耿寧+盧劍

摘 要：建立同時測定肌肉組織中新霉素、灰黃霉素、多黏菌素B、喹乙醇及其代謝物3-甲基喹啉-2-羧酸（3-methyl-quinoxaline-2-carboxylic acid，MQCA）的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）分析方法。肌肉組織勻漿均質(zhì)后使用乙腈-5%甲酸水溶液提取，HLB固相色譜柱凈化，HPLC分離，電噴霧離子源正離子模式及多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：4 種獸藥在質(zhì)量濃度1.0～200.0 ?g/L范圍內(nèi)均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，R2均大于0.998 0；新霉素、灰黃霉素和多黏菌素B的方法檢出限為5.0 μg/kg，喹乙醇及MQCA為0.5 μg/kg；陰性樣品中4 種獸藥的加標(biāo)回收率為82.1%～98.4%，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）（n=6）為2.2%～6.7%。該方法前處理過程簡單、干擾較少，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，適用于肌肉組織中4 種獸藥的定性與定量檢測。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；固相萃??；肌肉組織；獸藥殘留

Simultaneous Determination of Four Veterinary Drugs in Edible Muscle Tissues by High Performance

Liquid Chromatography-Ttandem Mass Spectrometry

GENG Ning1，2， LU Jian2，*

（1.Quality Association of Jiangsu Province， Nanjing 210029， China；

2.Jiangsu Product Quality Inspection and Testing Institute， Nanjing 210007， China）

Abstract： A novel， simple and rapid method was established for the simultaneous determination of four veterinary drugs （neomycin， griseofulvin， polymyxin B， olaquindox and its metabolite 3-methyl-quinoxaline-2-carboxylic acid （MQCA）） in muscle tissues of food-producing animals by solid phase extraction （SPE） coupled with high performance liquid chromatography tandem triple quadrupole mass spectrometry （HPLC-MS-MS）. After homogenized， muscle tissues were extracted with a mixture of acetonitrile and 5% formic acid solution and the extract was purified by an HLB solid phase extraction column， separated by HPLC， detected by positive electrospray ionization in multiple reaction monitoring mode （MRM）， and quantified by an external standard method. Under the optimal conditions， the calibration for all five analytes showed a linear relationship in the range of 1.0–200.0 ?g/L with correlation coefficients higher than 0.998 0 and the limit of detection was

5.0 ?g/kg for neomycin， griseofulvin， polymyxin B and 0.5 ?g/kg for olaquindox and MQCA， respectively. The mean recoveries of spiked samples （spiked concentration levels： 20.0， 40.0 and 200.0 ?g/L for neomycin， griseofulvin and polymyxin B； 2.0， 4.0 and 20.0 ?g/L for qlaquindox and its metabolite） were ranged from 82.1% to 98.4% with relative standard deviation （RSD， n = 6） between 2.2% and 6.7%. This method is accurate， simple， rapid and applicable to the detection of veterinary drugs in muscle tissues.

Key words： high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）； solid phase extraction； muscle tissue； veterinary drugsendprint

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201708008

中圖分類號：O657.7 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2017）08-0039-05

隨著現(xiàn)代養(yǎng)殖技術(shù)的迅速發(fā)展，獸藥在畜禽養(yǎng)殖過程中的使用比例逐漸增加。獸藥不僅能夠用于畜禽的殺菌治療，還有促進生長的作用。然而由于養(yǎng)殖人員的技術(shù)和知識水平參差不齊，因此經(jīng)常出現(xiàn)盲目用藥、重復(fù)給藥、藥物亂用、實驗性用藥等現(xiàn)象，這不僅導(dǎo)致畜禽體內(nèi)大量的獸藥殘留，還給食品安全帶來了巨大隱患[1-3]。

