張騰國(guó) 史中飛 寇明剛 鄭晟 王娟

（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070）

非生物脅迫如鹽、干旱、冷等都能影響植物生長(zhǎng)發(fā)育。為了保護(hù)自身免受不利條件的傷害，植物已經(jīng)發(fā)展出許多生理、細(xì)胞和分子機(jī)制［1］。研究得最深入的保護(hù)機(jī)制之一為脯氨酸代謝。植物中的應(yīng)激反應(yīng)通常伴隨著脯氨酸在不同組織中的積累［2］。累積的脯氨酸可以作為細(xì)胞內(nèi)滲透劑［3］、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）清除劑［4］、細(xì)胞結(jié)構(gòu)維持者［5］和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，引發(fā)多種應(yīng)激反應(yīng)途徑［6］。在植物體中，已知有兩條途徑合成脯氨酸，一條為谷氨酸途徑，另一條為鳥氨酸途徑［7-8］，而谷氨酸衍生的途徑是植物在脅迫條件下合成脯氨酸的主要途徑［9］。在谷氨酸衍生途徑中，谷氨酸被Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS）還原為 γ-谷氨酸半醛（GSA），然后GSA環(huán)化自身形成P5C［10］。在這一途徑中，P5CS是關(guān)鍵酶，同時(shí)它也是一個(gè)雙功能酶，在其N端與谷氨酰激酶（γ-GK）同源，C端與谷氨酸-γ-半醛脫氫酶（GSA）同源，這使得P5CS同時(shí)具有這兩種酶的活性。P5CS可直接催化谷氨酸生成GSA，且經(jīng)研究表明，在滲透脅迫下，植物體內(nèi)的脯氨酸積累水平主要受P5CS的影響，該酶是植物合成脯氨酸的關(guān)鍵酶，其活性受到脯氨酸的反饋調(diào)節(jié)［11］。

目前已經(jīng)從擬南芥［12］、蒺藜苜蓿［13］、紫花苜蓿［14］、番茄［15］、菜豆［16］、高粱［17］及番木瓜［18］等不同植物中克隆出了P5CS基因。研究表明，擬南芥P5CS基因受到干旱、鹽堿和ABA等脅迫的誘導(dǎo)［11］。油菜中P5CS1和P5CS2受到 ABA、NaCl、PEG的誘導(dǎo)［19］。干旱脅迫條件下轉(zhuǎn)VaP5CS基因的轉(zhuǎn)基因煙草脯氨酸及生物量的積累明顯高于非轉(zhuǎn)基因煙草［20］。同樣，馬鈴薯、水稻、小麥中過(guò)量表達(dá)P5CS明顯增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量以及脅迫耐受能力［21-23］。因此，P5CS基因在調(diào)控植物體內(nèi)脯氨酸的合成、提高植物抵御逆境脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。

檸條錦雞兒（Caragana korshinskii）是豆科錦雞兒屬旱生植物，在中國(guó)分布于內(nèi)蒙古西部、陜西北部及寧夏等地區(qū)。檸條錦雞兒抗逆性強(qiáng)，能耐低溫及酷熱，具有防風(fēng)固沙、保土蓄水、改良和維持生態(tài)環(huán)境及調(diào)節(jié)小氣候等作用，是荒漠、荒漠草原地帶植樹造林和防風(fēng)固沙的先鋒樹種。目前，檸條錦雞兒P5CS基因的克隆與功能研究還未見報(bào)道。本研究從檸條錦雞兒中分離脯氨酸合成關(guān)鍵酶基因P5CS的全長(zhǎng)cDNA序列，分析該基因的序列特征、進(jìn)化關(guān)系和不同脅迫誘導(dǎo)下的表達(dá)模式，旨在為利用該基因改良荒漠植物的抗逆境脅迫能力和指導(dǎo)荒漠地區(qū)植被建設(shè)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

