王 敏, 羅曉磊, 沈 磊, 寧 曉, 肖朝江, 姜 北

旋毛形線蟲簡稱旋毛蟲，是一種寄生線蟲，可以感染人類及其他哺乳動物而引起旋毛蟲病[1]。旋毛蟲病是一種嚴重的食源性人獸共患寄生蟲病[2]，主要因食用感染旋毛蟲的生肉或未煮熟的肉而引起，在全球范圍內仍然是一種嚴重的傳染病[3]，而且嚴重影響豬肉生產和食品安全[4]。云南大理白族人民有生食豬肉的傳統(tǒng)習俗，因此感染旋毛蟲病的風險更大，是當地的主要危害性寄生蟲病之一。

旋毛蟲病的臨床表現不明確，臨床診斷比較困難[5]。目前，肌肉活檢和血清學檢查常被用于診斷人類旋毛蟲病[6]。旋毛蟲不同于其他蠕蟲，因為它的生命周期是在單一宿主體內完成的，包括2個不同的寄生部位，腸上皮細胞和骨骼肌細胞[7]。感染性幼蟲侵入小腸上皮細胞，經歷4次蛻皮大約在31 h發(fā)育成熟至成蟲階段，雌、雄成蟲交配，產生新生幼蟲，隨血液及淋巴液循環(huán)移行至全身各器官，并侵入骨骼肌內發(fā)育，幼蟲周圍形成囊包后完成生命周期[8]。許多生物體的雄性和雌性通常容易感染同一種寄生蟲，但感染后在免疫反應的強度或類型上會表現出明顯的差異[9]?？赡苁怯捎谛约に貙γ庖呦到y(tǒng)的影響，從而導致寄生蟲和寄主性別之間在感染的發(fā)生率及對寄生蟲的耐受力上存在差異[10-11]。對大鼠和小鼠的研究證實，雄性的體液免疫和細胞免疫通常低于雌性[12]。曾有文獻報道旋毛蟲感染哺乳動物及人類存在雌雄差異，但將小鼠的性腺切除后這種差異就有所減小[13]。因為雄性物種分泌的睪酮可以抑制機體的免疫功能，而雌性物種分泌的雌二醇會增強免疫功能。對田鼠進行雌雄性別感染差異的實驗中就證實雄性田鼠比雌性更易感染旋毛蟲[14-15]。另有研究證明雌二醇、黃體酮、睪酮在旋毛蟲的體外實驗中也存在明顯差異，雌二醇及黃體酮抑制旋毛蟲蛻皮，而睪酮卻沒有影響[16]。新生小鼠接觸雙酚A至性成熟后感染旋毛蟲，由于性激素的影響導致雌性小鼠小腸成蟲數明顯低于雄性小鼠[17]。為進一步明確性別與旋毛蟲感染之間的關系，本文就雌雄昆明小鼠感染旋毛蟲早期在免疫能力上是否存在差異進行了研究。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級昆明種小鼠80只，5周齡左右，體質量18～22 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。實驗動物生產許可證號SCXK(湘)2016-0002。動物實驗完全依照大理大學醫(yī)學倫理委員會及大理大學藥學與化學學院實驗動物管理委員會的相關規(guī)定進行。

1.2蟲種來源 本實驗所用旋毛形線蟲(Trichinellaspiralis)由大理大學基礎醫(yī)學院寄生蟲學教研室惠贈。

1.3主要試劑與儀器 流式細胞儀FACS Calibur(BD公司)；酶標儀(賽默飛世爾科技有限公司)；CO2孵育箱(日本三洋電氣公司)；M700E倒置顯微鏡(日本尼康公司)；XFA6130型全自動動物血液細胞分析儀(南京普朗生物醫(yī)學有限公司)；FITC Rat Anti-Mouse CD4、PE Rat Anti-Mouse CD25，均購自BD公司(貨號：557307，553075；批號：8127689，8066576)；IL-2、IL-4、IL-10 Elisa試劑盒購自南京建成生物工程研究所(貨號：20190508；批號：20191107)。

