李國臻，耿亞松，楊志偉，陶林林，段新崇，王鑫鑫

(邢臺不孕不育?？漆t(yī)院，邢臺生殖與遺傳?？漆t(yī)院，邢臺 054000)

隨著輔助生殖技術(shù)的成熟，胚胎學家逐漸把目光從提高妊娠率轉(zhuǎn)移到減少多胎妊娠率。減少多胎妊娠率最直接有效的辦法就是減少移植胚胎個數(shù)[1]，那么如何在減少移植胚胎個數(shù)的同時保障高的妊娠率呢？多數(shù)研究著眼于胚胎優(yōu)選和改良操作方式保證移植胚胎的優(yōu)質(zhì)化[2-4]。影響ICSI結(jié)局的因素中以卵母細胞質(zhì)量最為重要，因此模擬體內(nèi)環(huán)境以保證卵母細胞培養(yǎng)體系穩(wěn)態(tài)成為各大生殖中心的首選方案[5]。

有研究提出人類IVF實驗室中進行配子及胚胎體外操作容易造成溫度的改變，溫度改變對于卵母細胞紡錘體的損傷是不可逆的，嚴重影響卵母細胞的質(zhì)量[6]。而影響ICSI結(jié)局的因素中以卵母細胞質(zhì)量最為重要，卵母細胞紡錘體對于胞體和環(huán)境微小的改變都非常敏感[7-8]。因此如何在操作中盡可能減少環(huán)境的變化以減少對配子胚胎生長發(fā)育潛能的危險因素，成為胚胎學家最關(guān)心的話題。

本研究主要探討ICSI操作過程中兩個操作皿對妊娠結(jié)局的影響，通過比較實驗組與對照組的正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、種植率、臨床妊娠率等，探究ICSI操作的改進方法是否行之有效，以期獲得更好的妊娠結(jié)局，逐漸減少多胚胎移植增加單胚胎移植比例。

材料與方法

一、研究對象

2016年1月至2017年7月在我中心行ICSI治療，獲卵數(shù)>6枚的363個周期；設(shè)對照組242個周期，在ICSI操作中應(yīng)用一個ICSI操作皿，每次注射5枚卵母細胞，操作皿重復使用；實驗組121個周期，應(yīng)用兩個ICSI操作皿，每注射5枚卵母細胞更換一次ICSI操作皿(若卵母細胞數(shù)小于10枚，每次注射半數(shù)的卵母細胞)，替換下來的ICSI皿置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)復溫，兩個ICSI操作皿交替使用。胚胎培養(yǎng)室為(23±2)℃恒溫和40%～60%恒濕的弱光環(huán)境。

二、卵母細胞準備

1.促排卵及穿刺取卵

促排卵均使用常規(guī)長方案，女方在黃體期肌肉注射促性腺激素釋放激素類似物(GnRHa)(達菲林，Ipsen Pharma Biotech，法國)，達到降調(diào)目的后，給予重組促卵泡β素(普麗康，Merck Sharp & Dohme Limited，英國)或尿促性素(樂寶得，麗珠制藥，珠海)促排卵，定期通過陰道B超監(jiān)測卵泡發(fā)育情況，當1/3卵泡直徑≥1.8 cm時肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(麗珠制藥，珠海)5 000～10 000 U，36.5 h左右B超引導下經(jīng)陰道穿刺取卵，卵冠丘復合體置于37℃、6% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 h。

2.脫顆粒細胞

至少在取卵后1.5 h，用預熱的透明質(zhì)酸酶消化顆粒細胞，消化時間<60 s，用140 μm孔徑剝卵針反復吹打，直至將顆粒細胞完全脫離。

三、精子準備

新鮮精液和凍存精液使用不連續(xù)密度梯度離心法或直接洗滌法，附睪和睪丸精子使用直接洗滌法，處理后計數(shù)精子密度和活率，放入培養(yǎng)箱中備用。

四、ICSI操作

將卵母細胞和精子分別加入到蓋有礦物油(Vitrolife，瑞典)的操作微滴(配子和胚胎處理液，Vitrolife，瑞典)中，應(yīng)用顯微操作系統(tǒng)(Nikon，日本)，用30度角ICSI針(Vitrolife，瑞典)在37℃恒溫下選擇形態(tài)正常、活力好的精子在聚乙烯毗咯烷酮尹汀(polyvinyl pyrrolidone，PVP)(LifeGlobal，美國)中制動并在卵母細胞液滴內(nèi)行穿刺注射。穿刺時使極體的方向處在6～7點或11～12點的位置，在3點鐘的位置注射精子。注射之后的卵母細胞放置在被覆礦物油的約25 μl卵裂培養(yǎng)液微滴(Vitrolife，瑞典)內(nèi)，胚胎發(fā)育第3天轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)使用抽屜式培養(yǎng)箱(Astec，日本)37℃，6% CO2下培養(yǎng)。

1.受精與胚胎觀察

顯微注射授精后16～20 h，倒置顯微鏡(Nikon，日本)下觀察卵細胞有兩個原核(2PN)為正常受精。

2.根據(jù)卵裂球數(shù)、碎片、卵裂球大小均一程度對卵裂期胚胎進行評分，優(yōu)選胚胎原則為：ICSI后68～72 h，6個≤細胞數(shù)≤10個，卵裂球大小均勻，形態(tài)規(guī)則，透明帶完整，碎片<20%；D5或D6，采用Gardner[9]評分法進行囊胚評分，優(yōu)選囊胚原則為：囊胚腔擴張充滿整個胚胎，內(nèi)細胞團細胞密集，滋養(yǎng)層細胞數(shù)目多且均勻。

