo)本，用ddH2O清洗3次后,無需研磨，直接使用Qiagen公司的DNeasy Blood & Tissue Kit，參照試劑盒說明書提取蜱的總DNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｌ崛NA后的蜱標(biāo)本用ddH2O清洗后于75%酒精中保存，用于形態(tài)鑒定的復(fù)核。

1.4PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增COI基因所采用引物為動物DNA條形碼通用引物[11]，即LCO1490(5′-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′)和HCO2198：(5′-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3′), 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。25 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中，含有Premix Taq酶12.5 μL、10 μmol/L上下游引物各0.5 μL、蜱DNA模板3 μL，ddH2O 8.5 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min后以98 ℃變性10 s、47 ℃退火30 s，68 ℃延伸1min、循環(huán)35次，68 ℃總延伸7 min。每次反應(yīng)均設(shè)陰性對照與空白對照。

1.5序列測序 取3 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，目標(biāo)條帶純化后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.6序列處理與分析 用BioEdit軟件進(jìn)行多重序列比對，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜斯ふ{(diào)整；再運(yùn)用MEGA6.0軟件分析各基因序列的堿基組成，基于Kimura-2-parameter 模型計(jì)算遺傳距離。選取每種蜱種內(nèi)遺傳距離最小的2個樣本中的1個樣本，登錄美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫，將其序列經(jīng)BLAST同源性比對，根據(jù)序列相似度選擇參考株。依據(jù)Hebert[5,17]的研究結(jié)果(除腸腔動物外，98%物種的種內(nèi)遺傳距離差異為0～2%)，判斷形態(tài)學(xué)與COI基因DNA條形碼鑒定結(jié)果的一致性。運(yùn)用MEGA6.0軟件，采用鄰接法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分支的置信度采用自展法(Bootstrap analysis，BP) 重復(fù)檢測1 000 次。

2 結(jié) 果

2.1形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，用于基因組DNA提取的97只蜱標(biāo)本隸屬于5屬12種，其基本信息見表1。

2.2蜱類COI基因片段序列分析 研究所用引物位于COI基因5′端，成功擴(kuò)增出蜱類12種97條COI序列，長度約為650 bp，經(jīng)BioEdit軟件比對后保留了626個位點(diǎn)。采用MEGA6.0軟件進(jìn)行序列組成分析，結(jié)果顯示COI基因序列中保守位點(diǎn)有351個，變異位點(diǎn)有275個，簡約信息位點(diǎn)有263個，自裔位點(diǎn)有12個。同時A、T、C和G的平均含量分別為29.5%，37.9%，17.5%和15.1%，其中A+T含量(67.4%)遠(yuǎn)高于G+C含量(32.6%)，表現(xiàn)明顯的A+T堿基偏嗜，符合節(jié)肢動物線粒體基因堿基組成的基本特征[18]。

表1 本研究蜱標(biāo)本的基本信息
Tab.1 Basic information of ticks in this study

屬種采集地點(diǎn)宿主數(shù)量(性別/發(fā)育期)樣品編號花蜱屬Amblyomma龜形花蜱A.testudinarium浦城家豬7(♀3♂4)PC-ATE01～PC-ATE07革蜱屬Dermacentor臺灣革蜱D.taiwanensis大田青毛鼠2(N1L1)DT-DTA01,DT-DTA02浦城野豬1(♂1)PC-DTA03邵武青毛鼠2(N2)SW-DTA04,SW-DTA05周寧野豬2(♀2)ZN-DTA06,ZN-DTA07血蜱屬Haemaphysalis褐黃血蜱H.flava柘榮麂2(♀1♂1)ZR-HFL01,ZR-HFL02周寧麂7(♀2♂5)ZN-HFL03～ZN-HFL09臺島血蜱H.formosensis柘榮麂5(♀2♂3)ZR-HF001～ZR-HF005浦城野豬2(♀1N1)PC-HF006,PC-HF007浦城麂1(N1)PC-HF008周寧麂1(♀1)ZN-HF009周寧野豬4(♀1♂3)ZN-HF010～ZN-HF0013豪豬血蜱H.hystricis柘榮野豬3(♀1♂2)ZR-HHY01～ZR-HHY03柘榮麂1(♂1)ZR-HHY04大田青毛鼠2(N2)DT-HHY05,DT-HHY06周寧野豬3(♀2♂1)ZN-HHY07～ZN-HHY09越原血蜱H.Yeni周寧野豬1(♀1)ZN-HYE01周寧野兔1(♂1)ZN-HYE02周寧麂5(♀2N3)ZN-HYE03～ZN-HYE07硬蜱屬Ixodes粒形硬蜱I.granulatus寧德褐家鼠3(♀1♂1N1)LD-IGR01～LD-IGR03浦城黃毛鼠2(♀2)PC-IGR04,PC-IGR05霞浦針毛鼠1(♂1)XP-IGR06尤溪黃毛鼠2(L2)YX-IGR07,YX-IGR08卵形硬蜱I.ovatus浦城麂2(♀2)PC-IOV01,PC-IOV02周寧麂6(♀6)ZN-IOV03～ZN-IOV08寧化野豬2(♀2)NH-IOV09～NH-IOV10中華硬蜱I.sinensis寧化野兔3(♀3)NH-ISI01～NH-ISI03周寧麂5(♀5)ZN-ISI04～ZN-ISI08基刺硬蜱I.spinicoxalis浦城麂2(♀2)PC-ISP01,PC-ISP02扇頭蜱屬Rhipicephalus微小扇頭蜱R.microplus永春牛11(♀9N1L1)YC-RMI01～YC-RMI11永春犬1(♀1)YC-RMI12浦城牛2(♀1♂1)PC-RMI13,PC-RMI14血紅扇頭蜱R.sanguineus福州犬3(♀3)FZ-RSA01～FZ-RSA03

