劉思陽 王巖 付玉芹 胡祥坤 王茗宇 盧天成 王秀然

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，長(zhǎng)春130118）

布魯菌病是全球性人畜共患傳染病，可引發(fā)家畜（豬、羊和牛）發(fā)熱、流產(chǎn)及死亡，對(duì)農(nóng)牧經(jīng)濟(jì)造成重大的損失并嚴(yán)重威脅人類的健康［1-2］。Rev.1、S19等減毒菌株是目前可用于控制動(dòng)物布氏桿菌病的有效疫苗之一，但減毒疫苗存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，安全性差［3］。布魯菌抗原在激活宿主免疫時(shí)，特別是天然免疫的水平較低，不能形成穩(wěn)定的免疫保護(hù)，因此提高蛋白免疫保護(hù)水平成為布魯菌亞單位疫苗的熱點(diǎn)［4］。Denoel等［5］研究表明胞間質(zhì)結(jié)合蛋白（P39）作為T細(xì)胞免疫布魯菌抗原可誘導(dǎo)Th1導(dǎo)向型的免疫反應(yīng)，具有較高的免疫原性，因此P39成為很有前景的亞單位候選抗原。

近年來通過糖基化修飾改變蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，提高蛋白免疫保護(hù)水平在疫苗領(lǐng)域備受關(guān)注，已有部分疫苗應(yīng)用于臨床［6-8］。有研究表明，通過糖基化修飾后的蛋白可激活宿主TLR4受體系統(tǒng)，提高宿主細(xì)胞天然免疫水平，從而提高抗原的免疫保護(hù)作用［9］。

本研究選取可進(jìn)行糖基化修飾的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)［10］，對(duì)布魯菌優(yōu)勢(shì)抗原蛋白P39進(jìn)行分泌表達(dá)，探究其修飾后對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬的影響。為進(jìn)一步研究糖基化影響蛋白免疫原性的機(jī)理，開發(fā)新型糖基化布魯菌亞單位疫苗提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌Escherichia coliTOP10株購自全式金生物公司（北京，中國(guó)）畢赤酵母P. pastoris GS115由山東大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)（山東，中國(guó)）、pPICZαA真核表達(dá)載體購自Invitrogen公司（長(zhǎng)春，中國(guó)）、布魯菌（B.melitensis16M）DNA由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所提供。

ExTaq DNA 聚合酶、T4 DNA ligase、EcoR I、NotI、SacI、DNA marker 均為TaKaRa公司產(chǎn)品（長(zhǎng)春，中國(guó)），Zeocin 為Invitrogen公司產(chǎn)品（長(zhǎng)春，中國(guó)）；Protein Find Anti-His Mouse Monoclonal Antibody、Protein Find Goat Anti-Mouse IgG（H+L），HRP Conjugate購自全式金公司（北京，中國(guó)）。PNGaseF糖苷酶購自NEB公司（上海，中國(guó)）；PVDF膜、濾紙購自promega公司（上海，中國(guó)），引物合成及基因測(cè)序由上海華大基因有限公司完成（上海，中國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 畢赤酵母真核表達(dá)載體pPICZαA-P39 的構(gòu)建根據(jù)GenBank公布的Brucella melitensis16M（GenBank Accession ID：WP：087932960）序列，應(yīng)用DMAMAN及primer 5.0基因分析軟件，設(shè)計(jì)擴(kuò)增P39基因序列，以布魯菌基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物序列g(shù)aattc（EcoR I）ATGGCACCTGTTGCCAATGC，下游引物序列g(shù)cggccg（NotI）TTTTGCGGCTTCAACCGCC。將膠回收的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物P39基因與pPICZα-A 質(zhì)粒用EcoRI、NotI進(jìn)行雙酶切，將酶切后的P39基因片段用 T4DNA 連接酶連接pPICZα-A 載體上，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌 TOP 10 感受態(tài)細(xì)胞中。經(jīng)雙酶切鑒定正確后送上海華大基因有限公司測(cè)序。