1.4實驗分組與旋毛蟲感染 昆明種小鼠80只，雌雄各半，隨機分為8組，每組10只。4組為雌性小鼠，另4組為雄性小鼠，分別感染0、200、400、800條旋毛蟲。

1.5指標測定 各組小鼠于感染后第7 d尾靜脈取血20 μL，加入至1.6 mL血細胞稀釋液中，混勻后于全自動動物血液細胞分析儀測定白細胞組成比例；眼眶后靜脈叢采血，室溫靜置30 min后3 500 r/min離心10 min，收集血清用Elisa試劑盒測定血清中IL-2、IL-4、IL-10的濃度。處死小鼠后，稱體質量，脾臟和胸腺組織質量，計算臟器指數=臟器質量(g)/體質量(g)×100%；部分組織于10%中性甲醛中固定24 h后，石蠟包埋，切片，HE染色觀察組織變化；部分脾臟組織用PBS制成細胞懸液，加入紅細胞裂解液裂解后，離心重懸，調整淋巴細胞濃度為1.0×106/mL，再加入FITC標記的抗小鼠CD4抗體3 μL和 PE 標記的抗小鼠CD25抗體4 μL 4℃避光孵育30 min，于流式細胞儀測定CD4+CD25+T 細胞(即免疫調節(jié)性T細胞)的百分比。

2 結 果

2.1臟器指數 雌雄小鼠感染不同劑量旋毛蟲后的臟器指數如表1所示，正常雌雄性小鼠的脾臟指數無明顯差異，但正常及感染200條雌性小鼠的胸腺指數高于雄性小鼠(t0=3.248,P<0.05;t200=4.595,P<0.01)。小鼠感染不同劑量旋毛蟲后，雌性小鼠脾臟和胸腺指數均未見顯著變化，其比較無統(tǒng)計學意義(F=0.809,P>0.05；F=1.157,P>0.05)；雄性小鼠脾臟指數變化也不明顯，然而其胸腺指數較正常組有顯著的升高，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=3.782,P<0.05)。表明感染旋毛蟲后，雄性小鼠的胸腺明顯腫大，而雌性小鼠未發(fā)現此現象。

2.2白細胞組成比例 各組小鼠白細胞組成比例測定結果見表2，與正常組相比，感染旋毛蟲后雌雄小鼠的淋巴細胞百分比有不同程度的下降，單核細胞和粒細胞百分比有不同程度的上升(F=3.875，P<0.01；F=2.460，P<0.05)。比較感染旋毛蟲后，雌雄小鼠的差異發(fā)現：雄性小鼠的白細胞組成比例變化更為顯著，表現為淋巴細胞百分比下降更明顯，而單核細胞和粒細胞百分比上升更多，其中，800條旋毛蟲感染小鼠后，與雌性小鼠相比，雄性小鼠的淋巴細胞和單核細胞百分比差異具有統(tǒng)計學意義(tLY=2.604，P<0.05;tMO=-2.448，P<0.05)。

表1 感染不同劑量旋毛蟲小鼠臟器指數(n=10)
Tab.1 Organ index of mice infected with different doses ofTrichinellaspiralis(n=10)

Infection Dose(TS/mouse)Organ index (%,female / male)SpleenThymus00.26±0.05 / 0.23±0.070.44±0.12 / 0.20±0.06①2000.25±0.03 / 0.23±0.040.43±0.02 / 0.31±0.06②4000.28±0.04 / 0.27±0.070.40±0.11 / 0.35±0.068000.29±0.04 / 0.24±0.070.41±0.05 / 0.34±0.07

Compared to female mice infected withT.spiralisat the same dose, ①P<0.01, ②P<0.05

表2 感染不同劑量旋毛蟲小鼠白細胞組成比例(n=10)
Tab.2 Composition of white blood cells in mice infected with different doses ofTrichinellaspiralis(n=10)

Infection Dose(TS/mouse)WBC (%,female / male)LYMOGR080.30±3.57 / 78.53±3.615.37±1.34 / 5.12±2.1514.37±2.38 / 16.34±2.7420073.30±8.53② / 74.02±7.227.12±1.95 / 6.63±2.7219.58±7.67② / 19.34±4.8540074.28±4.95 / 69.70±7.39③7.39±1.67② / 8.43±1.60③18.31±3.45 / 21.84±5.89④80079.99±6.85 / 66.50±3.25④⑥5.44±3.01 / 11.00±1.27③⑥14.61±4.60 / 22.55±4.45④

WBC: White Blood Cell; LY: Lymphocyte; MO: Monocyte; GR:Granulocyte；TS:Trichinellaspiralis

Compared to the normal female group, ①P<0.01, ②P<0.05; compared to the normal male group, ③P<0.01, ④P<0.05; compared to female mice infected with T. spiralis at the same dose,⑤P<0.01, ⑥P<0.05.