注：♀為雌性，♂為雄性，N為若蟲，L為幼蟲。

2.3遺傳距離差異分析 在 MEGA6.0中，用Kimura-2-Parameter 模型分別計(jì)算12種蜱97條COI基因序列的種內(nèi)與種間遺傳距離(表2)。種內(nèi)遺傳距離變動范圍為0～7.14%，平均為1.65%，其中卵形硬蜱與微小扇頭蜱的種內(nèi)遺傳距離與其余的10種蜱蟲種內(nèi)遺傳距離存在較大差異，分別為5.46%與7.14%；種間遺傳距離變動范圍為14.65%～26.79%，平均為18.58%，種間遺傳距離顯著大于種內(nèi)遺傳距離。

表2 12種蜱蟲COI基因序列的種內(nèi)與種間的遺傳距離(%)
Tab.2 Intra- and inter- specific genetic distances of 12 species of ticks based on the sequence of mitochondrial COI genes(%)

種類數(shù)量種內(nèi)遺傳距離(最大值)種間遺傳距離 龜形花蜱臺灣革蜱褐黃血蜱臺島血蜱豪豬血蜱越原血蜱粒形硬蜱卵形硬蜱中華硬蜱基刺硬蜱微小扇頭蜱血紅扇頭蜱龜形花蜱70.31臺灣革蜱71.5616.02褐黃血蜱90.3118.0718.07臺島血蜱131.1417.2317.6814.65豪豬血蜱90.4617.7119.5114.9316.81越原血蜱71.4818.6319.7617.0818.1614.80粒形硬蜱50.4619.0619.2321.2717.4821.9619.49卵形硬蜱107.1423.3123.4823.8023.9922.6724.7017.92中華硬蜱80.6721.9622.2823.0320.1020.3421.8116.7718.11基刺硬蜱20.7823.1523.9624.9824.1322.1623.7319.9219.5616.93微小扇頭蜱145.4615.4216.7415.4314.8815.1417.3020.1023.8022.5322.63血紅扇頭蜱3017.8218.7818.1217.2118.8217.6120.7823.8325.5126.7915.86

2.4BLAST同源性比對分析 12種蜱的COI基因片段序列分別通過BLAST同源性比對(表3)，結(jié)果顯示，形態(tài)學(xué)鑒定為越原血蜱及基刺硬蜱的標(biāo)本，未發(fā)現(xiàn)與之相匹配的高相似度的參考株，相似度最高者H.concinna與I.ricinus,遺傳距離均>10%，說明越原血蜱與基刺硬蜱的COI基因序列尚未上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，通過比對，僅能鑒定至屬名；褐黃血蜱、臺島血蜱、豪豬血蜱、粒形硬蜱、微小扇頭蜱與血紅扇頭蜱等6種蜱與參考株的名稱一致，且遺傳距離均小于2%，表明形態(tài)學(xué)鑒定與DNA條形碼鑒定結(jié)果一致；卵形硬蜱同I.ovatuscomplex sp. Group 3遺傳距離為4.47%，考慮為不同隱存復(fù)合群；與形態(tài)鑒定為龜形花蜱的樣本具有高相似度的參考株除了龜形花蜱外還有A.pattoni，而形態(tài)鑒定為臺灣革蜱、中華硬蜱的樣本，其DNA條形碼鑒定結(jié)果則完全不一致，與臺灣革蜱高相似度的參考株有D.reticulatus、D.auratus、D.steini，與中華硬蜱高相似度的參考株有I.nipponensis與I.asanumai。

