劉宇，趙雪，鄒敏，邵淑敏，李嬌，張衷源，汪文諍，張玲，*

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院計(jì)劃生育研究所，2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 430000)

游離DNA(circulating cell free DNA，cfDNA)是游離于細(xì)胞外的核酸，廣泛存在于血液[1-7]、卵泡液[8-9]、胚胎培養(yǎng)液[10-11]等液體中。血清和血漿中的cfDNA作為一種無(wú)創(chuàng)的檢測(cè)手段在腫瘤等疾病早期診斷及預(yù)后監(jiān)測(cè)中表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。cfDNA包括游離核DNA(circulating cell free nuclear DNA，cfnDNA)和游離線粒體DNA(circulating cell free mitochondrial DNA，cfmtDNA)。線粒體DNA的結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單且數(shù)量多，因此，cfmtDNA具有成為無(wú)創(chuàng)檢測(cè)標(biāo)志物的潛力。盡管有不少研究顯示了cfmtDNA與腫瘤的相關(guān)性[12-13]，然而，對(duì)體液中cfmtDNA的研究尚處于起步階段，其檢測(cè)仍然存在很多問(wèn)題，定量分析缺乏一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，各實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果缺乏可比性。因此，本研究擬通過(guò)對(duì)卵泡液處理和冷凍儲(chǔ)存、不同Q-PCR引物和試劑盒進(jìn)行分析比較，探索影響卵泡液中cfmtDNA提取和定量的因素，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

資料和方法

一、研究對(duì)象

收集2016年3月～10月在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行IVF/ICSI的78名患者的1～2個(gè)大卵泡液。其中14名患者的卵泡液用于卵泡液處理、冷凍儲(chǔ)存和試劑盒選擇研究；剩余64名患者的卵泡液用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q-PCR)引物的比較研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)大卵泡(直徑>16 mm的卵泡)的卵泡液；(2)無(wú)明顯肉眼可見的血液污染。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)([2017]倫審字(S206)號(hào))。

二、主要試劑和儀器

1.主要試劑：DNase/RNase-Free Deionized water(北京天根生化科技)、 SYBR Green(Takara，日本)、50 bp DNA ladder(北京天根生化科技)

2.主要儀器和軟件：StepOne實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI公司，美國(guó))；PCR產(chǎn)物凝膠電泳儀(JY200C，君意東方電泳設(shè)備，北京)；臺(tái)式低溫離心機(jī)(Heofuge 15R，力康生物)；凝膠成像系統(tǒng)：Biometra BDA Digital(Biometra，德國(guó))

三、方法

1.卵泡液的處理：卵泡液用4種方法處理，分別為：(1)一步離心法即3 000g離心15 min；(2)兩步離心法即3 000g離心15 min后16 000g離心10 min；(3)在兩步離心法的基礎(chǔ)上用0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾；(4)在兩步離心法的基礎(chǔ)上用0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾；對(duì)cfmtDNA的提取量進(jìn)行比較。

通過(guò)比較卵泡液4種處理方法對(duì)cfmtDNA提取量的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們均用兩步離心法處理樣本。將IVF/ICSI患者的每人2 ml大卵泡液分成兩份：一份新鮮樣品直接提取cfmtDNA；另一份冷凍24 h后提取cfmtDNA。分別對(duì)新鮮及冷凍24 h后提取出來(lái)的cfmtDNA進(jìn)行定量。

2.DNA提?。悍謩e采用BeaverBeadsTMCirculating DNA 試劑盒和TIANamp Genomic DNA試劑盒進(jìn)行樣本中cfmtDNA提取。提取方法完全按照試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行，用200 μl洗脫液洗脫DNA。

3.q-PCR：用線粒體編碼的基因ND1[11]和hmito3[15]為引物定量cfmtDNA，hmito3引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)，并進(jìn)行驗(yàn)證，合成委托上海生工生物工程公司，引物序列詳情見表1。

表1 線粒體編碼的基因ND1和hmito3引物序列

熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μl，每個(gè)q-PCR反應(yīng)包括2 μl cfmtDNA模板、2 μmol/L正向和反向引物和10 μl SYBR Green I的反應(yīng)混合物。qPCR反應(yīng)條件：在95℃孵育30 s，接著在95℃進(jìn)行5 s的變性，以及60℃ 30 s的退火和72℃ 30 s的延伸，40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)定量PCR在StepOne Software v2.3中進(jìn)行。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

4.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

(1)標(biāo)準(zhǔn)品的制備：通過(guò)普通PCR擴(kuò)增線粒體編碼的ND1和hmito3基因，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定并切膠回收測(cè)濃度，此時(shí)的瓊脂糖凝膠電泳產(chǎn)物即為標(biāo)準(zhǔn)品i。

