朱榮貴 關(guān)統(tǒng)偉 姜秀娟

（1. 四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，自貢 643000；2. 西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，成都 610039）

隨著人類社會(huì)的發(fā)展，新型人類疾病不斷出現(xiàn)、病原微生物對(duì)臨床藥物耐藥性不斷增加以及動(dòng)植物病害嚴(yán)重發(fā)生等問題日益嚴(yán)重，促使人們呼喚新結(jié)構(gòu)新活性抗生素的發(fā)現(xiàn)，目前，新抗生素中50%-78%由放線菌產(chǎn)生［1-2］。稀有放線菌是一類出現(xiàn)頻率比鏈霉菌低得多的放線菌類群，有著產(chǎn)生新的天然活性物質(zhì)的極大潛力［3-4］，其研究一直備受關(guān)注［5］。

塔里木盆地是我國最大內(nèi)陸盆地，氣候極端干旱，植被稀少，土壤荒漠化和鹽堿化嚴(yán)重，環(huán)境較為特殊，可能存在獨(dú)特的稀有放線菌［6-7］。微生物的數(shù)量和組成與其生存環(huán)境（水、熱、pH、植被、土壤等生態(tài)條件）密切相關(guān)［8-9］，為了給研究者有目標(biāo)的分離獲得該地區(qū)稀有放線菌資源提供參考，本研究根據(jù)倪健等［10］對(duì)塔里木盆地生態(tài)小區(qū)的劃分，選擇5個(gè)代表性生態(tài)小區(qū)，使用選擇性培養(yǎng)基分離稀有放線菌，分析不同生態(tài)小區(qū)稀有放線菌分布情況。

為提高產(chǎn)活性物質(zhì)潛力菌的篩選效率，本項(xiàng)目組還對(duì)抗生素合成相關(guān)基因進(jìn)行了篩選，主要包括I型PKS、II型PKS、NRPS、APH和HMG-CoA。它們是相應(yīng)抗生素類代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的關(guān)鍵催化物，其中聚酮合酶（Polyketide synthase，PKS）能夠催化小分子羧酸類物質(zhì)合成具有重要藥用價(jià)值的次級(jí)代謝產(chǎn)物——聚酮類化合物。放線菌主要含有I型PKS和II型PKS，I型PKS催化合成的抗生素主要包括大環(huán)內(nèi)脂類、聚醚類、多烯類和安莎類；II型PKS催化合成的抗生素主要包括蒽環(huán)類和四環(huán)類。非核糖體多肽合成酶（Nonribosomal Peptide -synthetase，NRPS）是一些重要多肽類抗生素的合成系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用的酶，能識(shí)別特定的氨基酸并將其直接相連形成多肽鏈。氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶（Aminoglycoside Phosphotransferases，APH）與氨基糖苷類抗生素合成密切相關(guān)［11］，氨基糖苷類抗生素主要包括鏈霉素、新霉素等。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme A，HMG-CoA）還原酶與類異戊二烯的生物合成密切相關(guān)，后者有極大的臨床應(yīng)用價(jià)值［12］。這些基因是篩選生產(chǎn)相應(yīng)抗生素放線菌的重要依據(jù)。本研究根據(jù)基因篩選評(píng)估稀有放線菌的抗生素類活性物質(zhì)的產(chǎn)生潛力，旨在為進(jìn)一步開發(fā)利用稀有放線菌提供菌種基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)選擇塔里木盆地具代表性的5個(gè)生態(tài)小區(qū)，根據(jù)各小區(qū)的面積，每小區(qū)選擇2-4個(gè)點(diǎn)進(jìn)行采樣，采樣取土下5-20 cm深度的土壤，裝入滅菌袋，編號(hào)注明采集信息，4℃低溫保藏帶回實(shí)驗(yàn)室后，將各小區(qū)樣品以四分法均勻混合并檢測(cè)理化性質(zhì)，以5份混合土樣為材料進(jìn)行分離。各樣品理化性質(zhì)見表1。

