羅國(guó)聰 黃蘊(yùn)怡 柴慧子 雷曉凌 聶芳紅

（1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，湛江 524088；2. 暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣州 510632）

由于海洋高鹽、高壓、低溫、寡營(yíng)養(yǎng)等特殊生境，使得海洋微生物可產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的生物活性物質(zhì)，包括抗腫瘤、抗炎癥、抗菌、抗寄生蟲等化合物，海洋微生物已經(jīng)成為新型藥物開發(fā)的重要來源。尤其是海洋動(dòng)植物共附生微生物，積極地參與動(dòng)植物的代謝活動(dòng)，在動(dòng)植物的抗感染、抗吞噬的生態(tài)防衛(wèi)中起了重要的作用［1］。而就近幾年已報(bào)導(dǎo)的數(shù)據(jù)來看，從海洋微生物中發(fā)現(xiàn)的新活性物質(zhì)中，有60% 以上來自于海洋真菌［2-3］。海鞘是脊索動(dòng)物、尾索動(dòng)物亞門、海鞘綱的尾索動(dòng)物，是海洋污損生物之一，我國(guó)目前已記錄的海鞘種類有66 種［4］。近年來，從海鞘中發(fā)現(xiàn)了生物堿、環(huán)肽、神經(jīng)酰胺、萜類、甾體等活性物質(zhì)，且含量相對(duì)較高，具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌等顯著的生物活性，引起了許多研究人員的高度重視［5］，人們開始關(guān)注這些活性的物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并對(duì)海鞘共附生真菌展開抗菌活性的研究。

對(duì)于真菌來說，其形態(tài)特征是一種重要的分類依據(jù)，主要根據(jù)菌落、分生孢子梗、孢子及其發(fā)育時(shí)的形態(tài)特征來進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，依據(jù)鑒定結(jié)果進(jìn)行分類［6］。本研究選擇湛江雷州的海鞘作為研究原料，從中分離純化出海鞘共附生真菌，對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)的初步鑒定以及抗菌活性的篩選；篩選出抗菌活性較強(qiáng)且抗菌譜較廣的菌株，結(jié)合對(duì)海鞘中真菌多樣性的分析確定優(yōu)選的種屬，旨在為開發(fā)海洋真菌代謝產(chǎn)物的資源以及海洋藥物的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 海鞘樣品于2014年3月采自廣東省雷州市流沙蝦塘。

1.1.2 抗菌活性試驗(yàn)指示菌 細(xì)菌指示菌：銅綠假單胞菌（Pseudomons aeruginosa），藤黃八疊球菌（Sarcina lutea），金黃色葡萄桿菌（Staphylococcus aureus）。腐敗菌 ：假單胞菌屬（Pseudomonassp.），庫(kù)特氏菌屬（Kurthia gibsonii strainsp.），金黃桿菌屬（Chryseobacteriumsp.）。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，淀粉培養(yǎng)基，真菌發(fā)酵培養(yǎng)基［7］用鹽度為3%的人工海水進(jìn)行配置。營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA），瓊脂培養(yǎng)基用蒸餾水配置。

1.1.4 試劑及儀器 乙酸乙酯、甲醇、氯化鈉購(gòu)自廣州華大化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；YS100雙目生物顯微鏡（日本尼康公司）；722型紫外可見分光光度計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 海鞘共附生真菌的分離［8-9］采用平板涂布法，在無菌環(huán)境下先用無菌水洗去除海鞘表面的泥沙，再分別取海鞘的外殼、內(nèi)臟，用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)后，放入無菌水中，震蕩混勻，吸取上述勻漿液制成梯度稀釋液。吸取稀釋液到PDA培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基平板上，用涂布棒將其均勻涂布，于28℃培養(yǎng)4-5 d。發(fā)現(xiàn)有新的菌絲或菌落長(zhǎng)出后立即轉(zhuǎn)接，分別統(tǒng)計(jì)在PDA培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基中分離出來的真菌種類及數(shù)量。

