馬明慧 馬悅佼 孫婕 張海燕

作者單位：100069 北京，首都醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院2014級基礎(chǔ)醫(yī)學班專業(yè)1，細胞生物學系2

由于干細胞在再生醫(yī)學和細胞治療領(lǐng)域具有廣泛的應用前景，越來越多的研究者致力于解析它們自我更新、多能性和可塑性的調(diào)控方式[1]。最近的研究證實，線粒體及有氧代謝直接參與干細胞多能性的調(diào)控。細胞通過生物發(fā)生、循環(huán)、融合和分裂等方式調(diào)節(jié)線粒體數(shù)量和活性以適應環(huán)境和細胞內(nèi)部的因素。除了通過氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS） 在產(chǎn)能過程起重要作用之外，線粒體在氨基酸、脂肪酸和類固醇代謝以及活性氧產(chǎn)生的細胞信號傳導、鈣平衡和細胞凋亡中均起著重要作用。本文綜述近幾年有關(guān)干細胞干性維持及定向分化過程中，線粒體代謝改變與線粒體形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能變化的研究進展。

一、干細胞中線粒體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與功能

干細胞是一類具有較強自我更新和可分化成多種細胞類型的細胞。依據(jù)其來源，干細胞分為三類：胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）、成體干細胞、誘導多能性干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）。依據(jù)干細胞的潛能，干細胞又分為全能干細胞、多能性干細胞和單能性干細胞。其中多能性干細胞是目前研究最為廣泛的干細胞類型。

研究表明[2]，相較于成體細胞能量產(chǎn)生主要依賴于OXPHOS，多能性干細胞主要基于低氧狀態(tài)下的糖酵解。多能性干細胞中的線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)也與之相適應，呈現(xiàn)出獨特的變化。

（一）線粒體的形態(tài)及數(shù)量

與成體細胞中線粒體中所具有發(fā)達的嵴、密集的基粒數(shù)量、呈細長或有分支的復雜結(jié)構(gòu)相比，利用透射電子顯微鏡觀察人和小鼠的ESCs時驚奇地發(fā)現(xiàn)，ESCs中的線粒體呈不成熟的球形、數(shù)量較少且分布在細胞核周圍[3-6]，線粒體內(nèi)具有不發(fā)達的嵴和低電子密度的基質(zhì)[7]。而在ESCs的體外分化過程中，觀察到線粒體形態(tài)的延伸和嵴超微結(jié)構(gòu)的成熟[4-5]。線粒體DNA的含量和質(zhì)量均明顯增加。

（二）線粒體的結(jié)構(gòu)

盡管多能性干細胞能量的產(chǎn)生主要依賴于糖酵解，但是多能性干細胞的線粒體中仍具有完整的呼吸鏈復合體結(jié)構(gòu)[8]。

（三）線粒體的功能

多能干細胞中能量的來源主要通過糖酵解產(chǎn)生，這一產(chǎn)生方式導致細胞內(nèi)乳酸不斷累積，OXPHOS受到限制，從而使耗氧量和活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)量減少，底物進入三羧酸循環(huán)受限，糖酵解中間產(chǎn)物進入磷酸戊糖途徑，并作為底物維持核苷酸的自我更新、合成，如圖1所示。

多能干細胞中呈現(xiàn)出球形、不成熟線粒體，定位在核周，以電子密度較低的基質(zhì)以及不發(fā)達的嵴為特征。在分化細胞中，其線粒體網(wǎng)則以更高電子密度和成熟嵴為特征的[10]，通過OXPHOS活動確保ATP產(chǎn)量。這導致了氧消耗的升高和ROS產(chǎn)量，并減少了經(jīng)糖酵解產(chǎn)生的乳酸的量。有趣的是，抑制OXPHOS或刺激糖酵解阻礙了干細胞分化，同時支持其重新編程為iPSCs。相反，刺激線粒體生物合成促進細胞分化，而抑制糖酵解削弱了重新編程。

在多能性干細胞低氧的糖酵解過程中，細胞產(chǎn)能相對較為低效，推測多能性干細胞選擇糖酵解作為主要能量產(chǎn)生方式的原因可能有以下幾點：（1）糖酵解與較低水平OXPHOS的共同作用可能為多能性干細胞生長增殖、生物合成提供反應所必需的輔助因子和酶作用物。此觀點在Pereira等學者對癌細胞的實驗中得以驗證。Pereira等[11]發(fā)現(xiàn)，多能性干細胞和癌細胞獲取能量主要依賴于糖酵解，即使在有氧環(huán)境下，它們?nèi)云锰墙徒獾姆绞?。這種方式與細胞增殖相關(guān)，通過提供反應所需因子，滿足細胞分裂時生物合成的需要。設法干預代謝途徑，迫使細胞改變其偏好，可以增加干細胞的多潛能性或影響其分化程度，也改變癌細胞的侵襲性。（2）糖酵解過程可降低ROS產(chǎn)生。ROS能破壞遺傳物質(zhì)和細胞組分，維持低水平的ROS可保護細胞不受上述傷害，對生物體的發(fā)育和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有重要意義[12]。有報道表明，過表達氧化還原因子Ref-1可以通過抑制細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生來減少人骨髓間充質(zhì)干細胞的衰老[13]。（3）由于多能性干細胞存在于缺氧的微環(huán)境中，糖酵解代謝可能是它們對生活環(huán)境的適應性表現(xiàn)。盡管糖酵解的能量產(chǎn)生效率較低，但其產(chǎn)能速度快，且伴有較低水平的活性氧形成，這對缺氧條件下維持細胞多潛能性很重要[14]。