挑選籽粒飽滿、大小均勻的檸條錦雞兒種子分別播種到MS培養(yǎng)基中，在溫度為25℃，光照強(qiáng)度130 μmol·m-2·s-1，光照時(shí)間為 16 h 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4周，待檸條錦雞兒植株長(zhǎng)至10 cm左右，轉(zhuǎn)入不同條件進(jìn)行不同種類的非生物脅迫。

1.1.1 鹽脅迫 用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配制的不同濃度的NaCl溶液（0 mol/L、0.05 mol/L、0.1 mol/L、0.15mol/L和0.2 mol/L）浸泡同批生長(zhǎng)的檸條錦雞兒植株，48 h后分別剪取不同處理的檸條錦雞兒葉片，提取RNA并測(cè)定脯氨酸的含量。

1.1.2 低溫脅迫 將同批生長(zhǎng)的檸條錦雞兒植株苗置于4℃環(huán)境進(jìn)行不同時(shí)間段（0 h、12 h、24 h、36h和48 h）處理，分別剪取不同處理的檸條錦雞兒葉片用于RNA的提取。

1.1.3 PEG滲透脅迫 用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配制不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG-6000溶液（0%、5%、10%、15%和20%）來(lái)模擬不同的干旱程度，處理48 h后剪取不同處理的檸條錦雞兒葉片，提取RNA。

1.2 方法

1.2.1 檸條錦雞兒P5CS基因的克隆P5CS基因中間片段克隆，利用Trizol試劑進(jìn)行檸條錦雞兒葉片總RNA的提取，以提取的RNA為模板，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行合成第一鏈cDNA。通過(guò)GenBank查找下載已經(jīng)克隆得到的植物P5CS基因序列，進(jìn)行序列對(duì)比，根據(jù)比對(duì)的結(jié)果，在相對(duì)保守的區(qū)域設(shè)計(jì)了5對(duì)簡(jiǎn)并引物CkP5CSU1、CkP5CSD1；CkP5CSU2、CkP5CSD2；CkP5CSU3、CkP5CSD3；CkP5CSU4、CkP5CSD4；CkP5CSU5、CkP5CSD5（表1），每對(duì)引物預(yù)期擴(kuò)增序列有部分重疊。以檸條錦雞兒反轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA為模板，按照Premix Ex Taq DNA Polymerase的反應(yīng)要求說(shuō)明用25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：模板：1 μL，上下游引物：各1 μL，Premix Ex Taq酶：12.5 μL，ddH2O ：9.5 μL，總體積 ：25 μL。擴(kuò)增結(jié)束后，用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳電泳，依據(jù)離心柱型EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收試劑盒方法回收，回收產(chǎn)物連接pTG19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)，隨機(jī)挑取若干白斑菌落進(jìn)行PCR及酶切鑒定，將鑒定合適的陽(yáng)性克隆送華大基因公司測(cè)序。

RACE方法克隆P5CS基因全長(zhǎng)，以提取到的檸條錦雞兒總RNA為模板，按照3′-Full RACE Core Set Ver.2.0（TaKaRa公司）的操作說(shuō)明進(jìn)行3′-RACE擴(kuò)增反應(yīng)，根據(jù)已得到的檸條錦雞兒P5CS的序列片段設(shè)計(jì)基因特異性引物3′RU1和3′RU2（表1），總RNA的反轉(zhuǎn)錄依據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用引物3′RU1和試劑盒中自帶的引物3′RACEO（TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT）進(jìn)行一擴(kuò)PCR，以一擴(kuò)PCR產(chǎn)物為模板，用引物3′RU2和試劑盒自帶引物 3′RACEI（CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG）進(jìn)行二擴(kuò)PCR。擴(kuò)增產(chǎn)物用普通瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，連接入pTG19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行測(cè)序。按照5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0的操作說(shuō)明進(jìn)行5′-RACE的擴(kuò)增，根據(jù)克隆的檸條錦雞兒P5CS基因中間片段序列設(shè)計(jì)基因特異性上游引物 5′RD1 和 5′RD2（表 1）。按照試劑盒操作說(shuō)明將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，用引物5′RD1和試劑盒自帶上游引物AAP（GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG）進(jìn)行一擴(kuò)PCR，以一擴(kuò)PCR產(chǎn)物為模板，用引物5′RD2和試劑盒自帶上游引物AUAP進(jìn)行二擴(kuò)PCR。將產(chǎn)物純化后與pTG19-T載體連接，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α后篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 檸條錦雞兒P5CS預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析 用DNAStar軟件Megalign模塊中的ClustalW方法進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)及保守序列分析；應(yīng)用蛋白在線分析工具TopPred（http://mobyle.pasteur.fr/cgibin/port-al.py？#forms：：toppred）對(duì)預(yù)測(cè)蛋白進(jìn)行疏水性和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析；利用SOPMA（http://www.expasy.org/resources）在線軟件對(duì)預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；應(yīng)用SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）對(duì)預(yù)測(cè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.2.3 檸條錦雞兒P5CS基因的組織特異性表達(dá)檢測(cè) 剪取長(zhǎng)勢(shì)一致的檸條錦雞兒根、莖、葉不同組織部位，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，檢測(cè)檸條P5CS基因在不同組織中的表達(dá)量。

