張亞楠 林亞秋 許晴 徐亞歐 賀慶華

（西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041）

藏雞是分布在我國青藏高原地區(qū)的一種蛋肉兼用的原始地方雞種，在四川的甘孜、阿壩等藏民聚居區(qū)也有少量分布［1］。藏雞具有肉質鮮美，氨基酸含量高及必需氨基酸比例大等特點［2］，是一種良好的遺傳資源。因此，對藏雞的肉質進行研究特別是對藏雞肉質性狀的遺傳性狀的研究具有重要的作用。影響動物肉質的因素有很多，其中肌內脂肪對動物的肉質具有重要的作用，而遺傳因素是調控影響動物肌內脂肪沉積的重要方面［3］。

IRX3（iroquoishomeobox 3）是屬于IRX家族基因的轉錄因子，其家族最早在果蠅的神經系統(tǒng)發(fā)育的研究中發(fā)現(xiàn)，其參與中樞神經系統(tǒng)［4］、微血管系統(tǒng)［5］、腎［6］和心臟［7］等系統(tǒng)和組織的的形態(tài)和發(fā)育。其在胚胎早起的系統(tǒng)器官發(fā)育、干細胞的更新分化、脂質代謝和能量平衡等方面均有重要的影響，與機體的發(fā)育和新陳代謝密切相關［8］。以前的研究證實了肥胖相關基因（Fat mass and obesity associated，F(xiàn)TO）與人下丘腦調控食物攝入及能量平衡有關，而FTOSNP的功能性遠距離靶標IRX3基因對機體質量和成分具有重要影響［9-10］。研究發(fā)現(xiàn)IRX3具有促進人白色脂肪組織褐變的能力［11］。同時也有研究表明脂肪細胞的功能與IRX3和IRX5的表達調控有關，可將其棕色脂肪細胞轉變?yōu)榘咨炯毎麖亩鴥Υ婺芰浚?2-13］。與正常小鼠相比，IRX3基因敲除小鼠體重顯著下降，且棕色脂肪組織的活化和能量消耗的增加［8］；超表達IRX3能抑制人類脂肪細胞的產熱［14］。以上研究均說明IRX3在脂代謝中具有重要作用，但尚未發(fā)現(xiàn)IRX3基因在藏雞中的作用報道，且在脂質代謝中的作用機制尚不明確。因此，本實驗擬闡明藏雞IRX3基因的組織表達特性，及其在肌肉組織中的表達水平與肌內脂肪沉積的關聯(lián)，旨在為進一步研究該基因在藏雞脂代謝和脂肪沉積中的作用提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗樣品采集 本研究動物來源于成都益生康健農業(yè)有限公司藏雞養(yǎng)殖基地孵化1、81、119、154和210日齡的健康藏雞（公母各8只，共80只）為實驗對象。禁食12 h后于第2天清晨放血屠宰，進而采集其去除結締組織的右側胸肌和腿肌組織樣品，裝于樣品袋中于-20℃保存用于測定肌內脂肪含量。同時采集154日齡的心、肝、脾、肺、腎、皮下脂肪、胸肌和腿肌等組織樣品（公母各4只），用錫箔紙包裹DEPC水清洗后的組織樣品，并置于無RNA酶的凍存管中，于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 Trizol試劑、熒光定量試劑盒SYBR Premix ExTaqTM（2×）購自TaKaRa公司（美國），反轉錄試劑盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit）購自Thermo公司（美國）。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 根據(jù)克隆測序獲得的IRX3基因序列和3-磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因設計特異引物。

1.2.2 反轉錄 利用Trizol法提取154日齡藏雞（公母各4只）的心、肝、脾、肺、腎、皮下脂肪、胸肌和腿肌組織及1、81、119、154和210 d藏雞（公母各8只）的胸肌和腿肌的總RNA，并合成cDNA。