2017年的3·15晚會針對獸藥濫用問題做了專題報道，主要涉及到的獸藥包括喹乙醇、新霉素、灰黃霉素和黏菌素等殺菌、促生長類藥物。其中喹乙醇是一種新型“瘦肉精”，它可以促進畜禽生長，近年來被廣泛用于牛、雞、豬的飼養(yǎng)[4-6]，但毒理學(xué)研究表明，喹乙醇對動物具有致癌、致畸的作用。因此，歐盟在1998年禁止在可食性動物飼養(yǎng)中使用喹乙醇，但目前美國和中國仍允許將喹乙醇用于生豬飼養(yǎng)，并規(guī)定其在豬肌肉和豬肝中的代謝物3-甲基喹啉-2-羧酸（3-methyl-quinoxaline-2-carboxylic acid，MQCA）的最高殘留限量分別為4 μg/kg和50 μg/kg。黏菌素是另一種具有抗感染和促生長作用的獸藥，它對腎及神經(jīng)系統(tǒng)具有毒害性[7-8]。動物飼養(yǎng)過程中大量使用黏菌素可造成其在動物體內(nèi)的大量殘留，并通過蛋、乳、肉等食品傳遞給人類。我國和歐盟均嚴(yán)格規(guī)定了黏菌素的殘留量，其在動物肝臟和肌肉中的殘留量分別不得超過200 μg/kg和150 μg/kg[9]。

鑒于獸藥濫用造成動物體內(nèi)大量獸藥殘留的現(xiàn)狀，建立一種行之有效的同時檢測動物肌肉組織中多種獸藥殘留的方法至關(guān)重要。目前針對喹乙醇[10-13]、灰黃霉素[14-17]、

新霉素[18-21]和黏菌素[21-24]等獸藥的檢測方法已有部分報道。GB/T 20797—2006《肉與肉制品中喹乙醇?xì)埩袅康臏y定》[25]和GB/T 20746—2006《牛、豬肝臟和肌肉中卡巴氧、喹乙醇及代謝物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[26]也規(guī)定了牛、豬的肝臟和肌肉中喹乙醇代謝物的檢測方法；鄭玲等[27]利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法對動物源食品中的喹乙醇進行了檢測；蘇萌等[28]建立了檢測動物源食品中黏桿菌素和多黏菌素的HPLC-MS/MS法。上述報道僅針對1～2 種獸藥建立了檢測方法，無法滿足多種獸藥同時篩查、同時檢測的要求。鑒于此，本研究利用固相萃取凈化技術(shù)和HPLC-MS/MS儀建立同時測定肌肉組織中新霉素、灰黃霉素、多黏菌素B、喹乙醇及其代謝物MQCA殘留量的分析方法，并對方法的準(zhǔn)確度和精密度進行評價，對同時測定肌肉組織中上述4 種獸藥的殘留量具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞肉（8 份）、豬肉（8 份）、兔肉（4 份）樣品，隨機購自廣州各市場。

硫酸新霉素（純度>90.0%）、灰黃霉素（純度>

98.0%）、硫酸多黏菌素B（純度>84.0%）、喹乙醇（純度>99.0%）、MQCA（純度>99.0%）標(biāo)準(zhǔn)品

德國Dr.Ehrenstorfe公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Merck公司；甲酸（色譜純） 上海安譜實驗科技股份有限公司；實驗用水均為超純水；其他試劑均為分析純 廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

HLB固相萃取小柱（200 mg，6 mL） 德國CNW公司；1260超高效液相色譜儀、6490串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀 美國Agilent公司；MS3 Basic漩渦振蕩器、T18高速均質(zhì)機 德國IKA公司；Milli-Q純水儀 美國

Millipore公司；KQ-250DV超聲波清洗儀（250 W）

昆山市超聲儀器有限公司；KDC-1044離心機 北京中科佳儀科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取5 種標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，分別置于100 mL棕色容量瓶中，用10 mL乙腈-1%甲酸水溶液（50∶50，V/V）溶解，用乙腈定容，得到質(zhì)量濃度為100 mg/L的單標(biāo)儲備液；分別吸取5 種單標(biāo)儲備液各1.0 mL，用乙腈定容至100 mL，得到5 種標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度均為1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。實驗中所需的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液均通過乙腈逐級稀釋得到。所有標(biāo)準(zhǔn)溶液均于-18 ℃保存。

1.3.2 樣品處理

1.3.2.1 提取

將肌肉組織切碎后使用均質(zhì)機打碎，混合均勻，準(zhǔn)確稱取5.00 g（精確至0.01 g）均質(zhì)后的樣品于50 mL塑料離心管內(nèi)，加入10 mL提取溶劑，渦旋1 min后，超聲提取10 min，于4 000 r/min條件下離心3 min；將上清液轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中，用10 mL提取溶劑重復(fù)提??；合并2 次提取所得上清液，用提取溶劑定容至25.0 mL，搖勻，待凈化。

