傅龍龍，周芳，安琪，張開(kāi)舒，童越，許劍鋒，王曉尉，郭穎，李鴻，袁冬，盧文紅，梁小薇，谷翊群

(1.國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所 國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委男性生殖健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 男性臨床研究室/北京人類(lèi)精子庫(kù)，北京 100081；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；3.青島大學(xué)附屬醫(yī)院生殖中心，青島 266000)

線(xiàn)粒體是精子內(nèi)除細(xì)胞核以外，唯一攜帶遺傳物質(zhì)的細(xì)胞器；與細(xì)胞核的遺傳系統(tǒng)構(gòu)成了一個(gè)整體。線(xiàn)粒體DNA(mitochondrion DNA，mtDNA)是一條雙鏈環(huán)狀的DNA，共含有16 569個(gè)堿基對(duì)，有自己的遺傳系統(tǒng)和自己的蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)，且部分遺傳密碼與核密碼有不同的編碼含義。人類(lèi)線(xiàn)粒體基因組共編碼了37個(gè)基因，編碼13 種蛋白質(zhì)，22種tRNA和2種rRNA[1]。這13種蛋白質(zhì)與核DNA編碼蛋白參與線(xiàn)粒體氧化磷酸化，是機(jī)體提供能量和物質(zhì)代謝的重要基礎(chǔ)。隨著mtDNA研究的不斷深入，mtDNA成為衡量線(xiàn)粒體功能的重要生物標(biāo)記物[2]；研究者在異常精液中發(fā)現(xiàn)mtDNA突變與缺失[3-5]與男性不育、精液質(zhì)量下降等生殖相關(guān)疾病密切相關(guān)。

精液冷凍是輔助生殖技術(shù)發(fā)展的重要保障：為中重度少弱精子癥男性進(jìn)行精液凍存，用于后期輔助生殖；凍存志愿者精液，為男方無(wú)精子癥夫婦提供精子；為放化療前腫瘤患者、輸精管絕育術(shù)前患者、移植患者等進(jìn)行自體精液保存，保存生育力[6]。精子冷凍損傷是精子冷凍和復(fù)蘇過(guò)程中，由于滲透壓改變、細(xì)胞內(nèi)外冰晶形成、冷凍保護(hù)劑的毒性等因素，不可避免的都會(huì)發(fā)生一些物理和化學(xué)損傷。冷凍復(fù)蘇過(guò)程會(huì)降低精子質(zhì)量[7-8]：活力下降、受孕率減少，頂體完整性降低，精子線(xiàn)粒體膜電位降低。冷凍損傷是否會(huì)引起mtDNA水平的破壞，從而降低精子相關(guān)功能？本研究觀察冷凍保存前后人精子線(xiàn)粒體mtDNA拷貝數(shù)和完整性的變化。

資料與方法

一、研究對(duì)象和分組

1.精液樣本收集：本研究得到國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所倫理委員會(huì)通過(guò)，所有志愿者簽署知情同意書(shū)。標(biāo)本來(lái)源于北京人類(lèi)精子庫(kù)捐精志愿者，禁欲5～7 d后，手淫法取精留存于消毒干燥取精杯中，置于37℃水浴完全液化后，按照世界衛(wèi)生組織操作指導(dǎo)規(guī)范分析精液。選取符合捐精條件的正式志愿者為研究對(duì)象：精子濃度>60×106/ml，前向運(yùn)動(dòng)精子(PR)百分比>60%，PR復(fù)蘇率>60%。

2.精液分組：收集研究對(duì)象精液，待精液完全液化后，每份精液樣品分為2份：1份進(jìn)行精液冷凍復(fù)蘇處理，納入實(shí)驗(yàn)組；1份為新鮮精液，納入研究對(duì)照組。

二、研究方法

除特殊說(shuō)明，本實(shí)驗(yàn)采用的相關(guān)試劑均來(lái)自于美國(guó)Sigma公司。

1.精液冷凍及復(fù)蘇：本研究中，實(shí)驗(yàn)組采用北京精子庫(kù)精液操作流程進(jìn)行精液冷凍復(fù)蘇[9]：1份體積甘油-卵黃-檸檬酸鹽(自制)冷凍保護(hù)劑逐滴加入到2份體積精液中，充分混勻裝入冷凍管，在30～35℃孵育10 min。將冷凍管放入程控冷凍儀中(Planner，英國(guó))，進(jìn)行冷凍降溫。精液于液氮保存2周后復(fù)蘇：37℃水浴快速?gòu)?fù)溫5～10 min。對(duì)實(shí)驗(yàn)組和研究對(duì)照組精子均進(jìn)行精子活力、mtDNA拷貝數(shù)和完整性檢測(cè)。