表1 塔里木盆地5個(gè)生態(tài)小區(qū)混合土樣理化特性

1.2 方法

1.2.1 稀有放線菌分離 （1）預(yù)處理。干熱處理：土樣風(fēng)干，研磨過篩，120℃干熱處理1 h，稱取1g樣品到10 mL的無菌水中，120 r/min振蕩10 min。苯酚處理：取1 g樣品加入到1.5% 苯酚的無菌水中，30℃水浴30 min。SDS處理：稱取1 g土樣，用0.05%的SDS（5 mmol/l磷酸鹽緩沖液配制），加入6%的酵母膏，40℃下 200 r/min 振蕩 20 min［13］。

（2）分離培養(yǎng)：采用稀釋法涂板分離，使用改良HV培養(yǎng)基；ATCC172培養(yǎng)基［14］；海藻糖-脯氨酸培養(yǎng)基；改良脯氨酸培養(yǎng)基；改良高氏二號(hào)培養(yǎng)基［15］；葡萄糖-天門冬酰氨培養(yǎng)基［16］和YIM-3培養(yǎng)基［17］等7種培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)合篩選。培養(yǎng)基加入終濃度為60 μg/mL的重鉻酸鉀、50 μg/mL的放線菌酮和25 μg/mL的制霉菌素來抑制細(xì)菌和霉菌的生長(zhǎng)。以預(yù)處理和培養(yǎng)基為因素，設(shè)置21個(gè)處理進(jìn)行分離，28℃培養(yǎng) 2 周［18］。

（3）純化：根據(jù)菌落形態(tài)挑菌純化，純化培養(yǎng)基為ISP4培養(yǎng)基。ISP 4培養(yǎng)基：淀粉10 g，（NH4）2SO44g，CaCO32 g，MgSO42 g，K2HPO42 g，瓊脂16-18 g，水1 000 mL，pH調(diào)至7.0-7.5。

1.2.2 菌種鑒定 采用16S rRNA基因序列分析方法鑒定菌種。以酶小量法提取待測(cè)菌株基因組DNA［16］，利用通用引物（正向 PA ：5′-CAGA GTTTGATCCTGGCT-3′和反向 PB ：5′-AGGAGGTGA TCCAGCCGCA -3′）進(jìn)行16S rDNA基因的擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。獲得的16S rRNA基因序列在NCBI上采用Blast Search法進(jìn)行相似性檢索，從GenBank和EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫中搜集到相關(guān)放線菌的16S rRNA基因序列進(jìn)行比較鑒定。最后使用顯微鏡觀察形態(tài)特征并與分子鑒定結(jié)果比照進(jìn)行綜合鑒定。

1.2.3 生態(tài)分布及多樣性分析 分析各生態(tài)小區(qū)菌種分布及多樣性，計(jì)算不同小區(qū)的物種均勻度（Evenness）、豐富度（Shannon）和多樣性（Simpson）指數(shù)，其中Simpson指數(shù)用如下公式計(jì)算：