其中提取溶劑分別選用乙腈、甲醇、5%甲酸水溶液等單一溶劑或二元溶劑提取體系，根據(jù)5 種化合物的提取效果選擇最適提取溶劑。

1.3.2.2 凈化

預(yù)先將HLB固相萃取柱分別用5 mL甲醇、10 mL超純水活化后，取10 mL上述提取液上樣；待液體完全流出后，用5 mL超純水淋洗固相萃取柱，減壓抽干；用10 mL凈化洗脫液洗脫目標(biāo)化合物至15 mL離心管，將洗脫液于50 ℃條件下氮氣濃縮至近干；用1.0 mL初始流動相溶解濃縮物，0.22 μm濾膜過濾，進行HPLC-MS/MS測定。endprint

其中分別用10 mL乙腈含量不同的乙腈-5%甲酸水溶液（乙腈體積分?jǐn)?shù)分別為100%、80%、50%和20%）作為凈化洗脫液洗脫目標(biāo)化合物，根據(jù)5 種化合物的凈化效果選擇最適洗脫液。

1.3.3 實驗條件

1.3.3.1 色譜條件

選擇Welch Ultimate AQ-C18（4.6 mm×150 mm，5.0 μm）、Welch Ultimate XB-Phenyl（4.6 mm×150 mm，5.0 μm）和Welch Ultimate XB C18（4.6 mm×150 mm，5.0 μm）3 種色譜柱進行實驗，根據(jù)5 種化合物的分離效果選擇合適的色譜柱；流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～3.0 min，流動相B體積分?jǐn)?shù)由15%升至80%，3.0～5.5 min，流動相B體積分?jǐn)?shù)80%，5.5～5.6 min，流動相B體積分?jǐn)?shù)由80%降至15%，5.6～7.0 min，流動相B體積分?jǐn)?shù)15%。柱溫：35 ℃；流速：0.50 mL/min；進樣量：10 μL。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測（multi reaction monitoring，MRM）采集模式；毛細(xì)管電壓3 000 V；氮氣為干燥氣，氣體溫度280 ℃，流速

14 L/min；氮氣輔助氣溫度350 ℃，流速11 L/min；駐留時間25 ms。待測化合物的監(jiān)測離子對（質(zhì)荷比，

m/z）、碎裂電壓和碰撞能量如表1所示。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在最優(yōu)實驗條件下，分別對不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（5 種標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg/L）進行測定，以待測化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），定量離子對的峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各化合物的儀器檢出限（the instrument detection limit，ILOD）根據(jù)3 倍信噪比（RS/N=3）計算得到。

1.3.5 回收率和精密度實驗

在最優(yōu)實驗條件下，選取豬肉和兔肉的陰性樣品，分別添加3 個質(zhì)量濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，計算方法的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。新霉素、灰黃霉素和多黏菌素B的添加水平分別為20.0、40.0、200.0 μg/kg，喹乙醇和MQCA的添加水平分別為2.0、4.0、20.0 μg/kg。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用安捷倫質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集工作站（Version B.08.00）進行數(shù)據(jù)采集，Origin 8.0軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取和凈化條件的選擇

動物肌肉組織中含有許多脂溶性的內(nèi)源性物質(zhì)，這些物質(zhì)在檢測過程中會嚴(yán)重干擾化合物的響應(yīng)，因此需要選擇合適的提取溶劑和凈化方式來去除干擾物質(zhì)。

2.1.1 提取溶劑的選擇

新霉素、多黏菌素B和喹乙醇極性較大，使用極性溶劑較易提取，而灰黃霉素和MQCA極性相對較小，需使用有機溶劑進行提取。由于新霉素和多黏菌素B在酸性條件下的提取效率較高，本研究比較了乙腈、甲醇、5%甲酸水溶液等單一溶劑或二元溶劑提取體系下的提取效果。結(jié)果表明，單一有機溶劑體系對灰黃霉素、喹乙醇和MQCA均有一定的提取效果，但對新霉素和多黏菌素B的提取效果較差，而單一的5%甲酸水溶液對灰黃霉素幾乎沒有提取效果。使用有機溶劑-5%甲酸水溶液二元體系進行提取時，乙腈或甲醇作為有機相時的提取效果差別不大，但二者在溶劑體系中的比例會影響提取或凈化過程。有機相比例過低時（<10%），灰黃霉素的提取率低于60%，有機相比例過高時（>30%），提取液中的脂溶性干擾物質(zhì)較多，影響固相萃取凈化效果。綜上所述，選擇乙腈-5%甲酸水溶液（20∶80，V/V）作為提取溶劑，此時5 種化合物的提取率均達82%以上。