五、胚胎移植及移植后處理

取卵當日肌肉注射黃體酮注射液(浙江仙琚)進行黃體支持。視HCG注射日E2水平，移植日給予適量雌二醇(補佳樂，拜耳醫(yī)藥，德國)補充。在胚胎發(fā)育第3天或第5天選擇良好胚胎1～3枚移植入子宮，移植當日開始使用黃體酮(安琪坦，博賞醫(yī)藥，法國)口服或陰道上藥進行黃體支持。移植后14 d查血HCG確定生化妊娠，移植后28 d B超檢查，見孕囊確定臨床妊娠。

六、評價指標

正常受精率=正常受精卵數(shù)/成熟卵母細胞數(shù)×100%；卵裂率=正常受精卵裂數(shù)/正常受精卵數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎/正常受精的卵裂胚胎總數(shù)×100%；囊胚形成率=可用囊胚數(shù)/養(yǎng)囊胚胚胎總數(shù)×100%；種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/總移植周期數(shù)×100%。

七、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、基本資料

2016年1月至2017年7月在我中心行ICSI治療的363個周期，分為對照組242個周期，實驗組121個周期。兩組在年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)、基礎(chǔ)FSH水平、基礎(chǔ)AMH、HCG日激素水平、不孕因素、移植日子宮內(nèi)膜厚度等方面無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者基本情況比較[(-±s)，%(n)]

二、胚胎質(zhì)量

實驗組與對照組的正常受精率、卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚胎率之間無顯著性差異(P均>0.05)；實驗組的囊胚形成率顯著高于對照組(P<0.05)(表2)。

三、妊娠結(jié)局

移植周期中實驗組與對照組移植日子宮內(nèi)膜厚度和新鮮移植胚胎個數(shù)無顯著性差異(P均>0.05)；實驗組的新鮮周期移植種植率比對照組高，但差異無顯著性(P>0.05)；實驗組的臨床妊娠率顯著高于對照組(P<0.05)(表 3)。

表2 兩組間胚胎質(zhì)量比較[%(n)]

注：與對照組相比，*P<0.05

表3 兩組間新鮮移植妊娠結(jié)局比較[(-±s)，%(n)]

注：與對照組相比，*P<0.05

討 論

ICSI的操作時間隨著獲卵數(shù)的增加而延長，ICSI操作皿在培養(yǎng)箱外的滯留時間也會延長。雖然多數(shù)IVF實驗室培養(yǎng)箱外的操作主要在含有HEPES/MOPS緩沖體系的培養(yǎng)液中進行，可以有效降低CO2濃度改變帶來的pH值變化，但是操作在培養(yǎng)箱外持續(xù)暴露，很可能會引起ICSI操作微滴物理和化學的不穩(wěn)定性[10]。Bavister等[12]認為紡錘體是卵母細胞的一個重要組成部分，在分裂中起著決定細胞極性的作用。紡錘體結(jié)構(gòu)上或功能上的非生理狀態(tài)會影響細胞分裂期的染色體正常分離和移動，造成細胞分裂錯誤、染色體單倍體和多倍體的形成、非整倍體胚胎產(chǎn)生、受精卵發(fā)育異常和卵裂延遲等[11-12]。人類IVF實驗室中進行配子及胚胎操作可能造成溫度的改變，卵母細胞紡錘體對于胞體和環(huán)境溫度的改變非常敏感[13-14]，并且溫度改變對于卵母細胞紡錘體的損傷是不可逆的，會嚴重影響卵母細胞的質(zhì)量[15-16]，而卵母細胞質(zhì)量是影響ICSI結(jié)局因素中最為重要的因素。因此，溫度的改變成為影響配子胚胎生長發(fā)育潛能的關(guān)鍵因素。在本研究中使用兩個ICSI皿，通過交替使用的方法平衡和穩(wěn)定操作皿，減弱因培養(yǎng)箱外操作時間過長引起培養(yǎng)體系的改變。結(jié)果顯示ICSI操作中使用兩個操作皿可以顯著提高囊胚形成率。推測兩個ICSI操作皿的交替平衡使用可能可以通過穩(wěn)定操作微滴的溫度從而減弱因ICSI操作皿中暴露時間過長產(chǎn)生的胚胎發(fā)育潛能的危害。

綜上所述，本研究通過在ICSI操作中增加操作皿的方法顯著提高了囊胚形成率和ICSI新鮮移植周期的臨床妊娠率。我們推測培養(yǎng)箱外操作時間過長可能會引起培養(yǎng)體系溫度的改變，溫度通過影響pH值間接和直接導致卵母細胞紡錘體形成和解聚紊亂可能是影響囊胚形成和ICSI周期臨床妊娠率的原因。因此，ICSI操作中通過使用兩個操作皿可能可以減弱環(huán)境的不穩(wěn)定因素對于胚胎發(fā)育潛能的危害[18-20]，從而可以獲得更好的妊娠結(jié)局。