2.3胸腺組織病理變化 結果見圖1，正常組中，雌雄小鼠胸腺組織的皮質和髓質的界限較為清楚，雌性小鼠的皮質明顯多于髓質，而雄性小鼠的皮質與髓質的比例相當。感染200、400條旋毛蟲后，雌雄小鼠的皮質與髓質分界仍清楚，皮質區(qū)可見排列整齊、密集的淋巴細胞，小葉間隔清晰可見，雌雄之間并不存在明顯差異。但感染800條旋毛蟲后，雌性小鼠的髓質比例有所減小，皮質淋巴細胞排列不整齊，而雄性小鼠的髓質中可見有小血管分布，皮質變化不明顯。

2.4脾臟組織病理變化 結果見圖2，正常組中，雌雄小鼠脾臟結構完整，白髓和紅髓分界以及脾小梁雌性較雄性更為清晰。感染200、400、800條旋毛蟲后，雄性小鼠白髓和紅髓的分界較雌性更為清晰。雄性小鼠的脾小梁較為密集，而雌性小鼠的脾小梁則較為稀疏。雌雄之間在結構上確實存在差異，但在感染的劑量上并未呈現出明顯差異。

2.5血清IL-2、IL-4、IL-10含量測定 結果見表3，與正常組相比，感染旋毛蟲后雌性小鼠的IL-2上升，雄性小鼠下降；IL-4含量雌雄小鼠均上升(F=5.664,P<0.05，P<0.01)；除感染400條旋毛蟲組外，IL-10含量均有不同程度的上升。比較旋毛蟲感染后的雌雄小鼠差異發(fā)現：IL-2的含量雌性上升，雄性下降，且感染800條旋毛蟲組雄性顯著低于雌性(t=3.615,P<0.05)。IL-4含量雄性上升趨勢高于雌性，IL-10含量變化趨勢雄性高于雌性，但各組之間差異并不具有統(tǒng)計學意義(F=1.170,P>0.05)。

表3 感染不同劑量旋毛蟲小鼠白細胞介素含量(n=10)
Tab.3 Interleukin levels in mice infected with different doses ofTrichinellaspiralis(n=10)

Infection Dose(TS/mouse)Interleukin levels (ng/L,female / male)IL-2IL-4IL-100400.84±29.56 / 379.53±23.3259.25±7.92 / 42.90±13.67192.94±4.76 / 202.73±27.30200414.73±100.86 / 361.04±55.8370.69±22.60 / 89.57±17.03③205.86±27.73 / 227.01±21.85400464.08±98.41 / 350.95±42.9169.89±16.65 / 94.95±31.34③191.83±37.66 / 192.88±41.36800478.16±49.67 / 346.80±38.66⑥91.69±15.20② / 102.81±18.13③238.01±7.44 / 231.71±47.00

TS:Trichinellaspiralis

Compared to the normal female group, ①P<0.01, ②P<0.05; compared to the normal male group, ③P<0.01, ④P<0.05; compared to female mice infected with Trichinella spiralis at the same dose, ⑤P<0.01, ⑥P<0.05.

2.6脾臟免疫調節(jié)性T細胞 流式細胞術檢測CD4+CD25+(即免疫調節(jié)性T細胞)比例，結果表明，與正常組相比，感染旋毛蟲后，雌性小鼠的免疫調節(jié)性T細胞均上升，但各組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(F=1.037,P>0.05)。感染400條旋毛蟲后，與雄性正常小鼠比較，其免疫調節(jié)性T細胞明顯上升，兩組之間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=5.088,P<0.01)，但同一感染量雌雄之間進行獨立樣本t檢驗后差異無統(tǒng)計學意義(t0=-0.485,P>0.05;t200=0.813,P>0.05;t400=-1.715,P>0.05;t800=0.526,P>0.05)，結果見圖3。

3 討 論

旋毛蟲寄生在寄主體內，在不嚴重損害寄主的情況下逃避寄主的免疫，從而平衡與寄主免疫系統(tǒng)的關系。旋毛蟲侵襲小腸時會引起腸道細胞的高收縮，導致嗜酸性粒細胞增多，從而刺激炎癥的產生，進而誘發(fā)Th1和Th2免疫反應。Th1細胞分泌IL-2及IFN-γ，介導細胞毒及局部炎癥反應，清除細胞中的病毒、細菌及寄生蟲。Th2細胞分泌IL-4、IL-10刺激B細胞增殖及產生抗體，清除游離的微生物。然而，過于強烈的免疫反應不僅會殺死外來物質，還會影響寄主自身。因此，當存在過強的免疫反應時，免疫調節(jié)性T細胞(Treg細胞)被激活，與Th1、Th2共同發(fā)揮免疫調節(jié)作用[18-20]。