(2)絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：標(biāo)準(zhǔn)品i通過(guò)連續(xù)15次的5倍稀釋得到標(biāo)準(zhǔn)品ii-XVi，將標(biāo)準(zhǔn)品i-XVi分別進(jìn)行熒光定量PCR分析。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μl： 2 μl標(biāo)準(zhǔn)品、2 μmol/L正向和反向引物和10 μl SYBR Green I的反應(yīng)混合物；反應(yīng)條件為：在95℃孵育30 s，接著在95℃進(jìn)行5 s的變性，以及60℃ 30 s的退火和72℃ 30 s的延伸，40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)定量PCR在StepOne Software v 2.3中進(jìn)行。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、線粒體基因引物的特異性、相關(guān)性和絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

兩對(duì)引物用于熒光定量PCR以后，均顯示出良好的擴(kuò)增效果，熔解曲線正常，無(wú)引物二聚體和非特異性擴(kuò)增，引物的特異性好(圖1A、B，圖2A、B)。2%瓊脂糖凝膠電泳圖顯示，ND1和hmito3分別可見139 bp和129 bp的目的條帶(圖1C)。ND1絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.78x+5.2715，其中R2=0.9979，擴(kuò)增效率為83.89%(圖1D)；hmito3絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.5489x+0.8876，其中R2=0.999 4，擴(kuò)增效率為91.33%(圖2C)。ND1和hmito3兩個(gè)基因的擴(kuò)增效率好，適用于樣本分析。在同一熒光閾值下，ND1和hmito3引物擴(kuò)增cfmtDNA所得的濃度平均值分別為(3.49±5.17)ng/L和(0.03±0.02)ng/L，兩對(duì)引物濃度平均值之間有顯著性差異(P<0.05)，相關(guān)性分析顯示ND1與hmito3良好的相關(guān)性(r=0.63，P<0.000 1)，因此在后面的研究中，我們只選擇了其中一種線粒體基因的引物ND1進(jìn)行定量分析。

二、新鮮樣本中4種不同的處理方案對(duì)卵泡液中cfmtDNA提取量的影響

4種不同的處理方案下，用線粒體基因ND1去定量卵泡液中cfmtDNA濃度，結(jié)果依次為：(14.34±14.81)ng/L、(3.41±5.04)ng/L、(2.19±2.72)ng/L、(1.58±2.08)ng/L。一步離心法得到的cfmtDNA濃度最高，與其他三種方案相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其他3種方案之間cfmtDNA濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

圖1 ND1引物的Q-PCR結(jié)果

A：擴(kuò)增曲線；B：熔解曲線；C：標(biāo)準(zhǔn)曲線；其中hmito3引物的凝膠電泳圖譜見圖1 C圖2 hmito3引物的Q-PCR結(jié)果

圖3 新鮮樣本中4種不同的處理方案對(duì)卵泡液中cfmtDNA提取量的影響與一步離心法相比，*P<0.05

三、儲(chǔ)存條件對(duì)卵泡液中cfmtDNA提取量的影響

以ND1為引物對(duì)cfmtDNA進(jìn)行定量，冷凍前樣本中提取到的cfmtDNA濃度為(3.41±5.04)ng/L，冷凍后樣本中cfmtDNA為(2.82±2.40)ng/L，兩者cfmtDNA濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

四、兩種不同試劑盒對(duì)卵泡液中cfmtDNA提取量的影響

用ND1定量?jī)煞N試劑盒提取卵泡液中cfmtDNA的濃度，BeaverBeadsTMCirculating DNA試劑盒提取卵泡液中cfmtDNA的濃度為(5.17±2.77)ng/L，而TIANamp Genomic DNA試劑盒提取的為(2.79±2.37)ng/L，前者比后者提取到卵泡液中cfmtDNA的量顯著增加(P<0.05)(圖4)。

圖4 兩種不同的試劑盒提取卵泡液中cfmtDNA的比較與TIANamp Genomic DNA試劑盒相比較，*P<0.05

討 論

近年來(lái)由于分子生物學(xué)的飛躍發(fā)展，對(duì)體液中的cfDNA和cfmtDNA的研究有了長(zhǎng)足的進(jìn)展。線粒體為細(xì)胞活動(dòng)提供所必需的能量，同時(shí)參與細(xì)胞內(nèi)新陳代謝、鈣離子穩(wěn)定[15]、細(xì)胞凋亡和信號(hào)傳遞等多種生物過(guò)程，能夠較為全面的反映細(xì)胞的功能狀態(tài)。線粒體DNA質(zhì)與量的變化可導(dǎo)致氧化磷酸化異常等線粒體功能不良，在疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。而且，線粒體DNA還具有基因長(zhǎng)度短、分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單及拷貝數(shù)眾多等特點(diǎn)。因此，cfmtDNA具有成為信息量大、敏感性高的血清標(biāo)志物潛力。目前關(guān)于cfmtDNA的研究主要針對(duì)血液及其他體液中cfmtDNA與腫瘤的關(guān)系，卵泡液中cfmtDNA的研究尚未見報(bào)道。

