徐峰波 崔光晶 劉倩 王肇光 曹啟龍綜述，李棟審校

作者單位：250101 濟(jì)南，銀豐生物工程集團(tuán)有限公司1；250101 濟(jì)南，山東省臍帶血造血干細(xì)胞庫2

近年來成體干細(xì)胞研究進(jìn)展迅速，具有多項(xiàng)分化潛能的胚胎樣干細(xì)胞被相繼發(fā)現(xiàn)和報(bào)道。2006年3月美國路易斯維爾大學(xué)Kucia等[1]研究團(tuán)隊(duì)從成年小鼠骨髓Sca- 1+Lin-CD45-細(xì)胞中分離趨化因子4（chemokine receptor，CXCR4）陽性細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)一種同時(shí)表達(dá)胚胎干細(xì)胞、外胚層干細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞標(biāo)志分子（SSEA-1，Oct-4，Nanog和Rex-1）的特殊干細(xì)胞，該細(xì)胞數(shù)量很少，只占骨髓單個(gè)核細(xì)胞（mononuclear cells，MNC）的0.02﹪，由于這群細(xì)胞體積極小，直徑只有2 ～ 4 μm，因此命名為極小胚胎樣干細(xì)胞（very small embryonic-like stem cells，VSELs）。同年 4月，伊利諾伊大學(xué)的Zhao等[2]也報(bào)道在臍帶血中發(fā)現(xiàn)的臍帶血干細(xì)胞（cord blood stem cells，CB-SC）異質(zhì)細(xì)胞群具備多分化潛能，CB-SC同時(shí)具有胚胎干細(xì)胞和造血干細(xì)胞相關(guān)分子標(biāo)志的特征，體外可被誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，體內(nèi)可分化為分泌胰島素的細(xì)胞，這是首次報(bào)道從臍帶血中發(fā)現(xiàn)胚胎樣、可跨胚層分化的多能干細(xì)胞（pluripotent stem cells，PSCs）。

2007年Kucia 等[3]采用兩步分離法從臍帶血得到VSELs，但與Zhao 等報(bào)道的CB-SC有所區(qū)別，CB-SC不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志CD34。Kucia等認(rèn)為，這種PSCs可能是在原腸胚形成和器官發(fā)生時(shí)保存下來的，在器官組織發(fā)育過程中作為PSCs儲(chǔ)存起來，并在機(jī)體成長(zhǎng)中為所有組織器官提供各種定向成體干細(xì)胞，可能對(duì)生物機(jī)體的成年器官保持年輕和損傷器官的修復(fù)有著極其重要的作用。Halasa等[4]采用兩步分離法在波蘭也獲得人臍帶血VSELs，并再次證實(shí)臍帶血VSELs的PSCs特征。

2014年Lee等[5]研究發(fā)現(xiàn)在臍帶或胎盤中通過免疫熒光染色檢測(cè)證實(shí)胎盤的原始血管系統(tǒng)（primo vascular system，PVS）結(jié)構(gòu)上具有VSELs特征的細(xì)胞，2016年Katsiani 等[6]在研究時(shí)也發(fā)現(xiàn)胎盤絨毛膜能分離到一種具有胚胎干細(xì)胞樣的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC-Like），具有高速增殖和多向分化特性，與Lee等的發(fā)現(xiàn)有相似之處。

一、VSELs的生物學(xué)特征

VSELs首次報(bào)道時(shí)的生物學(xué)基本特征是細(xì)胞體積極小，保持有跨胚層分化的PSCs活性，表型特征為CXCR4+Sca- 1+Lin-CD45-?；诖颂卣?，截止目前，已有多個(gè)研究機(jī)構(gòu)從小鼠骨髓、胸腺、脾臟以及胰腺等11種器官，大鼠骨髓以及人臍帶血、人外周血、卵巢和睪丸等多種成體組織中分離得到VSELs，但不同物種來源的VSELs各有不同，下面對(duì)不同來源的VSELs從免疫表型、形體大小及生物學(xué)特性等方面進(jìn)行概述比較。

（一）VSELs的免疫表型比較

Kucia等[1]研究認(rèn)為，小鼠骨髓來源的VSELs流式篩選的表型是FSClowSSClowCD45-Lin-Sca-1+，經(jīng)分析鑒定，其還表達(dá)SSEA-1、Oct-4、Nanog和Rex-1等胚胎干細(xì)胞標(biāo)志。Labedz-Maslowska等[7]從新西蘭大鼠骨髓中分離的VSELs表達(dá)非造血抗原CD106（即VCAM-I）。而Sovalat等[8]從人外周血分離得到的3個(gè)VSELs亞群，分別表達(dá)CD133+Lin-CD45-、CD34+Lin-CD45-和 CXCR4+Lin-CD45-，通過青年、中年和老年3個(gè)年齡段健康志愿者VSELs數(shù)量的縱向分析，他們認(rèn)為CD133+或CD34+或CXCR4+細(xì)胞會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而消失。

Shaikh等[9]從人臍帶血分離得到的VSELs表達(dá)Lin-CD45-CD34+CD133+，同時(shí)也表達(dá)PSCs標(biāo)志Oct-4A，Oct- 4，SSEA-4，SOX-2，Nanog和Rex-1以及原始生殖細(xì)胞標(biāo)志 STELLA，F(xiàn)RAGILIS。