1.2.4 逆境對(duì)檸條錦雞兒P5CS基因的轉(zhuǎn)錄水平影響 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的檸條經(jīng)不同逆境處理后對(duì)P5CS基因表達(dá)進(jìn)行分析，從不同逆境處理后檸條葉片中提取RNA，以反轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA 為模板，分別以 ActinF（AF）、ActinR（AR）為管家基因引物，以P5CSDL-U、P5CSDL-D為檸條P5CS基因的引物，依據(jù)寶生物工程公司的SYBR Premix Ex TaqTM說(shuō)明操作進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火20 s，40個(gè)循環(huán)；55-95℃每30s漸進(jìn)升高0.5℃，81個(gè)循環(huán)。利用2-△△Ct方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，確定CkP5CS基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 游離脯氨酸含量的測(cè)定 依據(jù)酸性茚三酮染色法測(cè)定脅迫處理后脯氨酸的含量。稱取鹽脅迫處理的檸條葉片各0.5 g，加入2 mL 3%的磺基水楊酸充分研磨，沸水浴10 min，15 000 r/min，離心15min，后取上清液0.25 mL，加入3 %的磺基水楊酸0.75 mL，1 mL冰醋酸和2 mL 2.5%的茚三酮，95℃水浴1 h，然后用4 mL甲苯萃取2 h，以甲苯溶液為空白對(duì)照，測(cè)OD520。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 測(cè)得的數(shù)據(jù)用SPSS 17.0進(jìn)行分析，用Origin 9.0進(jìn)行做圖。

2 結(jié)果

2.1 檸條錦雞兒P5CS基因的克隆與序列分析

將GenBank網(wǎng)站公布的已經(jīng)克隆得到的植物P5CS基因CDS區(qū)序列下載后，用DNAstar軟件MegAlign分析模塊進(jìn)行序列同源性對(duì)比，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，設(shè)計(jì)了5對(duì)兼并性引物。以檸條葉片組織中提取出來(lái)的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，擴(kuò)增得到了5條大小分別為為663、544、507、417和363 bp的條帶，測(cè)序后用序列拼接軟件進(jìn)行拼接得到一條長(zhǎng)度為1 962 bp的序列片段，與其它植物的P5CS基因序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與大豆GmP5CS的同源性較高，表明該擴(kuò)增產(chǎn)物是檸條P5CS基因片段。3′RACE 用 TaKaRa公司的 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒擴(kuò)增得到了757 bp左右大小的片段，經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該序列5′端序列與前面擴(kuò)增得到檸條P5CS基因中間片段的3′端序列完全相重疊，說(shuō)明3′RACE擴(kuò)增得到的片段與之前克隆得到的部分片段為同一條基因。5′RACE按照Invitrogen公司5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0試劑盒擴(kuò)增得到了一個(gè)305 bp大小的片段。測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該片段3′與前面擴(kuò)增得到的檸條P5CS基因中間片段的5′端序列完全重疊，說(shuō)明5′RACE擴(kuò)增得到的片段與之前克隆得到的中間片段為同一條基因的。