我們的研究結(jié)果顯示3 000g離心15 min的條件下卵泡液中cfmtDNA的濃度是最高的，而后3種處理方式下cfmtDNA的濃度差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這與Chiu等[16]人的研究結(jié)果是一致的。他們通過(guò)研究循環(huán)線粒體DNA的物理特征發(fā)現(xiàn)，不同的離心和過(guò)濾方案會(huì)影響健康個(gè)體血漿中線粒體DNA的定量，可能是由于血漿中存在顆粒相關(guān)(particle-associated)的線粒體DNA和非顆粒相關(guān)(non-particle-associated)的線粒體DNA。一步離心法獲得的卵泡液中cfmtDNA的濃度最高，推測(cè)是其中殘留的細(xì)胞碎屑所致。兩步離心法獲得的卵泡液則為一種幾乎無(wú)細(xì)胞或細(xì)胞碎屑的液體[17]，這種離心方法可取得與過(guò)濾類似的效果，所以更建議用兩步離心法。-80℃冰箱冷凍卵泡液對(duì)cfmtDNA的提取量沒(méi)有影響，表明卵泡液樣本可先放于-80℃冰箱儲(chǔ)存，然后集中進(jìn)行cfmtDNA的提取。這對(duì)于樣本的收集管理以及工作的安排提供了便利。

熒光定量PCR可以通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的變化來(lái)測(cè)定引物的特異性。在本研究中，線粒體的兩對(duì)引物ND1和hmito3用于熒光定量PCR以后，均顯示良好的擴(kuò)增效果，熔解曲線正常，無(wú)引物二聚體和非特異性擴(kuò)增，引物的特異性好，凝膠電泳也證實(shí)目的條帶明顯。ND1為引物所得到的cfmtDNA濃度平均值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于hmito3引物所得的濃度平均值。hmito3引物擴(kuò)增cfmtDNA濃度較低可能推測(cè)與hmito3在mtDNA中獨(dú)特存在有關(guān)。Malik等人[18]研究證實(shí)了hmito3是mtDNA獨(dú)特的短區(qū)域設(shè)計(jì)出來(lái)的引物，其不會(huì)共擴(kuò)增任何核假基因。本研究中相關(guān)性分析結(jié)果顯示ND1引物與hmito3引物良好的相關(guān)性(P<0.000 1)，說(shuō)明hmito3和ND1引物均可用于卵泡液中cfmtDNA的定量分析。

目前，提取cfmtDNA最常用的方法有磁珠法(例如：BeaverBeadsTMCirculating DNA 試劑盒)、硅膠膜離心柱吸附法(例如：TIANamp Genomic DNA試劑盒)等方法。磁珠法充分發(fā)揮了納米與生物技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，利用磁場(chǎng)分離的原理，即磁珠可以特異性的吸附DNA，在外加磁場(chǎng)的作用下，能夠從液體中分離出DNA的方法；優(yōu)點(diǎn)是提取DNA濃度高、純度好，同時(shí)省時(shí)、快速。硅膠模離心柱吸附法是利用一種特殊的硅基質(zhì)膜吸附材料，選擇性的吸附DNA片段，而RNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)被過(guò)濾，最后用洗脫液將DNA片段從濾膜上洗脫下來(lái)的方法；優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)化了核酸的純化過(guò)程、操作簡(jiǎn)便。我們的研究結(jié)果表明，與硅膠膜離心柱吸附法(TIANamp Genomic DNA試劑盒)相比，用磁珠法(BeaverBeadsTMCirculating DNA 試劑盒)可獲得較高濃度的cfmtDNA，快捷簡(jiǎn)便。

綜上所述，在進(jìn)行卵泡液中cfmtDNA的提取時(shí)，可選用兩步離心法來(lái)處理樣本；同時(shí)，可以將處理好的樣本凍于-80℃冰箱，待樣本量合適時(shí)統(tǒng)一處理。比較硅膠膜離心柱吸附法，磁珠法有助于減少提取過(guò)程中的損耗，獲得更多的cfDNA。線粒體編碼的基因ND1和hmito3均可用于cfmtDNA的定量分析，可根據(jù)需要選擇。