1.2.2 重組蛋白P39的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取生長(zhǎng)在Zeocin抗性YPD平板上的陽性單菌落，接種于5 mL的BMGY液體培養(yǎng)基中，在50 mL三角瓶中培養(yǎng)，28℃、250 r/min搖床培養(yǎng)16-20 h，至OD600值約為2.0-4.0，此時(shí)酵母菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。離心收集菌液，6 000 r/min，4℃離心，收集沉淀，重懸于5 mL的BMMY液體培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入50 mL的BMMY液體培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶繼續(xù)震蕩培養(yǎng)。每隔24 h加入1%的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)電轉(zhuǎn)化空載體pPICZαA的GS115菌株作為陰性對(duì)照。培養(yǎng)96 h后收集樣品，10 000 r/min，4℃離心2 min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE分析蛋白的表達(dá)情況。

1.2.3 重組蛋白P39的純化 將收集好的上清液進(jìn)行真空凍干，10 mmol/L，pH 7.4的磷酸鹽溶液（PBS）透析48 h，0.22 μm無菌過濾器過濾，利用Sephacryl S-100蛋白層析純化柱純化，20 mmol/L NaCl洗脫蛋白，每管3 mL，Nanodrop在280 nm處檢測(cè)吸光值，SDS-PAGE鑒定各層析成分。

1.2.4 蛋白P39免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Westen blot）鑒定 通過 Western blotting 檢驗(yàn)純化后的重組目的蛋白。SDS-PAGE后100 V恒壓轉(zhuǎn)膜55 min。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST漂洗3次，加入1∶1 000 稀釋的抗his標(biāo)簽鼠單克隆抗體，37℃孵育45 min，TBST 漂洗3次后，加入1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，室溫孵育45 min，TBST漂洗3次后用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色（購自sigma公司），觀察目的條帶并記錄結(jié)果。

1.2.5 發(fā)酵條件對(duì)蛋白表達(dá)量的影響

1.2.5.1 pH值對(duì)重組蛋白P39表達(dá)量的影響 取陽性重組菌以1%的接種量分別接入pH值分別為3.0、5.0、6.0、8.0的200 mL BMGY培養(yǎng)基中，鹽濃度0.05M，28℃搖床培養(yǎng)，至OD600值為0.6-0.8時(shí)，1%甲醇誘導(dǎo)72 h。

1.2.5.2 磷酸鹽濃度對(duì)重組蛋白P39表達(dá)量的影響 取陽性重組菌以1%的接種量分別接入磷酸鹽濃度分別為0.02 mol/L、0.05 mol/L、0.1 mol/L和0.2 mol/L的BMGY培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，pH 6.0，OD600值為0.6-0.8時(shí)，1%甲醇誘導(dǎo)72 h。

1.2.5.3 甲醇濃度對(duì)重組蛋白P39表達(dá)量的影響 取陽性重組菌以1%的接種量BMGY培養(yǎng)基中，28℃搖床培養(yǎng)，鹽濃度0.05 mol/L，pH 6.0，OD600值為0.6-0.8時(shí)，分別以0.5%、1%、2%和3%不同濃度的甲醇誘導(dǎo)72 h。

1.2.5.4 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白P39表達(dá)量的影響 取陽性重組菌以1%的接種量BMGY培養(yǎng)基中，28℃搖床培養(yǎng)，鹽濃度0.05 mol/L，pH 6.0，OD600值為0.6-0.8時(shí)，以1%濃度的甲醇分別誘導(dǎo)24 h、48 h、72 h和 96 h。

1.2.5.5 NanoDrop檢測(cè)蛋白濃度 以100 μg/mL牛血清白蛋白作為對(duì)照，對(duì)目的蛋白進(jìn)行蛋白濃度標(biāo)定。

1.2.6 酵母分泌表達(dá)的P39蛋白糖基化鑒定 將純化后10 μg的真核蛋白加入1 μL糖蛋白變性緩沖液，總體積10 μL。100℃變性10 min，加入2 μL的glycobuffer，10% NP-40和1 μL的PNGaseF糖苷酶，37℃，孵育1 h。500 MHz核磁共振氫譜檢測(cè)重組P39蛋白糖基化修飾水平。