表1 PCR引物序列

利用軟件將擴(kuò)增的中間片段和RACE擴(kuò)增的5′端序列和3′端序列進(jìn)行拼接，得到一條全長(zhǎng)為2 604 bp的基因序列（圖1），包含一個(gè)2 139 bp的開放閱讀框（ORF），編碼的蛋白質(zhì)含712個(gè)氨基酸，分子量為76.8 kD，等電點(diǎn)為8.6。起始密碼子ATG前5′非翻譯區(qū)（5′UTR）長(zhǎng)102 bp，終止密碼子TAA后面有一段363 bp的3′非翻譯區(qū)（3′UTR），包含11 bp polyA。為了進(jìn)一步確定以上P5CS基因部分?jǐn)U增片段，以及5′RACE和3′RACE擴(kuò)增片段屬于同一基因，依據(jù)3′RACE和5′RACE擴(kuò)增得到的序列設(shè)計(jì)上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到的片段經(jīng)序列比對(duì)，與拼接序列的堿基完全一致。

將GenBank中公布的已經(jīng)克隆得到的植物P5CS序列，用DNAStar軟件中Megalign模塊的ClustalW法進(jìn)行氨基酸序列的比對(duì)。結(jié)果（圖2）表明，CkP5CS蛋白與許多植物的P5CS蛋白具有較高的相似度，其中與大豆GmP5CS（XM_006573245）、蒺藜苜蓿MtP5CS（XM_013599503）、白刺花SdP5CS（JX307643）、豇豆VuP5CS（AB056452）的相似度分別為84.2%、82.3%、85.1%和82.6%。

檸條錦雞兒CkP5CS基因推測(cè)的氨基酸序列的保守區(qū)域與大豆GmP5CS、蒺藜苜蓿MtP5CS、白刺花SdP5CS、豇豆VuP5CS基因推測(cè)的氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域一致，含有以下5個(gè)主要功能域：ATP結(jié)合位點(diǎn)、谷氨酸激酶結(jié)構(gòu)域、谷氨酸-γ-半醛脫氫酶（GSADH）結(jié)構(gòu)域、一個(gè)假想的亮氨酸結(jié)構(gòu)域及NAD（P）H結(jié)構(gòu)域（圖2）。CkP5CS基因編碼產(chǎn)物的這些特征表明，該基因所控制編碼的氨基酸是典型的植物二氫吡咯-5-羧酸合成酶，CkP5CS可能在檸條錦雞兒脯氨酸合成途徑中起作用。

應(yīng)用蛋白在線分析工具TopPred對(duì)CkP5CS預(yù)測(cè)蛋白進(jìn)行疏水性和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示該預(yù)測(cè)蛋白為親水蛋白結(jié)構(gòu)，有6個(gè)不確定的跨膜結(jié)構(gòu)域（圖3-A）；利用SOPMA在線軟件對(duì)CkP5CS預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖3-C）顯示，檸條CkP5CS預(yù)測(cè)蛋白包含38.34%的α-螺旋（Alpha helix）、25.7% 的延伸鏈（Extended strand）、9.41% 的 β-轉(zhuǎn)角（Beta turn）和26.54%的無(wú)規(guī)則卷曲（Random coil）。應(yīng)用SWISS-MODEL對(duì)CkP5CS蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，SWISS-MODEL只預(yù)測(cè)了同源性部分（氨基酸殘基范圍：291-711）的模型，已經(jīng)預(yù)測(cè)出的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型（圖3-B）顯示，該蛋白為P5CS。

圖1 檸條錦雞兒CkP5CS全長(zhǎng)序列及預(yù)測(cè)氨基酸序列

2.2 檸條錦雞兒CkP5CS基因組織特異性表達(dá)檢測(cè)