臟器指數結果顯示雌雄小鼠感染不同數量旋毛蟲后，僅對雄性小鼠胸腺指數有一定影響。胸腺和脾臟的組織學檢查結果顯示胸腺的結構雌雄之間并不存在明顯差異，但脾臟組織學檢查結果卻顯示感染旋毛蟲后對雌性小鼠脾臟的影響較為顯著。白細胞組成比例結果顯示雌雄小鼠感染不同數量旋毛蟲后其淋巴細胞百分比降低，單核細胞、粒細胞百分比較正常組升高。此結果與文獻[21]報道一致，血液或組織中嗜酸性粒細胞水平的增加歷來被認為是哺乳動物寄生蟲感染的一個顯著特征，且嗜酸性粒細胞的應答并不呈現出感染劑量依賴性。IL-2含量測定結果顯示感染旋毛蟲的雌性高于雄性。IL-4、IL-10含量雄性均高于雌性。Treg中 CD4+CD25+的比例顯示與正常對照組相比其比例均上升，感染200、800條旋毛蟲的雄性小鼠低于雌性，其余各組 CD4+CD25+的比例雄性高于雌性。根據以上結果提示感染旋毛蟲后雄性小鼠的免疫能力強于雌性小鼠。

有文獻報道[14-15]旋毛蟲感染哺乳動物及人類存在雌雄差異，因為雄性物種分泌的睪酮可以抑制機體的免疫功能，而雌性物種分泌雌二醇會增強免疫功能。因而推測可能是由于性激素的分泌，從而導致雌性的Th1免疫反應強于雄性，刺激IL-2的分泌使其含量高于雄性，IL-2含量的升高促進寄主的細胞免疫。雄性的Th1免疫較弱可能轉而增強Th2免疫，進而導致體液免疫增強即刺激Th2型細胞因子IL-4、IL-10的分泌，故IL-4、IL-10的含量雄性小鼠高于雌性小鼠[22]。IL-10含量的升高會增強Treg的免疫反應，從而導致 CD4+CD25+的比例與正常對照組相比雌雄均升高且雄性高于雌性。在旋毛蟲感染中，嗜酸性粒細胞具有免疫調節(jié)作用，可以刺激樹突狀細胞和CD4+細胞進而刺激IL-10的產生。在感染旋毛蟲后的最初幾個小時內，嗜堿性細胞和肥大細胞是Th2細胞因子的重要供體。且結果顯示感染旋毛蟲后粒細胞比例雄性高于雌性，因此導致雄性小鼠的Th2免疫反應強于雌性[23-25]。有研究報道旋毛蟲在感染后10-28 h侵入小腸粘膜層，停留2-3周。感染后1、2周小腸的Treg細胞數量增加，實驗結果也顯示Treg(CD4+CD25+)比例在感染旋毛蟲后升高，與文獻報道的結果一致[26]。但是各項指標測定結果并未呈現出顯著的感染劑量依賴性，可能是由于寄主感染較多數量旋毛蟲后，在空間(即在腸道上皮細胞)和營養(yǎng)物質產生激烈競爭，以及寄主對旋毛蟲的排出作用，導致高劑量感染后可能對寄主免疫產生抑制作用[27]。對于寄主在旋毛蟲感染后引起的反應存在很大變異，這是由遺傳決定的?？赡芘c主要組織相容性復合體(MHC)有關，也可能與非MHC相關基因有關[28]。結合以上臟器指數、白細胞組成比例、胸腺和脾臟組織學檢查、IL-2、IL-4、IL-10含量以及Treg(CD4+CD25+)的比例可以看出，感染旋毛蟲后雄性小鼠的免疫反應強于雌性小鼠，但造成這種現象的主要原因還有待進一步研究。

利益沖突：無

引用本文格式：王敏，羅曉磊，沈磊, 等. 感染旋毛蟲小鼠免疫能力的性別差異研究[J].中國人獸共患病學報，2020，36(1):01-06. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.189