2.5系統(tǒng)發(fā)育分析 基于Kimura-2-parameter 模型，利用MEGA6.0軟件鄰接法構(gòu)建蜱類COI基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)，從種的水平上看，微小扇頭蜱與卵形硬蜱的所有個體分別聚為一支，但均存在2個(或3個)高度分化的支系, 并且具有很高的置信度(>99%), 表明微小扇頭蜱與卵形硬蜱可能至少包含2個(或3個)隱存的復(fù)合群，其余10種蜱的所有不同個體連同高相似度的參考株均分別聚集成簇，形成各自的單獨(dú)一支，節(jié)點(diǎn)置信度均為100%。參考株A.pattoni同龜形花蜱聚在同一支，D.reticulatus、D.auratus、D.steini同臺灣革蜱聚在同一支，I.nipponensis與I.asanumai同中華硬蜱聚在同一支，此結(jié)果與上述同源性比對分折結(jié)果一致，說明實(shí)驗(yàn)標(biāo)本同對應(yīng)的參考株為同一物種的可能性大。從屬的水平上看，花蜱屬與革蜱屬因種類單一，不能分析其屬內(nèi)親緣關(guān)系；扇頭蜱屬3個種類匯成一個單系；但血蜱屬與硬蜱屬不能形成相互獨(dú)立的單系，屬間存在著同源交叉。從置信度數(shù)值上看，每分支(同種)節(jié)點(diǎn)置信度均高達(dá)99%以上，而種間節(jié)點(diǎn)置信度則普遍較低。此研究結(jié)果表明，對于蜱分子系統(tǒng)親緣關(guān)系的研究，COI基因適合在較低階元(種)間進(jìn)行，但是對于較高級階元(如屬)尚不適用，這與高博等[21]、吳榮泉等[22]的研究結(jié)果相符。

3 討 論

本研究采用的蜱樣本除了成蟲外尚有若蟲和幼蟲，不同發(fā)育期的同種蟲體其遺傳距離均在種內(nèi)變動范圍內(nèi)，在系統(tǒng)發(fā)育樹上均能聚集在同一支，證實(shí)了DNA條形碼技術(shù)鑒定不受蟲體發(fā)育階段的影響。本研究在提取基因組DNA后，蟲體仍能保持其形態(tài)完整性，這對實(shí)驗(yàn)后的形態(tài)復(fù)核以及稀有種的保存起著重要作用，同時也證實(shí)了DNA條形碼鑒定技術(shù)只需微小的量即能完成，可用于形態(tài)無法辨別的殘缺標(biāo)本。

表3 12種蜱蟲COI基因片段序列的BLAST同源性比對
Tab.3 BLAST homology comparison of 12 species of ticks

樣品編號 形態(tài)學(xué)鑒定參考株 GenBank 登錄號序列相似度(%)遺傳距離PC-ATE03龜形花蜱A.testudinariumA.testudinariumHM193893.199.41 0.59 A.pattoniHM193876.199.70 0.30 A.pattoniHM193875.199.05 0.95 ZN-DTA07臺灣革蜱D.taiwanensisD.reticulatusHM193884.198.73 1.27 D.reticulatusHM193886.198.56 1.44 D.auratusMG721047.198.60 1.40 D.steiniHM193861.198.26 1.74 ZN-HFL06褐黃血蜱H.flavaH.flavaJQ737097.199.11 0.89 H.flavaKY021819.198.82 1.18 ZR-HF002臺島血蜱H.formosensisH.formosensisJX573135.198.68 1.32 DT-HHY06豪豬血蜱H.hystricisH.hystricisNC_039765.199.25 0.75 H.hystricisJX573137.199.10 0.90 ZN-HYE05越原血蜱H.YeniH.concinnaKY364906.187.70 12.30 PC-IGR04粒形硬蜱I.granulatusI.granulatusMG721046.199.25 0.75 I.granulatusKM497429.199.38 0.62 PC-IOV01卵形硬蜱I.ovatusI.ovatus complex sp. Group 3MH208687.196.10 3.90I.ovatus complex sp. Group 3MH208690.295.53 4.47NH-ISI02中華硬蜱I.sinensisI.nipponensisKY606284.199.51 0.49 I.nipponensisKY606283.199.35 0.65 I.asanumaiAB231674.198.94 1.06 PC-ISP01基刺硬蜱I.spinicoxalisI.ricinusAY945444.185.1714.83YC-RMI09微小扇頭蜱R.microplusR.microplusKT906178.199.55 0.45 R.microplusKT906180.199.55 0.45 FZ-RSA01血紅扇頭蜱R.sanguineusR.sanguineusJX416302.1100 0 R.sanguineusKX383817.1100 0

注：經(jīng)BLAST同源性比對后，參考株的選取規(guī)則為1若序列相似度最大值>90%，則選取所有相似度>90%的物種，但種名相同的多株只選取相似度最高的兩株;2若序列相似度最大值<90%,則選取相似度最高者。