其中，N為個(gè)體總數(shù)，S屬數(shù)，Ni為i屬的個(gè)體數(shù)。

1.2.4 抗生素合成相關(guān)基因擴(kuò)增 采用5對(duì)引物擴(kuò)增菌株的功能基因。引物K1F（5′-TSAAGTCSAACA TCGGBCA-3′） 和 M6R（5′-CGCAGGTTSCSGTAC CAGTA-3′）用來擴(kuò)增 PKS-I基因［19］，引物 KSa（5′-TSGRCTACRTCAACGGSCAC GG-3′）和 KSβ（5′-TACSAGTCSWTCGCCTG GTTC-3′）用來擴(kuò)增 PKS-II基因［20］，引物 A3F（5′-GCSTACSYS ATSTACACSTCSGG-3′） 和 A7R（5′-SASGTCVCCSGTSCGG TAS-3′）用來擴(kuò)增NRPS基因，引物STR-F（5′-CGGCTGCTCGACCACGAC-3′） 和 STR-R（5′-GTCCTCGATGTCCCACAG-3′）用來擴(kuò)增 APH 基因［21］，引物 HMGF（5′-GGGCATCGCCGCGACCCTCGTCGACGAGCG-3′）和 HMGR（5′-GCGATGACGGCG AGGC GGCGGGCGTTCTC-3′）用來擴(kuò)增 HMG-CoA 基因［12］。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，目的條帶進(jìn)行割膠回收純化，克隆測(cè)序，通過Blast比對(duì)進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.5 拮抗活性初篩 采用抑菌圈法檢測(cè)分離到的放線菌對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，菌種編號(hào)ATCC 25923）、大腸桿菌（Escherichia coli，菌種編號(hào)ATCC 25922）的拮抗活性（本部分實(shí)驗(yàn)病原菌均購于中國農(nóng)業(yè)菌種保存中心）。使用血球計(jì)數(shù)板將病原菌調(diào)制成108個(gè)/ mL濃度的菌懸液，將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌菌懸液取100 μL涂布到LB培養(yǎng)基上，再在平板上接種放線菌的菌餅（瓊脂塊直徑0.6 cm）。LB培養(yǎng)平板37℃培養(yǎng)24-48 h。采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法檢測(cè)分離菌對(duì)給新疆主要經(jīng)濟(jì)作物造成危害的棉花枯萎病原菌（Fusarium oxysperiumsp.Vasinfectum，菌種編號(hào)ACCC 31038）、棉花黃萎病原菌（Verticillium dahliae，菌種編號(hào)ACCC 36211）和辣椒疫霉病原菌（Phytophthoracapsici，菌種編號(hào)ACCC 36278）的拮抗活性，將棉花枯、黃萎病原菌和辣椒疫霉病原菌菌懸液取100 μL涂布到PDA培養(yǎng)基上，接種放線菌（懸液濃度及方法同上）PDA培養(yǎng)平板28℃培養(yǎng)5 d。測(cè)量以上兩組實(shí)驗(yàn)的抑菌圈直徑（病原菌的菌落/絲與放線菌之間形成的隔離帶外圈的直徑），每個(gè)菌種做3組重復(fù)，取3組重復(fù)平均值，判斷放線菌對(duì)病原菌的拮抗活性。

2 結(jié)果

2.1 生態(tài)小區(qū)稀有放線菌分布分析

2.1.1 生態(tài)小區(qū)稀有放線菌組成狀況 對(duì)分離到的放線菌菌株先觀察其菌落形態(tài)特征，選擇形態(tài)差異明顯的稀有放線菌菌株，并在ISP 4培養(yǎng)基上插片培養(yǎng)1周，取片進(jìn)行顯微觀測(cè)，記錄其菌體、基絲形態(tài)，比照《放線菌的分類和鑒定》（閻遜初，1992），并結(jié)合16S rRNA基因序列在Blast上的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行菌屬鑒定。結(jié)果（表2）顯示分離得18株稀有放線菌，屬于放線菌的10個(gè)屬。

不同生態(tài)小區(qū)稀有放線菌分布種類由多到少依次為：塔里木河河岸林生態(tài)小區(qū)（I-5-j）10株，分別屬于8屬；塔克拉瑪干沙漠和田河西部生態(tài)小區(qū)（I-5-b）9株，分別屬于8屬；塔里木北部壤質(zhì)荒漠生態(tài)小區(qū)（I-5-a）8株，分別屬于8個(gè)屬；塔克拉瑪干沙漠中部生態(tài)小區(qū)（I-5-c）7株，分別屬于7屬；塔克拉瑪干沙漠塔里木河?xùn)|部生態(tài)小區(qū)（I-5-d）4株，分別屬于4個(gè)屬。

從稀有放線菌在生態(tài)小區(qū)的分布情況看，三項(xiàng)指數(shù)豐富度、均勻度、多樣性均為壤質(zhì)土壤小區(qū)較高（表3），反映出壤質(zhì)土壤較為適宜微生物生長(zhǎng)，其種類也很豐富。此外，從總體上看，不同植被土樣放線菌分布，以耕作土多樣性較為豐富，這一點(diǎn)與其它研究者結(jié)論基本相符，原因可能為耕作土水分充足、施肥較多、熟化程度高，利于稀有放線菌繁衍。