1.2.3 反應體系和反應條件 20 μL反應體系：SYBR Premix Ex TaqTM（2×）10 μL，cDNA 1 μL，10 μmol/L 上、下游引物各 1 μL，RNase Freed H2O 7μL。PCR反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性10 s，66℃退火20 s，72℃延伸30 s，39個循環(huán)。

1.2.4 藏雞IRX3基因組織表達分析 利用實時熒光定量PCR技術檢測IRX3在公母藏雞心、肝、脾、肺、腎、胸肌、腿肌和脂肪組織中的相對表達情況，PCR反應體系和反應條件同1.2.3，每個待測樣本設2個重復。用2-ΔΔCt法計算熒光定量結果。

1.2.5 藏雞IRX3基因時序表達分析 利用實時熒光定量PCR檢測IRX3在公母藏雞不同日齡（0 d、81 d、119 d、154 d及210 d）胸肌與腿肌中的相對表達情況。PCR反應體系和反應條件同1.2.3，每個階段每個組織設2個重復。用2-ΔΔCt法計算熒光定量結果。

1.2.6 肌內脂肪含量的測定 利用索氏抽提法測定公母藏雞不同日齡（81 d、119 d、154 d及210 d）胸肌與腿肌肌內脂肪含量。

1.2.7 統(tǒng)計方法 數(shù)據(jù)結果均以“x-±s”表示。采用SPSS 18.0進行單因素方差分析和相關分析。

2 結果

2.1 藏雞IRX3基因組織表達分析

藏雞IRX3基因的組織表達結果（圖1）顯示IRX3基因在公藏雞肺組織中表達水平最高，顯著高于脂肪組織（P＜0.05），極顯著高于其他組織（P＜0.01）；其次在肝中表達水平較高，與脂肪組織差異不顯著（P＞0.05），極顯著高于其他組織（P＜0.01）。在母藏雞中，肺組織中表達水平也最高，極顯著高于其他組織（P＜0.01）；其次在脾和脂肪中表達水平較高，顯著高于其他組織（P＜0.05）。

圖1 IRX3 mRNA在藏雞不同組織中的相對表達水平

2.2 藏雞IRX3基因時序表達分析

藏雞IRX3基因的時序表達結果（圖2）顯示，隨著日齡的增加，公藏雞不同肌肉組織中IRX3mRNA表達水平均呈逐漸增加的趨勢，其210日齡相對表達水平較高，極顯著高于與其他日齡（P＜0.01）。而母藏雞腿肌中表達水平則呈先升后降的趨勢，但其相對表達差異不顯著（P＞0.05）；在胸肌中相對表達量則相反，1日齡相對表達水平較高，極顯著高于其他日齡（P＜0.01）。

圖2 IRX3 mRNA在藏雞不同發(fā)育階段肌肉組織中的相對表達水平

2.3 藏雞IRX3基因時序表達與肌內脂肪含量的關系

根據(jù)測定的肌內脂肪含量數(shù)據(jù)（81、119、154和210日齡的公母藏雞各8只）與本實驗所得公母藏雞IRX3基因的時序表達結果，對不同發(fā)育階段公母藏雞不同肌肉組織中IRX3mRNA表達水平與其肌內脂肪含量進行相關分析。藏雞不同肌肉部位肌內脂肪含量結果（圖3）表明，210日齡不同肌肉組織肌內脂肪含量均極顯著高于其他日齡（P＜0.01）。

藏雞不同肌肉部位IRX3基因時序表達與其肌內脂肪含量相關性結果（表1）表明，不同發(fā)育階段的藏雞肌肉組織中IRX3mRNA表達水平與其IMF含量呈不同相關性，在藏雞腿肌中均呈正相關，而在公雞中呈高度正相關，其相關性為r=0.671（P＜0.01）；在藏雞胸肌中則與性別有關，在公雞中呈正相關，其相關性為r=0.119（P＞0.05），而在母雞中則呈顯著負相關，其相關性為r=-0.428（P＜0.01）。