2.Markler計(jì)數(shù)板聯(lián)合CASA法評(píng)估精子活力：采用Makler板(Sefi Instruments，以色列)，在400倍光學(xué)顯微鏡下最少計(jì)數(shù)200個(gè)精子。計(jì)數(shù)精子總數(shù)和PR精子數(shù)，計(jì)算精子濃度和PR百分比。并采用計(jì)算機(jī)輔助精子動(dòng)態(tài)圖像檢測(cè)系統(tǒng)CASA(IVOS，Hamilton Thorn Research，美國(guó))分析運(yùn)動(dòng)參數(shù)：平均路徑速率(Average path velocity，VAP)、直線(xiàn)速率(Straight-line velocity，VSL)和曲線(xiàn)速率(Curvilinear velocity，VCL)。

3.精子總DNA提?。撼浞只靹蚓汉螅鶕?jù)每份標(biāo)本收集精子數(shù)為20×106個(gè)的標(biāo)準(zhǔn)，取相應(yīng)體積的精液。將所取精液，與PBS液以體積比1∶2的比例進(jìn)行混勻，1 000 g離心5 min，小心吸取并丟棄上清液。再加入1 ml PBS液，輕柔吹打，重懸精子后，1 000 g離心5 min，并重復(fù)兩次。留取精子沉淀團(tuán)，使用DNA提取試劑盒(北京天根生化)提取精子基因組DNA，稀釋至10 ng/μl，-80°凍存?zhèn)溆谩?/p>

4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)mtDNA拷貝數(shù)：選取mtDNA編碼的16SrRNA為目的基因[10]，以核編碼β-actin為內(nèi)參基因，半定量檢測(cè)mtDNA拷貝數(shù)。兩基因引物由Invitrogen(上海)公司合成，引物序列詳見(jiàn)表1。使用ABI PRISM 7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，美國(guó))進(jìn)行擴(kuò)增，獲得各樣品所擴(kuò)展基因的CT值、擴(kuò)增曲線(xiàn)和溶解曲線(xiàn)。擴(kuò)展反應(yīng)體系為20 μl：2×UltraSYBR Mixture(With ROX)(北京康為世紀(jì))10 μl、上游引物(10 μmol/L)0.4 μl、下游引物(10 μmol/L)0.4 μl、DNA模板2 μl。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃10 min，(95℃15 s，60℃ 60 s)×45個(gè)循環(huán)。同時(shí)在60～95℃進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析，根據(jù)溶解曲線(xiàn)圖，評(píng)價(jià)引物特異性。采用基因的CT值，對(duì)mtDNA 拷貝數(shù)進(jìn)行相對(duì)定量[9]：mtDNA拷貝數(shù)=2-△ct，其中△ct=CT16srRNA-CTβ-actin。

表1 引物序列

5.長(zhǎng)鏈PCR方法檢測(cè)精子mtDNA完整性：采用長(zhǎng)鏈PCR方法擴(kuò)增mtDNA 8 700 bp片段。引物由Invitrogen(上海)公司合成，詳見(jiàn)表1。使用A100 PCR儀擴(kuò)增，反應(yīng)體系20 μl：2×Es Taq MasterMix(Dye)10 μl、上游引物(10 μmol/L)0.4 μl、下游引物(10 μmol/L)0.4 μl、DNA模板(10 ng/μl)2 μl，加入滅菌蒸餾水至20 μl。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 5 min，(95℃ 30 s，62℃ 60 s，72℃ 1 min)×30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。以8 700 bp片段產(chǎn)物評(píng)價(jià)精子mtDNA的完整性；采用Quantity One v.4.6.2軟件讀取8 700 bp條帶電泳強(qiáng)度值。為了消除mtDNA數(shù)量的影響，將長(zhǎng)鏈PCR擴(kuò)增后的8 700 bp條帶的電泳強(qiáng)度值與相對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理：電泳強(qiáng)度值/mtDNA拷貝數(shù)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般資料