2.1.2 多樣性分析 依據(jù)每個(gè)生態(tài)小區(qū)稀有放線菌組成、菌數(shù)（CFU計(jì)，數(shù)據(jù)未列出），計(jì)算不同小區(qū)的物種均勻度（Evenness）、豐富度（Shannon）和多樣性（Simpson）指數(shù)。結(jié)果（表3）顯示豐富度指數(shù)以塔里木北部壤質(zhì)荒漠生態(tài)小區(qū)最大，為2.382 1，該小區(qū)物種所涵蓋屬的數(shù)目最多（屬數(shù)相同情況下，各屬的個(gè)體數(shù)目分配均勻性最高小區(qū)多樣性指數(shù)最高）；物種均勻度指數(shù)以塔克拉瑪干沙漠塔里木河?xùn)|部生態(tài)小區(qū)最大，為0.871 8，說明該小區(qū)各個(gè)菌種的個(gè)體數(shù)目分配均勻性最高；Simpson指數(shù)是綜合均勻度和豐富度的一項(xiàng)多樣性指數(shù)，以塔里木北部壤質(zhì)荒漠生態(tài)小區(qū)最大，為0.779 9，該小區(qū)的稀有放線菌屬數(shù)多且各屬的種數(shù)較為均勻，多樣性最好。

2.2 抗生素合成相關(guān)基因及菌株的拮抗效果檢測(cè)

利用5對(duì)引物通過PCR擴(kuò)增菌株抗生素合成相關(guān)基因，測(cè)得序列通過Blast比對(duì)進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證序列與相關(guān)功能基因相符為“陽性（+）”，不符為“陰性（-）”。對(duì)分離菌對(duì)病原菌的對(duì)峙培養(yǎng)平板進(jìn)行檢測(cè)，抑菌圈直徑＜0.2 cm為無拮抗性（陰性“-”），0.2 cm≤抑菌圈直徑≤0.4 cm為弱拮抗性（陽性“+”），抑菌圈直徑＞0.4 cm為強(qiáng)拮抗性（++）、對(duì)分離菌的5種功能基因的分布及拮抗檢測(cè)結(jié)果見表4。

表2 不同生態(tài)小區(qū)土樣放線菌組成

18株稀有放線菌中，有14株菌含有1種以上的功能基因，其中的9株菌含有I型PKS基因，4株菌含有II型PKS基因，3株菌含有NRPS基因，4株菌含有APH基因，沒有檢測(cè)到HMG-COA基因。有一株鏈孢囊菌含有4種功能基因，有合成多種抗生素的潛力。I型PKS在稀有放線菌中的分布較為普遍，在這18株菌能占到有50%的比例，有產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯類和聚醚類等抗生素的潛力。HMG-COA基因在這18株菌中沒有檢測(cè)到，可能不具有產(chǎn)生異戊二烯化合物的潛力，通過檢測(cè)，可以為有針對(duì)性的篩選產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物稀有放線菌提供指導(dǎo)。

表3 不同生態(tài)小區(qū)物種的多樣性

觀察放線菌的拮抗效果［22］。菌株47017、47029、47035和47037對(duì)金黃色葡萄球菌有強(qiáng)的拮抗活性，菌株47004和47011對(duì)金黃色葡萄球菌有弱拮抗活性。18株菌對(duì)大腸桿菌沒有拮抗活性。菌株47017對(duì)棉花黃萎病原菌有拮抗活性，菌株47029對(duì)棉花枯萎病原菌和棉花黃萎病原菌都有拮抗活性，其它菌株沒有拮抗3種植物病原真菌的活性。以含APH基因的47029菌株拮抗種類最多，表現(xiàn)出了廣譜抗菌活性。有4株含有PKSⅠ型基因的菌對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出拮抗性，菌株所含基因種類與其對(duì)病原菌拮抗性效果見表4。

表4 五種功能基因在18株稀有放線菌中的分布及菌株的拮抗效果檢測(cè)

3 討論

從分離結(jié)果來看，幾個(gè)樣點(diǎn)的稀有放線菌種類較多。一些產(chǎn)生物活性物質(zhì)的重要菌源，如小單孢菌、馬杜拉放線菌、諾卡氏菌等都能分離到。但從分離的角度講，由于本研究采樣點(diǎn)集中于塔里木河沿線地區(qū)及塔中地區(qū)，涉及生態(tài)區(qū)域僅占整個(gè)盆地1/3左右（共計(jì)13個(gè)生態(tài)小區(qū)）。加之實(shí)驗(yàn)雖選用了一些分離效率比較高的培養(yǎng)基，但實(shí)際上很多稀有放線菌培養(yǎng)條件特殊［23］。因此，本實(shí)驗(yàn)可能無法分離到一些特殊的微生物。研究者仍需要不斷拓展分離源和創(chuàng)新分離手段來開發(fā)這些資源。

本次分離菌株含有較為豐富PKS、NRPS及APH基因，基因分布以PKS I型最多，未檢出HMGCoA還原酶基因。PKS I型基因陽性率為50%，II型PKS為22.2%，NRPS為16.7%，APH為22.2%。除PKS I型基因外，其它基因檢出率與已報(bào)道鏈霉菌的檢出率相當(dāng)［24］。有的菌株同時(shí)含有多種功能基因（如鏈孢囊菌），因而可能產(chǎn)生不同的抗菌或細(xì)胞毒活性物質(zhì)，從這一層面講，本研究所分離的放線菌菌群具有更為復(fù)雜的多樣性。此外，兩株親緣關(guān)系極近的菌株47010、47037，含有不同的抗生素合成基因，這也說明，菌株的產(chǎn)活性物質(zhì)能力具有菌株特異性而非菌種特異性，通過分子檢測(cè)的手段可以忽略菌株之間的相似性而快速的分析菌株的產(chǎn)抗?jié)摿?。因此，分子檢測(cè)不僅能檢驗(yàn)菌株的產(chǎn)抗?jié)摿?，也是同一物種不同菌株間進(jìn)行細(xì)致分類的研究方法之一。

本研究基因和活性之間的關(guān)系不能一一對(duì)應(yīng)，如菌株47035雖然沒有抗生素合成基因，但具有拮抗金黃色葡萄球菌的活性。可能原因：一是，這些菌株產(chǎn)生其他種類的抗生素，而我們檢測(cè)的基因有限，出現(xiàn)“漏”篩。二是，PKS、NRPS等基因本身存在多樣性，同一種基因的表達(dá)也可能在結(jié)構(gòu)和活性上有差別。

此外，18株放線菌中有14株具有抗生素合成相關(guān)基因，但只有6株具有拮抗病原菌的活性，其可能原因：一是所選取靶標(biāo)種類較少，放線菌產(chǎn)生的抗生素對(duì)上述5種靶標(biāo)菌不具有拮抗性（但可能對(duì)其它靶標(biāo)菌具有作用），需要增加靶標(biāo)菌檢測(cè)；二是野生型的菌株可能只產(chǎn)生痕量的次級(jí)代謝產(chǎn)物，或者合成基因沉默表達(dá)，從而對(duì)靶標(biāo)菌不能表現(xiàn)出拮抗性；三是檢測(cè)培養(yǎng)基不合適。對(duì)于這些菌株，筆者認(rèn)為不能簡(jiǎn)單定義為“無用菌株”。因?yàn)樗鼈兺写渭?jí)代謝產(chǎn)物的合成基因簇。通過激活其次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因的表達(dá)，如摸索培養(yǎng)、發(fā)酵條件，找出抗生素合成基因表達(dá)的調(diào)控因素，或者通過基因操作如核糖體工程［25］等手段，激活潛在“有用”次級(jí)代謝產(chǎn)物相關(guān)基因表達(dá)，甚至通過誘變，使菌株突變產(chǎn)生新的化合物，都可能使其功能基因發(fā)揮作用。這也是分子手段篩選產(chǎn)抗生素菌的一項(xiàng)優(yōu)勢(shì)所在，不僅提高了篩選效率，也能充分挖掘潛在的有用菌源。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從塔里木盆地5個(gè)生態(tài)小區(qū)土樣中分離稀有放線菌，經(jīng)16S rRNA序列及形態(tài)分析，鑒定分離得18種菌株，其中塔里木北部壤質(zhì)荒漠生態(tài)小區(qū)菌種豐富度指數(shù)最大，為2.3821。通過擴(kuò)增分離菌株產(chǎn)抗生素相關(guān)基因I型PKS、II型PKS、NRPS、APH及HMG-CoA，并進(jìn)行電泳分析，有14株菌含有抗生素合成相關(guān)基因，其中4株含有多種基因。檢測(cè)分離菌株對(duì)5種主要?jiǎng)又参锊≡目咕钚?，?株具有拮抗活性。其中2株具有廣譜抗菌活性。本研究基因和活性之間關(guān)系并非一一對(duì)應(yīng)。