2.1.2 凈化洗脫液的選擇

固相萃取技術(shù)利用固相萃取小柱對提取液進行凈化，可以有效去除雜質(zhì)，減少基質(zhì)干擾。本研究利用HLB固相萃取柱對肌肉組織提取液進行凈化，分別用10 mL乙腈含量不同的乙腈-5%甲酸水溶液洗脫目標(biāo)化合物。結(jié)果表明，用乙腈的體積分?jǐn)?shù)為20%和50%的洗脫液進行洗脫時雜質(zhì)最少，但仍有部分灰黃霉素未被洗脫（約30%～45%）；純乙腈洗脫液所得雜質(zhì)最多，而采用80%乙腈-5%甲酸水溶液做洗脫液時，不僅洗脫后溶液中的雜質(zhì)較少，而且5 種化合物的回收率均在80%以上。因此，選擇10 mL 80%乙腈-5%甲酸水溶液為洗脫液。

2.2 色譜柱的選擇

5 種化合物的結(jié)構(gòu)和極性不同，如灰黃霉素含有弱極性、疏水性的苯環(huán)和苯并呋喃酮環(huán)，新霉素含有多羥基和氨基，具有較強的極性和親水性，因此需選擇合適的色譜柱進行分離。本研究比較了3 種色譜柱對5 種化合物的分離效果。結(jié)果表明，灰黃霉素在AQ-C18色譜柱上的保留效果較差，不僅出峰時間短，而且峰形較差，不能實現(xiàn)很好的分離，這是由AQ-C18柱填料極性封端，對于弱極性、苯環(huán)較多的灰黃霉素保留作用較弱導(dǎo)致的，而

XB-Phenyl色譜柱填料鍵合了丙基苯基，對含有苯環(huán)的灰黃霉素有較好的保留作用，但對其他4 種化合物的保留較弱，整體上不能達到良好的分離效果。XB-C18色譜柱采用新型鍵合和雙封尾技術(shù)，對強極性和弱極性化合物均有保留作用，可以實現(xiàn)4 種獸藥的分離。采用優(yōu)化后的方法對5 種化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液進行測定的提取離子色譜圖如圖1所示。

2.3 線性方程和檢出限

由表2可知，喹乙醇和MQCA標(biāo)準(zhǔn)線性方程的R2分別為0.998 2和0.999 1，其他3 種化合物的R2均大于0.998 0，說明5 種化合物的定量離子對峰面積與其質(zhì)量濃度間的線性關(guān)系良好。綜合考慮前處理過程中的濃縮倍數(shù)（2 倍）和前處理回收率，計算得到5 種化合物的方法檢出限（the method detection limit，MLOD）。喹乙醇和MQCA的ILOD為1.0 μg/L，MLOD為0.5 μg/kg；其他3 種化合物的ILOD為10.0 μg/L，MLOD為5.0 μg/kg。表明方法靈敏度高，適用于5 種目標(biāo)獸藥的定量分析。endprint

2.4 回收率和精密度實驗

由表3可知，5 種化合物的回收率在82.1%～98.4%之間，RSD在2.2%～6.7%之間，表明方法的回收率和精密度均能夠滿足肌肉組織中5 種化合物的檢測要求。

2.5 實際樣品測定

由表4可知，1 份雞肉樣品中檢測出新霉素，含量為41.7 μg/kg；2 份豬肉樣品和1 份兔肉樣品中檢測出喹乙醇或MQCA，其含量分別為21.7、59.1、11.4 μg/kg，其他樣品中沒有檢測出4 種獸藥。

3 結(jié) 論

本研究采用固相萃取凈化技術(shù)和HPLC-MS/MS法建立了肌肉組織中新霉素、灰黃霉素、多黏菌素B、喹乙醇及MQCA 4 種獸藥殘留的檢測方法。該方法前處理過程簡單、干擾較少，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，方法定量限、回收率及精密度等均能夠滿足肌肉組織中獸藥的定性與定量檢測要求。

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