1.2.7 巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬熒光抗原實(shí)驗(yàn) 將FITC與真核蛋白及原核蛋白進(jìn)行混合反應(yīng)，在4℃避光反應(yīng)18 h后收集樣品。復(fù)蘇RAW264.7巨噬細(xì)胞后將其以105個(gè)每孔接種于24孔板中，加入FITC標(biāo)記的真核蛋白和原核蛋白，PBS作為空白對(duì)照組，熒光顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞吞噬抗原蛋白情況，分別記錄4 h、6 h不同時(shí)間巨噬細(xì)胞吞噬蛋白情況。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建真核表達(dá)載體pPICZαA-P39

DNA核酸電泳顯示成功構(gòu)建pPICZαA-P39真核表達(dá)載體，電轉(zhuǎn)化后挑選出的陽性菌株。條帶大小與理論的片段大小一致為1 206 bp，如圖1所示。

2.2 真核P39抗原表達(dá)純化與Western blot鑒定

甲醇誘導(dǎo)陽性轉(zhuǎn)化子表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)P39蛋白的表達(dá)，目的條帶在45 kD處，如圖2。目的蛋白條帶與理論值大小一致，純化后的蛋白純度較好，高效液相色譜檢測(cè)純化蛋白純度，純度可達(dá)93.77%，如圖3和圖4所示。經(jīng)Western blot免疫印跡法檢測(cè)確定該蛋白為P39蛋白，特異性良好，如圖5所示。

圖1 真核表達(dá)載體pPICZαA-P39的構(gòu)建

圖2 SDS-PAGE分析重組蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)

圖3 純化后重組蛋白P39

圖4 高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)純化蛋白純度

圖5 重組蛋白P39 western blot鑒定

2.3 真核P39抗原發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 pH值對(duì)重組蛋白P39表達(dá)量的影響 由圖6-A可以看出，蛋白得率隨pH的升高先增高后降低，當(dāng)pH至為6時(shí)，蛋白的得率最高，實(shí)驗(yàn)表明該重組蛋白在酸性或弱堿性的條件下表達(dá)條件較好，所以，最佳的發(fā)酵pH 6左右，最高得率為3.86mg/mL。

圖6 不同因素對(duì)P39蛋白表達(dá)量的影響

2.3.2 鹽濃度對(duì)重組蛋白P39表達(dá)量的影響 由圖6-B可見，隨磷酸鉀濃度的升高蛋白得率降低，在磷酸鉀濃度為0.05 mol/L時(shí)，蛋白得率最高，過高的鹽濃度可能會(huì)抑制蛋白的表達(dá)，所以，最佳的磷酸鉀濃度為0.05 mol/L，最高得率為3.64 mg/mL。

2.3.3 甲醇濃度對(duì)重組蛋白P39表達(dá)量的影響 由圖6-C可見，隨甲醇誘導(dǎo)濃度的增加蛋白得率先增加后減少，在甲醇濃度1%時(shí)，蛋白得率最高，低濃度和高濃度的甲醇對(duì)蛋白的表達(dá)都有不利影響，最佳的甲醇誘導(dǎo)濃度1%，最高得率為4.96 mg/mL。

2.3.4 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白P39表達(dá)量的影響 由圖6-D可見，隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加，蛋白得率出現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，過長(zhǎng)時(shí)間的誘導(dǎo)不利于目的蛋白的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)表明，誘導(dǎo)72 h的條件下，長(zhǎng)時(shí)間的誘導(dǎo)可能導(dǎo)致蛋白降解，所以，72 h蛋白得率最高，最高得率為5.05 mg/mL。

2.4 酵母分泌表達(dá)的P39蛋白糖基化鑒定

本研究對(duì)酵母表達(dá)的 P39蛋白和利用PNGaseF糖苷酶酶解的 P39蛋白利用核磁共振氫譜進(jìn)行了糖基化修飾分析，結(jié)果（圖7-C）表明，重組蛋白圖譜在3.6-3.8 ppm處出現(xiàn)寡糖H信號(hào)，說明在純化后的重組蛋白上存在糖信號(hào)，重組后的 P39蛋白在畢赤酵母中發(fā)生糖基化修飾。同時(shí)利用PNGaseF糖苷酶酶解蛋白N-糖鏈后的重組 P39蛋白糖信號(hào)未消失，P39 蛋白存在潛在的糖基化修飾位點(diǎn)，但酶解后糖信號(hào)仍然存在，說明蛋白的糖基化形式不是理論上N-糖修飾類型，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)蛋白的糖基化修飾主要表現(xiàn)為N-糖修飾和 O-糖修飾兩種類型，綜合上述結(jié)果表明該重組 P39蛋白的糖基化形式可能是O-糖基化修飾［11-12］。