圖3 藏雞腿肌和胸肌內脂肪含量的發(fā)育性變化

表1 藏雞IRX3 mRNA表達水平與IMF含量的相關性分析

3 討論

為了滿足人們對物質營養(yǎng)的追求，提高肉的品質是科研人員關注和研究的重點。有研究發(fā)現(xiàn)，肉的品質與肌內脂肪含量呈正相關，且肌內脂肪含量決定著肉的嫩度［15］。因此，研究肌內脂肪對提高肉質品質具有重要的作用。而隨著對肌內脂肪的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)脂肪的大量攝入不僅會導致肥胖，而且還會引發(fā)機體脂質代謝異常，進而導致某些疾病。隨著對IRX3基因研究深入，發(fā)現(xiàn)IRX3基因與機體的脂質代謝具有密切的聯(lián)系，但在藏雞的研究中尚未發(fā)現(xiàn)報道。因此，為了闡明IRX3在藏雞中表達模式與藏雞肌內脂肪的沉積關系，本研究利用熒光定量PCR檢測IRX3在藏雞不同組織和不同發(fā)育階段肌肉組織中的表達水平，并分析其與肌內脂肪含量的相關，為深入研究其與藏雞脂肪代謝的作用機制提供依據(jù)。

本實驗發(fā)現(xiàn)IRX3基因在藏雞各組織中均有表達，且在公母藏雞肺組織中表達水平最高。IRX3基因在公藏雞肝中表達水平較高，脂肪中較低，而在母藏雞肝中則相對較低，脂肪中較高，推測IRX3基因組織表達存在性別差異。Houwelin和Van等［16-17］指出IRX3在小鼠心和肺中呈高表達，在脊髓、腎臟中也有表達。樊紅櫻等［18］發(fā)現(xiàn)，IRX3在呼倫貝爾羊尾部脂肪組織中的表達模式無性別差異，但是由于不同性別間脂肪組織分布不同，導致其在深層脂肪和淺層脂肪的表達模式存在差異，說明IRX3在不同物種中的表達模式存在差異。研究發(fā)現(xiàn)，肌內脂肪與動物生長日齡呈正相關，隨著日齡的增加，肌內脂肪也在不斷沉積，且不同組織中肌內脂肪含量差異顯著［19-20］，這與本實驗結果相似。本研究的時序表達結果說明IRX3在不同性別藏雞在同一肌肉組織中的表達模式存在性別差異，而且同性別藏雞在不同肌肉組織中的表達模式存在差異。聶曉慶等［21］發(fā)現(xiàn)PID1基因在藏雞不同肌肉組織中表達存在年齡及性別差異，林森等［22］發(fā)現(xiàn)FTO基因在藏雞胸肌和腿肌中具有不同表達模式，這與本實驗結果相似，提示藏雞不同肌肉組織的發(fā)育機制可能存在差別。本實驗對藏雞不同組織和不同發(fā)育階段肌肉組織中的IRX3基因表達水平及其肌內脂肪含量進行相關性分析，結果顯示，不同性別不同年齡段的藏雞IRX3mRNA及肌內脂肪含量呈不同的相關性，存在性別差異。藏雞由于其生長環(huán)境的特殊性，與其他品種在相關性及能量代謝方面存在差異。同時IRX3基因在公母藏雞不同肌肉組織不同發(fā)育階段中差異性表達，進而在不同肌肉組織中，不同性別藏雞IRX3mRNA表達水平與IMF含量呈不同相關性。但要深入了解IRX3在藏雞脂肪沉積中的功能，則需要在細胞水平進行進一步研究。

4 結論

本研究表明IRX3基因在藏雞各組織中均有表達，其在藏雞肺組織中表達水平最高。IRX3mRNA在藏雞不同發(fā)育階段不同肌肉組織中具有不同程度的表達模式，且存在性別差異。不同性別不同年齡段的藏雞IRX3mRNA與肌內脂肪含量呈不同相關性，存在性別差異。