從長(zhǎng)勢(shì)一致的檸條錦雞兒植株根、莖、葉中提取RNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，結(jié)果（圖4）表明，CkP5CS基因在其根、莖、葉中均有表達(dá)，其中葉中的表達(dá)量最高；其次是根，在莖中的表達(dá)量最低。

2.3 逆境脅迫下CkP5CS基因轉(zhuǎn)錄水平實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果分析

低溫脅迫下實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5）表明，檸條錦雞兒CkP5CS基因的表達(dá)量受低溫脅迫（4℃）誘導(dǎo)。在4℃處理12 h、24 h、36 h及48 h后，CkP5CS基因的轉(zhuǎn)錄水平較對(duì)照組分別提高了1.753、3.032、2.297及2.621倍，表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。在低溫脅迫時(shí)間達(dá)到24 h時(shí)，CkP5CS基因的轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最大值，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，CkP5CS基因的轉(zhuǎn)錄水平有所下降，但仍然高于對(duì)照組，說(shuō)明在較長(zhǎng)時(shí)間的低溫冷脅迫下，CkP5CS基因的表達(dá)能力有所下降，但是對(duì)于低溫脅迫依舊有所響應(yīng)。

鹽脅迫下實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖6）表明，檸條錦雞兒CkP5CS基因的表達(dá)量受鹽脅迫的誘導(dǎo)。在濃度為0.05、0.1、0.15及0.2 mol/L的NaCl溶液處理后，CkP5CS基因的轉(zhuǎn)錄水平較對(duì)照組分別提高了1.221、3.042、1.121及0.526倍，呈現(xiàn)出現(xiàn)上升后下降的趨勢(shì)。在0.1 mol/LNaCl脅迫下，CkP5CS基因的轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最大值，隨著鹽脅迫濃度的升高，CkP5CS基因的轉(zhuǎn)錄水平逐漸降低，在0.2 mol/LNaCl脅迫時(shí)，其表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的0.526，結(jié)果表明CkP5CS基因表達(dá)受到低濃度鹽脅迫的誘導(dǎo)，高濃度的鹽脅迫抑制其表達(dá)。

圖2 CkP5CS與其它植物P5CS氨基酸序列比對(duì)

PEG滲透脅迫下實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖7）表明，檸條錦雞兒CkP5CS基因的表達(dá)量受PEG滲透脅迫的誘導(dǎo)。在濃度為5%、10%、15%、20%的PEG6000溶液處理后，CkP5CS基因的轉(zhuǎn)錄水平較對(duì)照組分別上升了1.319、2.346、3.473和4.889倍，隨著PEG6000濃度的增加，CkP5CS基因的轉(zhuǎn)錄水平也在隨之上升，在20%的PEG6000溶液處理下，CkP5CS基因的轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最大。說(shuō)明CkP5CS基因的表達(dá)對(duì)PEG滲透脅迫的誘導(dǎo)較為敏感，且滲透脅迫程度越大其表達(dá)越明顯。

圖3 CkP5CS蛋白結(jié)構(gòu)分析

圖4 CkP5CS基因組織特異性表達(dá)分析

圖5 低溫脅迫下CkP5CS基因的表達(dá)量

2.4 鹽脅迫下檸條錦雞兒中脯氨酸含量的變化

脯氨酸的含量受鹽脅迫的誘導(dǎo)，在0.05、0.1、0.15和0.2 mol/L的NaCl處理下，檸條錦雞兒中脯氨酸的含量與對(duì)照組相比分別提高了73.77%、78.69%、349.58%、414.56%，差異達(dá)到顯著水平（*P＜0.05）（圖8）。表明鹽脅迫條件下通過(guò)脯氨酸的積累穩(wěn)定細(xì)胞自身結(jié)構(gòu)，降低活性氧積累帶來(lái)的損傷。