1.2.2 海鞘共附生真菌的形態(tài)鑒定 菌株采用點(diǎn)植法接種，即用接種針沾取少量孢子點(diǎn)植在平板上中心，于28℃培養(yǎng)3-5 d，每隔1 d觀察其菌落表面大小、質(zhì)地、高度、顏色等菌落特征，借助顯微鏡觀察菌株的個(gè)體形態(tài)，包括是否產(chǎn)孢、孢子等的大小、規(guī)則及顏色等，結(jié)合真菌鑒定手冊(cè)等對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)鑒定［10-14］。

1.2.3 海鞘共附生真菌抗菌活性的篩選 （1）海鞘共附生真菌發(fā)酵液粗提物的制備：按40%的裝液量在500 mL錐形瓶中加入真菌發(fā)酵培養(yǎng)液，挑取三環(huán)菌種接種到培養(yǎng)液中，28℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)7 d后，經(jīng)過真空抽濾得發(fā)酵液與干菌體。取200 mL發(fā)酵液用乙酸乙酯等體積萃取3 次，合并萃取液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮，蒸干萃取液中的有機(jī)溶劑，用甲醇清洗旋蒸瓶，將提取物溶解于10mL的甲醇中，即為乙酸乙酯粗提液供試樣品。（2）指示菌菌懸液的制備：將保存的指示菌接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面37℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)3次后，用接種環(huán)刮取適量的菌體于生理鹽水中，振蕩1 min直至菌體均勻分布，測(cè)量OD值，并根據(jù)OD值將指示菌濃度調(diào)整至細(xì)菌數(shù)約為106CFU/mL。

1.2.4 海鞘共附生真菌抑菌活性測(cè)定 采用雙層平板法［15］，首先在無菌平板上鋪一層素瓊脂，放置無菌牛津杯，然后采用稀釋倒平板法制備含菌平板，待平板凝固后將牛津杯取出，分別將乙酸乙酯粗提液供試樣品150 μL加入到牛津杯中。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并設(shè)陰性對(duì)照（不加粗提物）。將加好粗體液的含菌平板置于冰箱中擴(kuò)散3 h后放置于37℃恒溫培養(yǎng)。24 h后觀察抑菌圈的透明程度和邊緣整齊程度，測(cè)量并記錄抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 海鞘共附生真菌的分離純化

經(jīng)分離純化排重后，從海鞘中共分離出14株菌，其中12株分離自PDA培養(yǎng)基，2株分離自淀粉培養(yǎng)基，分別占總菌株分離率的85.7%、14.3%。這說明PDA培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分比淀粉培養(yǎng)基更適合于海鞘共附生真菌的生長(zhǎng)繁殖。

2.2 海鞘共附生真菌的形態(tài)鑒定

從海鞘中所分離的14株菌株的菌落形態(tài)、個(gè)體形態(tài)菌落見圖1，個(gè)體形態(tài)的特征描述見表1。根據(jù)真菌鑒定手冊(cè)對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)的初步鑒定，以上的鑒定結(jié)果顯示，所分離出的14 株真菌分屬4 個(gè)屬，分別為青霉屬、曲霉屬、枝孢屬和麥軸梗霉屬。以青霉屬和曲霉屬居多，其中青霉屬為第一優(yōu)勢(shì)種群，青霉屬的菌株占總分離出的菌株的比例為64.3%，曲霉屬為第二優(yōu)勢(shì)種群，占總分離出的菌株21.4%。說明從海鞘中分離出的真菌以青霉屬和曲霉屬為主。另外，麥軸梗霉屬在海洋真菌中的報(bào)道出現(xiàn)較少，說明海鞘真菌中多樣性較豐富。