圖1 多能干細胞與成體細胞線粒體能量產(chǎn)生過程比較[8]

表1 細胞類型與線粒體形態(tài)和代謝方式差異

由此可見，線粒體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能都與細胞維持多潛能性密切相關(guān)。因此，線粒體特征鑒定也已經(jīng)作為判定干細胞的干性指標。表1中列舉了不同類型細胞中線粒體形態(tài)和代謝方式差異。

二、干性維持

當線粒體維持在多潛能性階段時，它具有與成體細胞不同的成熟水平和代謝偏好，所以，有可能通過作用線粒體影響細胞的干性維持。比如，抑制線粒體功能增強干性、抑制分化。有實驗表明，用一定濃度的T-2毒素作用于小鼠胚胎干細胞（mouse embryonic stem cells，mESCs），可見線粒體形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能均受到抑制，與此同時，mESCs的分化也受到抑制，維持在干性狀態(tài)[23]。近期，Shen等人發(fā)現(xiàn)，用一定濃度的甲基苯丙胺作用于間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs），會導致線粒體功能紊亂，線粒體生物發(fā)生及動態(tài)調(diào)節(jié)功能降低，抑制MSCs的成骨分化過程[10]。

除此之外，通過抑制過氧化物酶體增殖物活化受體γ共激活劑-1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator -1α，PGC-1α）[24-25]或線粒體轉(zhuǎn)錄因子 A，阻礙線粒體生物發(fā)生，減弱了MSCs向脂肪細胞分化[26]，在用魚藤酮抑制線粒體呼吸作用的實驗中也出現(xiàn)了與上述類似的結(jié)果[24,27]。

三、細胞分化過程中線粒體的動態(tài)變化與調(diào)節(jié)

線粒體的動態(tài)變化影響了大多數(shù)依賴線粒體的生物過程，比如細胞凋亡、鈣平衡和ATP的合成。有研究表明，線粒體的動態(tài)變化與調(diào)節(jié)作用對細胞分化過程也有顯著影響。刺激線粒體生物發(fā)生降低了多能性，且有利于細胞分化或者是形成特定的細胞譜系。

（一）不同種類細胞分化過程中線粒體的動態(tài)調(diào)節(jié)

1.多潛能干細胞分化：在mESCs中，敲除線粒體蛋白如肝再生擴展因子的基因，其多潛能性標志物，如NANOG，OCT4，SSEA的表達出現(xiàn)一定程度的降低。研究發(fā)現(xiàn)[28]，抑制一種與線粒體分裂相關(guān)的GTP酶，即動力相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein-1，Drp1）活性可修復肝再生擴展因子的基因表達缺失所引起的線粒體結(jié)構(gòu)、功能失常，同時可恢復多潛能性基因的表達。這表明，除了多能性干細胞的糖酵解代謝，線粒體動態(tài)平衡與適合的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，對維持多能性至關(guān)重要。

在多潛能干細胞的相關(guān)研究中，一些研究者選用呼吸鏈抑制劑，例如氯苯腙，抗霉素A，或魚藤酮阻擾其分化，發(fā)現(xiàn)這不僅造成線粒體呼吸鏈的抑制，同時還引發(fā)細胞毒性或其它副作用[29]。研究發(fā)現(xiàn)，氯苯腙誘導線粒體解耦聯(lián)導致了細胞內(nèi)ATP水平的下降并且降低了細胞的增殖速率。在mESCs中使用復合體Ⅲ的抑制劑抗霉素A會引起AMP/ATP比值升高，這表明在mESCs中，至少會部分依賴OXPHOS進行ATP的合成[30-31]。

用S-亞硝基-N-乙酰-DL-青霉胺刺激ESCs中線粒體的生物發(fā)生則可降低多能性標記物的表達，且促進了mESCs向肝實質(zhì)細胞樣分化，以及mESCs和hESCs向心肌細胞樣分化。在小鼠iPSCs中過表達線粒體發(fā)生主要的調(diào)控因子PGC-1α可促進了它們向脂肪細胞的分化[24]。

2.脂肪細胞分化：在人骨髓來源的間充質(zhì)干細胞向脂肪細胞分化的過程中，研究發(fā)現(xiàn)PGC-1α mRNA，線粒體質(zhì)量和線粒體DNA拷貝數(shù)的增加，以及OXPHOS復合物的形成和OXPHOS活性的增加。通過抑制PGC-1α或線粒體轉(zhuǎn)錄因子A阻止線粒體生物發(fā)生減弱了成脂分化，通過魚藤酮誘導抑制線粒體呼吸，也出現(xiàn)類似的結(jié)果[24]。Sireewan等[32]在Interruptin B促脂肪干細胞成脂分化的實驗中發(fā)現(xiàn)，一定量的Interruptin B，可通過誘導PPAR-α和PPAR-γ的mRNA水平，增強脂肪干細胞的成脂分化，同時還可以大幅增加線粒體數(shù)量，上調(diào)線粒體膜電位水平。除此之外，他們發(fā)現(xiàn)Interruptin B可上調(diào)棕色脂肪相關(guān)蛋白的mRNA水平，能夠?qū)ψ厣靖杉毎姆只鸬酱龠M作用?？乖鲋车鞍祝╬rohibitin，PHB）是維持線粒體功能所必需的結(jié)構(gòu)蛋白，其存在于白色脂肪組織脈管豐富的部位。有實驗表明，PHB可以抑制小鼠3T3-L1 前脂肪細胞的分化和增殖，調(diào)節(jié)脂肪細胞的凋亡。如果用siRNA沉默PHB，發(fā)現(xiàn)3T3-L1前脂肪細胞分化受到抑制，線粒體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞，線粒體嵴消失，線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ活性受損及活性氧的過度生成。在促進脂肪干細胞分化的條件下，同樣發(fā)現(xiàn)細胞中PHB的mRNA及蛋白水平明顯升高[33]。

3.骨骼肌細胞分化：在骨骼肌細胞分化為肌小管的過程中，伴隨著線粒體代謝的改變和自噬的調(diào)節(jié)。Fortini等[28]提出，成肌分化過程中，線粒體活動和功能的增強與自噬過程相伴隨。在P53缺陷的小鼠成肌過程中，發(fā)現(xiàn)其新陳代謝過程糖酵解占優(yōu)，線粒體生物發(fā)生受損，成肌細胞難以分化為肌小管，同時伴隨自噬過程減少。由此證明，自體吞噬，線粒體穩(wěn)態(tài)和細胞分化與肌肉生長發(fā)育過程相輔相成。

4.心肌細胞分化：線粒體成熟在心肌細胞分化過程中也是至關(guān)重要的。其中，線粒體通透性過渡孔（mitochondrial permeablity transition pore，mPTP）的關(guān)閉，是線粒體成熟的特征，這已被廣泛認為是心肌細胞分化的關(guān)鍵標志。Hom等[34]發(fā)現(xiàn)，在早期胚胎心肌細胞中，線粒體結(jié)構(gòu)和功能尚未成熟，表現(xiàn)為開放的mPTP及呈解偶聯(lián)狀態(tài)的線粒體呼吸鏈；而正常心肌細胞中mPTP則處于關(guān)閉狀態(tài)。因此，可利用化學或基因方式關(guān)閉mPTP使得線粒體成熟，增加心肌細胞分化。人含Ⅲ型纖連蛋白域蛋白5在高耗能的心肌、腦和肌肉組織中高表達。敲除mESCs中的人含Ⅲ型纖連蛋白域蛋白5降低mESCs向心肌細胞分化的能力[25]，降低分化心肌中線粒體的膜電位、ATP的產(chǎn)生。

線粒體的動態(tài)變化、融合分裂都與細胞分化有關(guān)；細胞多能性可影響線粒體動態(tài)變化、活性，由此可見，線粒體的動態(tài)變化與干細胞的分化相輔相成。

（二）線粒體動態(tài)調(diào)節(jié)的分子機制

有證據(jù)表明，線粒體的動態(tài)調(diào)節(jié)是通過特定的信號通路影響干細胞增殖和分化過程[35]。在線粒體分裂、融合過程中，其延伸需要線粒體內(nèi)外膜的融合。動力蛋白相關(guān)GTP酶，線粒體融合蛋白1和2調(diào)節(jié)線粒體外膜的融合，OPA1蛋白和線粒體融合蛋白1調(diào)節(jié)內(nèi)膜融合。一些其他蛋白也參與線粒體融合，如PHB[36]。胞漿內(nèi)Drp1調(diào)節(jié)線粒體分裂，通過受體招募線粒體外膜因子，包括線粒體分裂因子、49KDa及51KDa線粒體動態(tài)蛋白，和線粒體分裂蛋白1，最終造成線粒體收縮、分裂[37]。以下將著重闡述其中部分分子在線粒體動態(tài)調(diào)節(jié)過程中的作用。