（二）VSELs的形體大小比較

VSELs在機(jī)體組織中具有分布少、體積小的顯著特征。一般而言，VSELs只占相應(yīng)MNC數(shù)量的0.01﹪～ 0.02﹪，約每105個(gè)MNC細(xì)胞中含1個(gè)VSELs。Kucia等[10]在透射電鏡下觀察到VSELs，小鼠骨髓VSELs細(xì)胞直徑約2 ～4 μm。

Sovalat 等[8]研究結(jié)果顯示，成年人外周血VSELs細(xì)胞體積為3 ～ 6 μm。Kucia等[3]的研究團(tuán)隊(duì)從人臍帶血分離得到的VSELs細(xì)胞體積比小鼠骨髓來源的稍大，直徑約3 ～ 5 μm；而 Shaikh 等[9]則認(rèn)為人臍帶血 VSELs細(xì)胞直徑約4 ～ 6 μm。人VSELs體積比紅細(xì)胞小，但胞內(nèi)內(nèi)容物密度大，梯度密度離心分離時(shí)與紅細(xì)胞而不是白細(xì)胞一起被分離，Bhartiya等[11]研究證實(shí)了從臍帶血或骨髓樣本中去除了MNC后的紅細(xì)胞部分，可以分離獲得大部分的VSELs。

（三） VSELs其他生物學(xué)特征

VSELs呈圓球形，具有顯著的細(xì)胞核，很高的核質(zhì)比，細(xì)胞核有核膜和核孔，核內(nèi)松散地填充著常染色質(zhì)。小鼠骨髓來源的VSELs具有多數(shù)PSCs細(xì)胞的共同特征，如較高的核質(zhì)比、具有常染色質(zhì)和少量線粒體，并且在mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)Oct-4和Nanog[1]，后經(jīng)過Shin等[12]對(duì)啟動(dòng)子甲基化的研究發(fā)現(xiàn)，其與促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的組蛋白具有相應(yīng)聯(lián)系。

人臍帶血來源的VSELs為二倍體型細(xì)胞，且無染色體畸變和缺失異常，細(xì)胞核外只有較少的細(xì)胞質(zhì)。Shaikh等[9]研究人臍帶血VSELs時(shí)發(fā)現(xiàn)，其端粒酶活性是人胚胎來源的成纖維細(xì)胞活性的2.5倍，但其活性仍顯著低于胚胎干細(xì)胞。Ratajczak等[10]研究總結(jié)了臍帶血來源的VSELs的基本特征。VSELs數(shù)量很少且體積比紅細(xì)胞小，此外還具有以下特征：（1）可在分娩過程中被動(dòng)員進(jìn)入新生兒外周血中；（2）在CD133+Lin-CD45-細(xì)胞碎片中含量豐富；（3）細(xì)胞可表達(dá)PSCs的標(biāo)記物，有明顯的細(xì)胞體積小而細(xì)胞核體積大的細(xì)胞特征，有很高的核質(zhì)比和穩(wěn)定的常染色質(zhì)。按照PSCs的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，除上述VSELs的特征外，臍帶血來源VSELs的PSCs特征，尚未有體外跨胚層分化能力、體內(nèi)形成囊胚和裸鼠內(nèi)形成畸胎瘤的研究報(bào)道，因此，這些方面也將成為臍帶血VSELs研究的重點(diǎn)。

三、VSELs分離及培養(yǎng)分化

通常的分離方法中，采用Ficoll密度梯度法從骨髓和臍帶血分離制備VSELs，常會(huì)出現(xiàn)由于未考慮VSELs體積小、密度大的特征而被作為紅細(xì)胞或細(xì)胞碎片丟棄的現(xiàn)象，有研究發(fā)現(xiàn)VSELs的密度與紅細(xì)胞類似，所以，VSELs可從紅細(xì)胞或細(xì)胞碎片中富集得到。目前，大部分臍血庫的臍血制備標(biāo)準(zhǔn)操作流程中一般不再采用密度梯度離心法，而是通過羥基淀粉（HES）沉降去除紅細(xì)胞，該方法可保留大部分的VSELs。Chang等[13]研究表明，凍存復(fù)蘇的臍帶血可制備得到VSELs，這說明VSELs在臍帶血濃縮制備過程中可保留，且大部分的VSELs經(jīng)過-196 ℃凍融可保持活性，由此可見人類臍帶血庫將成為VSELs的重要來源。

（一）鼠骨髓VSELs的分離

Ratajczak等[14]就鼠骨髓VSELs的流式細(xì)胞術(shù)（fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS）分選進(jìn)行詳細(xì)介紹。首先，將無顆粒的小體積（約2 ～ 10 μm）的流式計(jì)數(shù)磁珠作為圈定FSC/SSC散點(diǎn)圖中淋巴細(xì)胞門的范圍（即R1門，圖1a）。R1選定的細(xì)胞經(jīng)再次圈門R2進(jìn)一步純化（圖1b）。來自R2的細(xì)胞通過Lin/Sca-1標(biāo)記做進(jìn)一步分析并圈定Lin-Sca-1+細(xì)胞門R3（圖1c），以與紅細(xì)胞相區(qū)別；來自R3的細(xì)胞在CD45/SSC散點(diǎn)圖中（圖d）選出CD45-/+的細(xì)胞門R4和R5，并且它們?cè)贔SC/SSC散點(diