金永梅 陳莫軍 劉笑笑 林秀峰

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，長春 130124）

水稻是我國的重要糧食作物之一。水稻害蟲是水稻豐產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)的重要限制因子，每年給我國水稻生產(chǎn)造成的損失可占總產(chǎn)量的5%-10%，且有逐年加重之趨勢，其中鱗翅目害蟲是水稻生產(chǎn)危害最大的害蟲。至今，水稻中還未發(fā)現(xiàn)抗這類害蟲的種質(zhì)資源，因此通過常規(guī)育種方法很難培育出抗鱗翅目害蟲水稻，利用生物技術(shù)手段培育抗蟲水稻為解決上述問題提供了廣闊的前景。

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）能產(chǎn)生對多種昆蟲有害的殺蟲晶體蛋白（Insecticidalcrystal proteins，ICPs）。Bt殺蟲晶體蛋白（ICP）可特異性毒殺不同的昆蟲，包括鱗翅目、鞘翅目、雙翅目和螨類等害蟲，而對人畜無害，是目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因育種中主要使用的抗蟲蛋白。cry1C基因所編碼的Bt殺蟲蛋白可以抑制和殺死鱗翅目害蟲，是在野生型Cry1Ca5基因的基礎(chǔ)上通過序列優(yōu)化人工合成的抗蟲基因［1］。目前，利用生物技術(shù)手段將cry1C基因?qū)氲礁鞣N植物中，包括水稻［2-4］、大豆［5-6］、玉米［7-8］和油菜［9］等，成功獲得了對抗鱗翅目害蟲具有抗性的轉(zhuǎn)基因植物。

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外大量的轉(zhuǎn)基因植物已進入生物安全評價階段，部分產(chǎn)品已進入商業(yè)化階段。快速、精準、高通量的轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品檢測技術(shù)是轉(zhuǎn)基因生物安全管理的重要依據(jù)［10］。目前，轉(zhuǎn)基因作物中檢測蛋白的方法主要有Western Blot法和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等，很多研究團隊建立了依據(jù)這兩種方法的蛋白定性和定量檢測方法和體系［11-12］，而這些方法都需要目的蛋白抗體。市面上的cry1C抗體不僅價格昂貴，而且檢測cry1C轉(zhuǎn)基因水稻特異性不強。因此，cry1C抗體的制備在抗鱗翅目害蟲轉(zhuǎn)基因植物研究中發(fā)揮重要的作用。

本研究利用生物信息學(xué)方法預(yù)測cry1C蛋白的抗原表位并命名為Δcry1C，優(yōu)化Δcry1C核苷酸序列并進行人工合成，構(gòu)建原核表達載體pET28b（+）-Δcry1C，高效表達 His6-Δcry1C重組蛋白，制備cry1C兔多克隆抗體及驗證其特異性，旨在獲得價格低廉且特異性較強的cry1C多克隆抗體，為深入研究鱗翅目害蟲提供前提條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 轉(zhuǎn)cry1C基因抗蟲水稻由本實驗室創(chuàng)制或保存。

1.1.2 主要試劑 Taq DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、大腸桿菌感受態(tài)細胞均購自大連寶生物工程有限公司；植物蛋白提取試劑盒、ECL試劑盒均購自北京康為世紀生物公司；實驗引物和抗原表位區(qū)人工合成來自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1cry1C基因抗原表位預(yù)測及核苷酸序列的人工合成 根據(jù)已報道的cry1C核苷酸序列［1］推導(dǎo)氨基酸序列，利用TMHMMOL/L Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMMOL/L）及DNAstar軟件分析跨膜區(qū)、親水性、表面可及性及抗原性的預(yù)測，篩選cry1C蛋白的抗原表位區(qū)。在不改變抗原表位區(qū)氨基酸序列的前提下，根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏愛性，優(yōu)化抗原表位區(qū)核苷酸序列并命名為Δcry1C，委托上海生工生物人工合成，人工合成時5′端和3′端分別設(shè)計了NdeI和XhoI酶切位點。

1.2.2 原核重組表達載體構(gòu)建 以人工合成的Δcry1C抗原片段為模板，進行PCR擴增，引物序列為Δcry1C-F：5′-CATATGGTCGAAGCATTCAAGGA-3′（下劃線序列為NdeI酶切位點），Δcry1C-R：5′-CTCGAGTTATTTCTGCGCGCGTT-3′（ 下 劃 線 序列為XhoI酶切位點）。PCR產(chǎn)物與原核表達載體pET28b（+）質(zhì)粒用NdeI和XhoI進行雙酶切后用T4 DNA連接酶連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)菌株TOP10，篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒DNA，雙酶切確認片段大小。原核重組表達載體序列經(jīng)上海生工生物測序、比對分析驗證序列的正確性。

1.2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達與可溶性分析 將重組質(zhì)粒pET28b（+）-Δcry1C轉(zhuǎn)化到E.coli感受態(tài)細胞BL21（DE3），以0.5 mmol/L的IPTG，分別在20℃過夜和37℃誘導(dǎo)表達4 h，未加IPTG誘導(dǎo)劑的作為陰性對照。將離心收集的菌體用PBS緩沖液懸浮，冰浴下超聲破碎，在12 000 r/min、4℃條件下離心30 min，收集上清和沉淀。沉淀采用500 μL包涵體溶解液（8 mol/L Urea，50 mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，pH8.0）溶解。

上清液和溶解的包涵體分別與protein loading buffer混勻、沸水處理10 min，通過SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色液染色，觀察分析重組蛋白存在的部分。

1.2.4 重組表達蛋白的擴培、純化及鑒定 將含有重組質(zhì)粒pET28b（+）-Δcry1C的BL21（DE3）菌液進行擴增培養(yǎng)4 L，以 0.5 mmol/L的IPTG、37℃誘導(dǎo)表達4 h，離心收集細胞菌體。將收集的細菌菌體用破碎 Buffer（20 mmol/L PB，300 mmol/L NaCl，0.1%Triton X-100，1 mmol/L DTT，pH 8.0）溶解，冰浴中超聲破碎菌體，棄上清、取沉淀。將收集的沉淀用破碎 Buffer（8 mmol/L Urea，20 mmol/L PB，300 mmol/L NaCl，0.1% TritonX-100，1 mmol/L DTT，pH 8.0）溶解，冰浴中超聲破碎菌體，離心后取上清。His6-Δcry1C重組蛋白采用鎳瓊脂糖親和層析方法進行純化，重組蛋白經(jīng)過0.45 μm濾膜之后上樣于Ni-NTA Spin Columns親和層析柱結(jié)合1 h，重復(fù)過柱3次，用 Wash buffer（20 mmol/L/50 mmol/L Imidazole，8 mmol/L Urea，20 mmol/L PB，300 mmol/L NaCl，0.1% TritonX-100，1 mmol/L DTT，pH 8.0） 洗 雜 4次，經(jīng)不同濃度的 Imidazole Elution buffer（20/50/500 mmol/L Imidazole，8 mmol/L Urea，20 mmol/L PB，300 mmol/L NaCl，pH 8.0）洗脫。將純度較好的500 mmol/L Imidazole洗脫組分透析至10 mmol/L PBS，0.1% SKL，pH 8.0中，濃縮，過濾除菌，保存于-80℃。

1.2.5 cry1C兔多克隆抗體血清的制備 將純化后的His6-Δcry1C重組蛋白與弗氏完全佐劑混合，分別對4只4月齡新西蘭大白兔按常規(guī)免疫周期進行免疫注射。共注射4次，一免后的第21天、第35天和第49天分別為二免、三免和四免時期。一免用0.3mg重組蛋白與等體積弗氏完全佐劑混合進行，二免、三免和四免用0.15 mg重組蛋白與等體積弗氏完全佐劑混合后進行加強免疫注射。三免和四免后7-10 d從兔耳緣靜脈取血1 mL，采用抗體間接ELISA法測定抗體滴度?？寡逍r達到要求后，采集頸動脈全血，血樣先沉淀提純血清，血清進行抗原抗體親和純化。

1.2.6 抗cry1C血清效價的測定 利用間接ELISA法測定抗體效價，以免疫前兔血清作為陰性對照。將His6-Δcry1C抗原蛋白用0.05 mol/L的碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）稀釋成2 ng/μL后，包被酶標板，4℃孵育過夜后用PBST溶液洗滌酶標板。用5% 脫脂奶粉封閉液，37℃封閉60 min，用PBST（0.05%Tween-20）洗板。將抗cry1C血清分別按照梯度稀釋后，每個梯度設(shè)置3次重復(fù)，37℃孵育酶標板60min，用PBST洗板。用HRP標記的羊抗兔二抗，37℃孵育45 min，用PBST洗滌。加入底物TMB顯色液反應(yīng)15 min，加入終止液終止反應(yīng)。在450 nm波長下測定OD值，計算平均值，將OD陽性/OD陰性≥ 2.1時所對應(yīng)的最高稀釋倍數(shù)作為抗cry1C血清效價。

1.2.7 cry1C多克隆抗體的特異性分析 cry1C抗體用Western Blot方法進行特異性分析。利用植物蛋白提取試劑盒提取cry1C抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻葉片總蛋白，測定濃度。將20 μg總蛋白用10% SDS-PAGE進行電泳。用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜（Hybond-NC）之后，用5%脫脂乳在37℃封閉1 h。1∶2 000稀釋的cry1C抗體在4℃孵育12 h，用1∶5 000稀釋的HRP標記的羊抗兔二抗在37℃孵育1 h，用ECL 化學(xué)發(fā)光顯色在X-光片上。

2 結(jié)果

2.1 cry1C蛋白抗原表位預(yù)測

根據(jù)已報道的抗鱗翅目害蟲Bt基因cry1C的核苷酸序列推導(dǎo)氨基酸序列并進行該蛋白的跨膜區(qū)、親水性、表面可及性及抗原性指數(shù)預(yù)測。TMHMMOL/L Server v.2.0跨膜預(yù)測結(jié)果表明cry1C的N端第1-43個氨基酸位于膜內(nèi)，第44-66氨基酸肽鏈包含一個跨膜區(qū)，第67-630個氨基酸位于膜外，N端跨膜區(qū)可能會使得cry1C的表達受阻（圖1-A）。運用DNAstar-Protean軟件預(yù)測結(jié)果（圖1-B）表明：cry1C蛋白親水性區(qū)段分布較廣，第37-69個氨基酸為疏水區(qū)，其余區(qū)段為親水區(qū)；cry1C蛋白表面可及性結(jié)果表明，N端32-109個氨基酸位置表面可及性小，表面可及性大的位置主要位于117-126、189-263、345-353、412-429和517-532區(qū)段，蛋白表面可及性較大的區(qū)段易于接觸溶劑分子，出現(xiàn)抗原表位的可能性較大；線性抗原性指數(shù)預(yù)測結(jié)果表明，cry1C蛋白存在大量潛在抗原表位位點，可能的抗原表位區(qū)域為第110-630個氨基酸區(qū)段。綜合分析跨膜區(qū)、親水性、抗原性指數(shù)預(yù)測結(jié)果，去掉N端存在的跨膜區(qū)和疏水區(qū)以免表達受阻，可能的抗原表位區(qū)為第110-630氨基酸，該區(qū)段確定為抗原表位區(qū)并命名為Δcry1C。

2.2 重組表達載體pET28b（+）-Δcry1C的構(gòu)建

抗原表位區(qū)Δcry1C的氨基酸序列長度為520 aa、理論分子量大小為58.8 kD。在不改變抗原表位區(qū)氨基酸序列的前提下，根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏愛性，優(yōu)化抗原表位區(qū)核苷酸序列，并進行人工合成，該序列長度為1 578 bp（圖2-A）。Δcry1C序列與原cry1C核苷酸序列的同源性為75%，與氨基酸序列的同源性為100%。

圖1 抗原表位區(qū)預(yù)測

抗原片段核苷酸序列Δcry1C插入到原核表達載體pET28b（+）的NdeI和XhoI酶切位點，構(gòu)建pET28b（+）-Δcry1C重組表達載體。將重組表達載體質(zhì)粒用NdeI和XhoI進行雙酶切，分別獲得了5 368 bp 和1 578 bp的載體片段和Δcry1C抗原片段，與預(yù)期片段大小一致（圖2-B）。測序結(jié)果表明抗原片段Δcry1C已正確插入到pET28b（+）載體中。

圖2 重組表達載體pET28b（+）-Δcry1C的構(gòu)建

2.3 His6-Δcry1C重組蛋白的誘導(dǎo)表達及純化

將重組質(zhì)粒pET28b（+）-Δcry1C轉(zhuǎn)化到E.coli感受態(tài)細胞 BL21（DE3），以 0.5 mmol/L的IPTG，分別在20℃過夜和37℃條件下4 h誘導(dǎo)表達。上清液和包涵體進行SDS-PAGE分析，結(jié)果（圖3-A）在包涵體中獲得了60 kD左右的重組蛋白，其表達量高、蛋白大小與預(yù)期大小一致，可確定該蛋白就是His6-Δcry1C重組蛋白，說明該重組蛋白在大腸桿菌包涵體中成功表達。

將含有重組質(zhì)粒pET28b（+）-Δcry1C的BL21（DE3）菌液進行擴增培養(yǎng)之后，以 0.5 mmol/L的IPTG、37℃誘導(dǎo)表達4 h。將收集的細菌菌體用包涵體破碎Buffer溶解，冰浴中超聲破碎菌體，經(jīng)濾膜過濾后采用鎳瓊脂糖親和層析方法進行純化、透析。純化后的重組蛋白用SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)在相應(yīng)位置出現(xiàn)明顯條帶，得到了60 kD的His6-Δcry1C重組蛋白（圖3-B）。

2.4 cry1C兔多克隆抗體的制備

純化的His6-Δcry1C重組蛋白為抗原免疫對新西蘭大白兔制備多克隆抗體。三免和4免后7 d，從兔耳緣靜脈取血1 mL，經(jīng)間接ELISA法測定抗體效價（圖4-A），結(jié)果表明4只不同免疫兔（A、B、C和D）抗體效價均在1∶512 000以上，達到了要求。采集頸動脈全血，血樣先沉淀提純血清，將血清進行抗原抗體親和純化。

圖3 His6-Δcry1C重組蛋白的誘導(dǎo)表達及純化

為了檢測cry1C多克隆抗體的特異性，提取cry1C轉(zhuǎn)基因水稻葉片總蛋白，采用Western Blot方法檢測目的蛋白cry1C的表達情況。結(jié)果（圖4-B）獲得71 kD左右的明顯條帶，與預(yù)期條帶大小一致，說明制備的cry1C多克隆抗體具有cry1C蛋白特異性，能夠準確檢測cry1C蛋白。

3 討論

目前，利用生物技術(shù)手段將cry1C基因?qū)氲礁鞣N植物中，獲得了多種抗鱗翅目害蟲轉(zhuǎn)基因植物［2-9］。這些轉(zhuǎn)基因植物的蛋白定量和定性檢測都需要cry1C抗體。目前，鄭曉東等［13］、倪庚等［14］制備了cry1C兔單克隆抗體；林智敏等［15］制備了水稻密碼子優(yōu)化的cry1Ca多克隆抗體；張麗萍等［16］優(yōu)化改造基因序列并構(gòu)建和鑒定了cry1C重組表達載體，但尚未應(yīng)用在cry1C轉(zhuǎn)基因植物的檢測上。

本研究根據(jù)已報道的cry1C基因序列，通過TMHMMOL/L Server v.2.0和DNAstar軟件綜合分析跨膜區(qū)、親水性、抗原性指數(shù)［17-19］，預(yù)測了該蛋白的抗原表位區(qū)。為了避免原核表達過程中受阻和不易形成抗原表位去掉了N端跨膜區(qū)109個氨基酸，其余非跨膜區(qū)段確定為抗原表位區(qū)。在保持原氨基酸序列不變的情況下，根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏愛性，優(yōu)化改造核苷酸序列，構(gòu)建重組表達載體，經(jīng)過誘導(dǎo)表達獲得了預(yù)期大小的、高效表達的His6-Δcry1C重組蛋白，但重組蛋白主要以包涵體形式存在。盡管為了高效表達和避免包涵體的形成，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性的優(yōu)化改造序列、優(yōu)化誘導(dǎo)表達條件（溫度、時間、IPTG濃度等），但效果不理想。在宿主系統(tǒng)中高效表達外源重組蛋白時，形成包涵體是一種普遍現(xiàn)象，主要原因是當(dāng)外源蛋白高水平表達時由于合成速度過快，沒有足夠的時間進行正確折疊或缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子造成［20］。本研究中包涵體經(jīng)過8M 尿素溶解液進行溶解、Ni-NTA親和層析柱純化、透析復(fù)姓、濃縮獲得了純度較高的His6-Δcry1C重組蛋白。

圖4 抗cry1C血清效價及抗體特異性檢測

以His6-Δcry1C重組蛋白為抗原，免疫新西蘭大白兔、分離并純化兔多抗血清。利用間接ELISA法測定抗體效價，結(jié)果表明cry1C兔多克隆抗體效價達到了1∶512 000。Western Blot分析結(jié)果表明cry1C兔多克隆抗體對cry1C轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻具有較強的特異性。雖然多克隆抗體比單克隆抗體特異性差，但具有制備方法簡單、制備時間短、成本低等優(yōu)點。因此，制備特異性強、效價高的多克隆抗體可以彌補單克隆抗體制備時間長、成本高等的缺點。本研究中的cry1C抗體可應(yīng)用于cry1C轉(zhuǎn)基因植物表達的cry1C蛋白的定性或定量檢測，包括ELISA，Western Blot，IP/ChIP等免疫學(xué)手段，為深入研究抗鱗翅目害蟲植物具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究生物信息學(xué)方法預(yù)測cry1C的抗原表位區(qū)，優(yōu)化并人工合成抗原序列Δcry1C，構(gòu)建原核表達載體。在大腸桿菌中原核表達，純化His6-Δcry1C重組蛋白，免疫兔子獲得cry1C多克隆抗體，其效價可達1∶512 000。采用Western Blot方法檢測cry1C轉(zhuǎn)基因水稻的目的蛋白結(jié)合，特異性較高。