1.Drp 1：Drp1蛋白是調(diào)節(jié)線粒體分裂的關(guān)鍵蛋白，在線粒體分裂的過程中，首先受線粒體膜電位Fisl的招募，Drp1轉(zhuǎn)位至線粒體外膜，并且富集于線粒體潛在的分裂位點。在此處，多個Drp1分子圍繞線粒體形成指環(huán)結(jié)構(gòu)，并通過水解GTP改變分子間的距離或角度，逐漸壓縮至線粒體斷裂，產(chǎn)生2個獨立的線粒體。之后Drp1重新回到胞漿，如此循環(huán)往復[38-39]。

Wang等[40]的研究表明，敲除Drp1會影響ESCs的晚期分化，這一點在神經(jīng)發(fā)生過程中尤為明顯，同時，也會在ESCs中期分化過程中延遲降低多潛能性的標志物（NANOG，OCT4）水平。Wang等發(fā)現(xiàn)Drp1在干細胞增殖過程中，對于線粒體生物形成影響不大，但在干細胞分化、神經(jīng)發(fā)生時會下調(diào)多潛能相關(guān)基因。

Hoque等[10]在研究多潛能干細胞定向誘導為心臟中胚層細胞時，同樣發(fā)現(xiàn)Drp1會影響線粒體的有氧呼吸及糖酵解過程。研究表明，抑制Drp1，線粒體形態(tài)趨向融合，促進多潛能干細胞向心臟中胚層細胞分化，同時促進線粒體從糖酵解到OXPHOS的轉(zhuǎn)化。

2.REX1：Reduced expression 1（REX1）是一種廣泛應用的多能性標志。最近發(fā)現(xiàn)，它可通過影響線粒體動態(tài)變化來調(diào)節(jié)細胞命運。抑制REX1在hPSCs中的表達導致多能性標志的下調(diào)，所有三胚層分化標志物的上調(diào)，以及線粒體形態(tài)和活性的發(fā)育。進一步研究證實，REX1對周期素B1/ B2 具有正向調(diào)節(jié)作用，這導致了周期素B-周期素依賴激酶1對 Drp1Ser616位點磷酸化的增加，這是一種翻譯后的修飾觸發(fā)線粒體分裂。因此，過表達REX1或者DRP1-S616D突變蛋白更易于重編程成iPSCs，而抑制REX1或DRP1的表達阻止了重編程過程[41]。

3.PHB2：PHB是一種由PHB基因編碼、高度保守的蛋白，廣泛分布于多種生物細胞之中，因其具有明顯的抗細胞增殖作用而得名[42]。在正常細胞中PHB可以抑制細胞周期轉(zhuǎn)換和DNA的合成，它的突變可能導致細胞無限增殖。最近發(fā)現(xiàn)它也干細胞命運控制相關(guān)。

正常情況下，PHB2在mESCs中含量較高。當細胞過表達PHB2時，有利于mESCs的增殖，但同時抑制了它們向神經(jīng)和內(nèi)胚層細胞系的分化。在mESCs分化過程中，Kowno等[43]還觀察到PHB2的過表達也會抑制線粒體成熟。PHB2對線粒體成熟的影響是由增強OPA1加工介導的，這導致了線粒體分裂增加和功能紊亂。

4.非編碼RNA：非編碼RNA是指各種不翻譯成蛋白質(zhì)的 RNA 分子，包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA 和microRNA 等多種已知功能的RNA，還包括其他未知功能的RNA。其中，部分非編碼RNA在干細胞分化、代謝調(diào)節(jié)等過程中起到重要作用。有文獻報道[44]，一種在肌源性分化過程中誘導產(chǎn)生的microRNA，miR-1，可通過共同調(diào)節(jié)線粒體生物發(fā)生和肌源性有關(guān)的轉(zhuǎn)錄影響肌源性程序的進行。

由于線粒體在誘導和維持干細胞的多能性、細胞分化等方面發(fā)揮了重要作用，目前已引起人們的廣泛關(guān)注，但尚未全面了解線粒體調(diào)控其生理功能的作用及機制。例如線粒體在調(diào)控分化過程中的作用機制、線粒體的結(jié)構(gòu)和功能在干細胞多潛能狀態(tài)和分化期間變化的因果關(guān)系、與干細胞線粒體生物合成、結(jié)構(gòu)及功能變化相關(guān)的表觀修飾等。詳細了解線粒體在以上過程中的作用及調(diào)控機制，不僅可以為揭示線粒體與干細胞干性維持、分化的關(guān)系提供重要理論基礎(chǔ)，同時也能加深對疾病病理的理解，促進再生醫(yī)學的發(fā)展。