圖1 14株海鞘真菌形態(tài)鑒定

2.3 海鞘共附生真菌抗菌活性篩選

海鞘共附生真菌乙酸乙酯粗提物抗菌活性，如表2和圖2所示。從表2中可以看出，在這14 株真菌中，至少有11 個(gè)菌株對(duì)一種以上的指示菌有一定的抗菌活性。其中有4 株真菌對(duì)6 種指示菌都有抗菌活性，分別為Asc-2-4、Asc-2-12、Asc-1-1和Asc-2-1，這4株菌的抗菌活性較強(qiáng)且抗菌譜較廣。比較這4株菌的抑菌能力發(fā)現(xiàn)，菌株Asc-2-12的乙酸乙酯粗提物的平均抑菌圈直徑最大，均大于21.00 mm，其對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌圈直徑最大達(dá)到21.91 mm，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑最大達(dá)到21.37 mm，對(duì)SL1 的抑菌圈直徑最大達(dá)到23.13 mm，對(duì)SL2 的抑菌圈直徑最大達(dá)到23.94 mm。

3 討論

海鞘獨(dú)特的攝食習(xí)性使其富集大量的共附生微生物［16］，而海洋真菌能夠耐受海洋中的特殊生境如高鹽、高壓、低氧、低光照等，形成能夠產(chǎn)生獨(dú)特次級(jí)代謝產(chǎn)物的生理特性［17］。本研究以海鞘為原料，從中分離純化出海鞘共附生真菌并以其為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)的鑒定和抑菌活性研究，共分離鑒定出14株菌株，分屬4個(gè)屬，其中青霉屬9株、占64.3%，屬于優(yōu)勢(shì)菌屬。目前，國(guó)內(nèi)已經(jīng)有對(duì)海鞘共附生細(xì)菌的研究報(bào)道［18］，然而關(guān)于海鞘共附生真菌代謝產(chǎn)物抗菌活性的研究報(bào)道還比較少［19］。

通過測(cè)試14株菌菌絲體乙酸乙酯的粗提取物的抗菌活性，以銅綠假單胞菌、黃八疊球菌、金黃色葡萄桿菌、假單胞菌屬、庫(kù)特氏菌屬、金黃桿菌屬為指示菌，其中有4株真菌對(duì)這6種指示菌都有抑菌活性，分別是Asc-2-4、Asc-2-12、Asc-1-1和Asc-2-1，在這抗菌活性較強(qiáng)的4株真菌，Asc-2-1屬于曲霉屬，其余3株屬于青霉屬。并且青霉屬菌株Asc-2-12 的抑菌活性最明顯，對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌圈直徑最大達(dá)到21.91 mm。珊瑚和海綿共附生真菌的研究發(fā)現(xiàn)，分離得到的部分青霉和曲霉菌表現(xiàn)出對(duì)細(xì)菌的廣譜抑菌活性［20］。因此有必要對(duì)以上4株海洋真菌的活性代謝產(chǎn)物進(jìn)行深入研究。海洋微生物天然產(chǎn)物正在成為創(chuàng)新藥物的一個(gè)重要來源，而海洋真菌作為海洋微生物的一個(gè)重要類群，具有研究和開發(fā)的巨大潛力［21］。

表1 14株海鞘共附生真菌的形態(tài)鑒定

表2 海鞘共附生真菌乙酸乙酯粗提物抗菌活性的篩選

圖2 海鞘部分真菌發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物抗菌活性

4 結(jié)論

從海鞘中純化出14 株真菌，經(jīng)初步鑒定14 株真菌分屬于青霉屬、曲霉屬、枝孢屬和麥軸梗霉屬等4 個(gè)屬，其中青霉屬9株，曲霉屬3株，枝孢屬和麥軸梗霉屬各1株。最后對(duì)分離純化出的14 株海鞘真菌的乙酸乙酯粗提物進(jìn)行抗菌活性篩選，發(fā)現(xiàn)14 株菌中有11 株菌對(duì)一種以上的細(xì)菌指示菌有抗菌活性，其中有4 株菌的抗菌活性較強(qiáng)且抗菌譜較廣，編號(hào)分別為Asc-2-4、Asc-2-12、Asc-1-1和Asc-2-1，菌株Asc-2-12 的抑菌活性最明顯，對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌圈直徑最大達(dá)到21.91 mm。綜上表明，海鞘共附生真菌存在良好的應(yīng)用開發(fā)潛力，可作為發(fā)現(xiàn)新穎抗菌活性物質(zhì)的潛在資源。