形態(tài)上很難或不易區(qū)分，但是相互間存在生殖隔離的一組物種，被稱為隱存種[20]。隨著DNA分類方法的發(fā)展和應(yīng)用, 物種隱存多樣性越來越多地被發(fā)現(xiàn)。Leo等[6]研究發(fā)現(xiàn)在COI與16S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹上，D.albipictus均出現(xiàn)2個支系,其平均遺傳差異分別為7.1%與4.5%。 Li等[13]分析了云南省中緬邊境騰沖縣硬蜱的遺傳多樣性，通過COI及16S rRNA基因的遺傳分析顯示，通過形態(tài)學(xué)鑒定為R.microplus、R.haemaphysaloides、I.ovatus、H.longicornis、H.shimoga和H.kitaokai

注:圖中分支上數(shù)值為1 000次自展檢驗(yàn)置信度，標(biāo)尺示遺傳距離，樣本編號見表1,登錄號見表2。圖1 基于COI 基因核苷酸序列用Kimura-2-parameter 模型構(gòu)建的蜱類鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Neighbor-joining phylogenetic tree of ticks based on nucleotide sequence of COI with Kimura 2-parameter model

等6個蜱種均存在2個或3個隱存的復(fù)合群，群間遺傳距離超過了通常的種內(nèi)遺傳距離。本次對微小扇頭蜱與卵形硬蜱的研究結(jié)果與之相符。這也說明蜱類的隱存多樣性在自然界中較廣泛地存在著，這些隱存種的發(fā)現(xiàn)為我們重新認(rèn)識蜱類生物多樣性提供了可靠的證據(jù)。

由于蜱的形態(tài)學(xué)鑒定比較困難，尤其是同亞屬內(nèi)的蜱種形態(tài)極為相似，常常誤定[21]。本研究實(shí)驗(yàn)室成員已對福建省所有留存的蜱類標(biāo)本進(jìn)行重新觀察鑒定，并經(jīng)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院許榮滿教授復(fù)核，修正了以往文獻(xiàn)中誤定的種類[22-23]。本研究通過COI基因序列差異性比較及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)一些種類的DNA條形碼鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定不符，考慮有以下原因：①GenBank中上傳的原始數(shù)據(jù)可能出現(xiàn)形態(tài)學(xué)鑒定錯誤，有文獻(xiàn)[22-23]將臺灣革蜱誤定為D.auratus與D.steini，數(shù)據(jù)庫中與臺灣革蜱高相似度的金澤革蜱和斯坦因革蜱是否存在誤訂有待進(jìn)一步核實(shí)。②實(shí)驗(yàn)用樣本的種名與數(shù)據(jù)庫中相似度高的參考株種名可能是同種異名，我們將中華硬蜱與I.nipponensis的形態(tài)描述[24]作了比較，發(fā)現(xiàn)兩者形態(tài)特佂并無明顯差別，考慮中華硬蜱可能是I.nipponensis的異名,還需進(jìn)一步核實(shí)。③COI基因片段信息含量較少，以及近緣種之間出現(xiàn)的基因交流現(xiàn)象，可能導(dǎo)致目的序列與其他種的序列極為相似[25]。DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于蜱類的研究尚處于起步階段，上述3種原因難以避免，Zhang等[8]從GenBank 與BOLD中下載667條蜱類COI序列進(jìn)行遺傳距離的研究，發(fā)現(xiàn)一些不同蜱種之間出現(xiàn)了很低的遺傳差異并意外聚類，表明DNA條形碼的成功鑒定高度依賴于準(zhǔn)確的形態(tài)學(xué)鑒定。因此，我們認(rèn)為現(xiàn)階段DNA條形碼技術(shù)用于蜱類鑒定尚不能脫離傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定而獨(dú)立進(jìn)行，必要時，還需聯(lián)合多分子標(biāo)記來綜合研判，防止研究結(jié)果出現(xiàn)偏差[26]。

綜上所述，基于COI基因的DNA條形碼鑒定技術(shù)不受物種發(fā)育階段及個體形態(tài)特征的影響，還能發(fā)現(xiàn)形態(tài)學(xué)鑒定無法辨認(rèn)的隱存種，這些優(yōu)勢是傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)無可比擬的。本研究結(jié)果顯示COI基因的DNA條形碼測定是一種快速、準(zhǔn)確的蜱類鑒定新興技術(shù)，然而在現(xiàn)階段，COI基因DNA條形碼技術(shù)尚不能完全脫離傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定而獨(dú)立進(jìn)行，兩者應(yīng)有機(jī)地結(jié)合起來，更好地發(fā)揮各自的優(yōu)勢，以達(dá)到對蜱類準(zhǔn)確高效地鑒定。

利益沖突：無

引用本文格式：周淑姮，肖方震，劉維俊，等.COI基因DNA條形碼技術(shù)在福建省蜱類鑒定中的應(yīng)用[J].2020,36(01):25-31.DOI：DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.104