圖6 鹽脅迫下CkP5CS基因的表達(dá)量

圖7 PEG滲透脅迫下CkP5CS基因的表達(dá)量

圖8 鹽脅迫過(guò)程中檸條錦雞兒脯氨酸含量的變化

3 討論

植物在遭遇逆境脅迫時(shí)，通過(guò)主動(dòng)積累小分子滲透物質(zhì)來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)滲透壓的平衡。脯氨酸是典型的小分子滲透物質(zhì)，它能夠穩(wěn)定細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞原生質(zhì)層的濃度防止細(xì)胞失水，平衡細(xì)胞的滲透壓使細(xì)胞能夠進(jìn)行正常的生理生化反應(yīng)。在植物受到滲透脅迫時(shí)，植物體內(nèi)的脯氨酸含量會(huì)大幅度的增加。因此，脯氨酸的積累有利于細(xì)胞自身結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，而且能夠降低活性氧積累帶來(lái)的損傷。而P5CS則是植物體內(nèi)催化谷氨酸途徑合成脯氨酸過(guò)程中的限速酶，在脯氨酸的合成過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。本研究中利用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)從檸條錦雞兒中克隆得到了CkP5CS基因，該基因預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)序列與已知的其它植物該基因的預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)序列有很高的相似性，說(shuō)明CkP5CS基因在物種進(jìn)化上具有很高的保守性。CkP5CS具有高等植物中P5CS蛋白質(zhì)具有的5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域：NADPH結(jié)合位點(diǎn)、ATP結(jié)合位點(diǎn)、谷氨酰激酶（GK）結(jié)構(gòu)域、亮氨酸結(jié)構(gòu)域、谷氨酸半醛（GSA）結(jié)構(gòu)域，預(yù)測(cè)出的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型顯示，該蛋白符合Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶三維結(jié)構(gòu)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果表明，CkP5CS基因在檸條錦雞兒的根、莖、葉中均表達(dá)。此外，CkP5CS基因受低溫和PEG滲透脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，與甜高粱［24］、番木瓜［18］和擬南芥［11］P5CS基因的表達(dá)模式相同。說(shuō)明同一類植物的P5CS基因能夠響應(yīng)不同的逆境脅迫，而不同植物的P5CS基因也能受到同一種脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。

檸條錦雞兒CkP5CS基因的表達(dá)受鹽脅迫的誘導(dǎo)，隨著鹽脅迫濃度的升高，CkP5CS基因的表達(dá)呈現(xiàn)出現(xiàn)上升后下降的趨勢(shì)。而檸條錦雞兒植株中脯氨酸的含量同樣受到鹽脅迫的誘導(dǎo)，隨著鹽脅迫濃度的升高，脯氨酸的含量呈上升趨勢(shì)。但CkP5CS基因的表達(dá)的變化與脯氨酸的含量的變化趨勢(shì)不一致，0.15 mol/L、0.2 mol/L鹽處理下脯氨酸的含量增加而CkP5CS基因的表達(dá)量下降。Hong等［25］研究表明P5CS基因在植物中催化脯氨酸的生物合成反應(yīng)中，Pro合成不僅受到P5CS的轉(zhuǎn)錄激活的調(diào)節(jié)，還受到該途徑終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)。Silva-Ortega等［26］的研究結(jié)果也表明，在鹽脅迫條件下，仙人掌P5CS酶活性的變化與P5CS基因轉(zhuǎn)錄水平的變化以及脯氨酸含量的變化不成正相關(guān)。說(shuō)明P5CS酶活性不僅受到轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，可能還受到轉(zhuǎn)錄后水平及蛋白質(zhì)水平的反饋調(diào)控。

4 結(jié)論

檸條錦雞兒CkP5CS基因全長(zhǎng)2 604 bp，包括5′-UTR 102 bp，3′-UTR 363 bp，開放閱讀框 2 139 bp，能編碼712個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量為76.8 kD，理論等電點(diǎn)為8.6，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋、延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲。CkP5CS基因的表達(dá)沒(méi)有組織特異性，其表達(dá)受低溫、高鹽和PEG滲透脅迫的誘導(dǎo)，在檸條錦雞兒適應(yīng)低溫、高鹽和滲透脅迫過(guò)程中發(fā)揮作用。