共納入22例符合北京人類(lèi)精子庫(kù)捐精條件的正式志愿者。納入志愿者年齡為(27.8±3.0)歲，禁欲天數(shù)(6.1±0.9)d。志愿者精液體積為(5.0±1.5)ml，精子濃度(75.8±15.8)×106/ml，前向運(yùn)動(dòng)精子百分比為(68±6)%。采用北京精子庫(kù)精液操作流程進(jìn)行精液冷凍，22名志愿者總活動(dòng)精子復(fù)蘇率為(72±8)%。

二、冷凍保存對(duì)人精子的影響

1.冷凍保存對(duì)精子活力影響：冷凍復(fù)蘇后前向運(yùn)動(dòng)精子百分比顯著降低(P<0.05)；冷凍保存后精子活力明顯降低，VSL、VCL和VAP均顯著低于新鮮精液組(P<0.05)(表2)。

2.冷凍保存對(duì)人精子mtDNA拷貝數(shù)的影響：按照mtDNA拷貝數(shù)=2-△ct，△ct= CT16srRNA-CTβ-actin，計(jì)算各樣本mtDNA拷貝數(shù)。新鮮精液組精子mtDNA拷貝數(shù)為(5.66±5.53)，冷凍復(fù)蘇組精子mtDNA拷貝數(shù)為(10.12±8.41)，配對(duì)樣本t檢驗(yàn)顯示冷凍復(fù)蘇組精子mtDNA拷貝數(shù)較新鮮精液精子顯著增加(P<0.05)。

表2 冷凍保存對(duì)精子活力及運(yùn)動(dòng)參數(shù)量影響

注：與新鮮對(duì)照組相比，*P<0.05

3.冷凍保存對(duì)人精子mtDNA完整性的影響：以8 700 bp條帶擴(kuò)展相對(duì)強(qiáng)度值計(jì)算mtDNA完整性，冷凍復(fù)蘇后精子組與新鮮精液精子組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[(29.69±15.04)vs.(32.78±16.0)，P=0.077]，暫不認(rèn)為冷凍復(fù)蘇會(huì)降低精子mtDNA的完整性。

討 論

精子冷凍保存技術(shù)發(fā)展至今，已有幾十年的歷史，其在輔助生殖技術(shù)中起到了至關(guān)重要的作用，且到目前為止，精液冷凍也是目前唯一有效的男性生育力保存的方式。隨著冷凍方法和冷凍保護(hù)劑的不斷改良，精子的存活率有了一定提高，但對(duì)精子功能等仍然會(huì)造成了一些不可逆轉(zhuǎn)的影響。本研究結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)，精液冷凍明顯降低精子活力、減少RP百分率、降低精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)。但活力和形態(tài)的改變，很難全面評(píng)估冷凍復(fù)蘇后的精子質(zhì)量；因此尋求多指標(biāo)評(píng)價(jià)精子質(zhì)量，篩選優(yōu)質(zhì)精子進(jìn)行后期輔助生殖尤為重要。

凍融后精子遺傳物質(zhì)的改變一直受到相關(guān)領(lǐng)域研究者的關(guān)注[11]。我們團(tuán)隊(duì)早期研究發(fā)現(xiàn)精子冷凍會(huì)增加核DNA碎片[12]，此后在越來(lái)越多的證據(jù)得到相類(lèi)似結(jié)果[13]。我們對(duì)冷凍損傷對(duì)人精子DNA甲基化相關(guān)影響也進(jìn)行相關(guān)探索[9]。

mtDNA是核DNA以外的遺傳物質(zhì)，mtDNA拷貝數(shù)和完整性是評(píng)價(jià)精子功能的重要指標(biāo)之一。mtDNA拷貝數(shù)與常規(guī)精液參數(shù)如精子濃度、精子總數(shù)、精子活率及正常形態(tài)精子率呈負(fù)相關(guān)[4-5，14]；它對(duì)成功受精和胚胎形成具有極大的重要性，與胚胎發(fā)育密切相關(guān)[15]。mtDNA完整性也與精子質(zhì)量相關(guān)[3-5]：精液質(zhì)量越高，mtDNA完整性越好；精液質(zhì)量越差，mtDNA完整性越差。冷凍技術(shù)是否會(huì)對(duì)精子mtDNA的完整性和拷貝數(shù)產(chǎn)生影響，鮮有報(bào)道。