圖7 一維核磁共振氫譜（1H NMR）分析蛋白糖基化

2.5 巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬熒光蛋白

熒光顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種蛋白在 2 h開始出現(xiàn)熒光，熒光強(qiáng)度隨時(shí)間呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)，真核蛋白出現(xiàn)熒光效果早于原核蛋白，在 6 h時(shí)熒光現(xiàn)象明顯，PBS空白對(duì)照組未見明顯熒光細(xì)胞。根據(jù)圖8顯示，巨噬細(xì)胞吞噬真核蛋白的熒光強(qiáng)度明顯優(yōu)于吞噬原核蛋白。說明糖修飾對(duì)巨噬細(xì)胞的吞噬作用具有一定的影響，可增強(qiáng)蛋白的免疫原性［13］。

圖8 檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬熒光蛋白情況

3 討論

布魯菌進(jìn)入宿主細(xì)胞之后，可被宿主免疫系統(tǒng)分解，同時(shí)釋放細(xì)胞質(zhì)結(jié)合蛋白，這些蛋白質(zhì)分子繼續(xù)發(fā)揮免疫刺激與侵染的作用［14］。P39蛋白是布魯菌優(yōu)勢(shì)抗原，其蛋白可以有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，而且P39基因在多個(gè)不同種型布魯菌中高度保守，該成分可以在不同的布魯菌中形成交叉保護(hù)作用，用于制備的新型布病疫苗具有較大優(yōu)勢(shì)［15-16］。近年許多研究表明，糖基化對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)和活性有很大的影響，消除N-糖基化位點(diǎn)可延長(zhǎng)IFN-α/ Fc融合蛋白的半衰期［17］，糖鏈長(zhǎng)短的變化及不同糖型的修飾都會(huì)影響蛋白的生物活性［18-19］，本課題組發(fā)現(xiàn)甘露六糖修飾后的布魯菌 AHCY蛋白的免疫性得到大幅度的提升［20］，說明糖修飾會(huì)改變蛋白的生物功能，這為開發(fā)安全有效的布魯氏菌亞單位疫苗提供了可能。

本實(shí)驗(yàn)中，為獲得大量 P39抗原，選擇具有分泌優(yōu)勢(shì)的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，并在酵母體內(nèi)對(duì) P39抗原蛋白進(jìn)行天然的糖基化修飾。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖基化后的 P39蛋白更容易被巨噬細(xì)胞捕獲，與原核表達(dá)的 P39蛋白相比，其結(jié)合巨噬細(xì)胞的效率更好，也更有可能高效的激活巨噬細(xì)胞。重組后的 P39蛋白顯示出優(yōu)于原核 P39蛋白的免疫原性，這可能是由于糖鏈的存在及其結(jié)構(gòu)引發(fā)的改變，在 P39蛋白的理論 N-端糖基化位點(diǎn)并為發(fā)生修飾作用，說明糖基化的修飾可能存在隨機(jī)性，或是由于蛋白空間結(jié)構(gòu)折疊后掩蓋其理論的糖基化位點(diǎn)，使其潛在的糖基化位點(diǎn)未進(jìn)行修飾。隨著基因工程的發(fā)展，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了在分子水平對(duì)酵母糖基化系統(tǒng)進(jìn)行改造，從而更有利于生產(chǎn)人源糖蛋白藥物及亞單位疫苗的開發(fā)［21-22］。

4 結(jié)論

本研究成功在畢赤酵母中分泌表達(dá) P39抗原，優(yōu)化發(fā)酵條件產(chǎn)量可達(dá) 5.05 g/L，通過核磁共振氫譜結(jié)果表明 P39抗原發(fā)生糖基化修飾，糖基化修飾后的 P39抗原被巨噬細(xì)胞捕獲的程度明顯高于原核蛋白，說明糖基化修飾作用會(huì)在一定程度上影響蛋白的免疫原性。