本研究初步探討了冷凍保存對(duì)于人類(lèi)線(xiàn)粒體DNA完整性和拷貝數(shù)的影響，采用qPCR和長(zhǎng)鏈PCR技術(shù)分別檢測(cè)冷凍前后精子mtDNA的拷貝數(shù)和完整性，以進(jìn)一步研究冷凍損傷導(dǎo)致精子功能降低的相關(guān)因素。不同的實(shí)驗(yàn)方法，所測(cè)的結(jié)果存在差異[16]。本實(shí)驗(yàn)采用的qPCR不僅可以半定量，而且特異度高，可以排除假基因的干擾；且相比于二次測(cè)序技術(shù)[17]操作簡(jiǎn)單，對(duì)樣本制備和數(shù)據(jù)處理的要求較低，易于大量使用和推廣。本實(shí)驗(yàn)中22例合格供精志愿者新鮮精液mtDNA拷貝數(shù)及完整性檢測(cè)結(jié)果，與Zhang等[5]研究結(jié)果相近。精子冷凍復(fù)蘇后mtDNA拷貝數(shù)增加，這與卵母細(xì)胞冷凍相關(guān)研究相一致[18-19]。本研究通過(guò)長(zhǎng)鏈PCR測(cè)量mtDNA完整性，并在每個(gè)精子樣品中用mtDNA拷貝數(shù)歸一化，進(jìn)行量化比較。但目前結(jié)果暫未發(fā)現(xiàn)凍融后精子mtDNA完整性發(fā)現(xiàn)明顯變化。國(guó)內(nèi)蔡學(xué)泳等[20]關(guān)于冷凍保存對(duì)人類(lèi)卵母細(xì)胞線(xiàn)粒體DNA缺失的研究也發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞mtDNA缺失率和mtDNA拷貝數(shù)在冷凍處理前后均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。不同于核DNA的穩(wěn)固，mtDNA多以拷貝的形式存在于線(xiàn)粒體中，且沒(méi)有組蛋白的保護(hù)，線(xiàn)粒體DNA修復(fù)的途徑也并不完善；因此，線(xiàn)粒體中的氧化損傷比細(xì)胞核中的氧化損傷高，mtDNA所累積的突變是細(xì)胞核基因組的10～50倍[21]。

目前研究認(rèn)為冷凍復(fù)蘇過(guò)程中，精子內(nèi)氧自由基和抗氧化劑防御體系平衡的喪失，過(guò)量的ROS產(chǎn)生，是引起精子冷凍損傷的重要因素。不同于其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)，成熟精子胞質(zhì)少，且線(xiàn)粒體集中分布于精子中段，所以精子抗氧化能力減弱且缺乏修復(fù)能力，極易受到ROS損傷[22]。相關(guān)臨床研究也顯示[23]：ROS會(huì)引起精子功能降低與男性不育、女性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、兒童先天畸形等生殖相關(guān)疾病，存在密切相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，在捐精合格志愿者人群中，冷凍過(guò)程會(huì)增加mtDNA拷貝數(shù)，但對(duì)mtDNA完整性的影響不大?？赡艿脑蚴荹20，24]：ROS刺激引起線(xiàn)粒體呼吸鏈功能受損，ATP合成受到抑制，為了彌補(bǔ)損傷后的功能缺陷，拷貝數(shù)代償性增加；但目前冷凍過(guò)程中ROS的蓄積，尚未引起mtDNA完整性的改變。

我們研究了現(xiàn)有冷凍復(fù)蘇技術(shù)對(duì)精子mtDNA拷貝數(shù)和完整性的影響，但受到條件限制，本實(shí)驗(yàn)凍存時(shí)間尚未達(dá)到臨床保存所需時(shí)間要求。后期需要進(jìn)一步擴(kuò)大研究人群、增加樣本量、延長(zhǎng)冷凍及納入精子參數(shù)相關(guān)性研究，為精子冷凍損傷的機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。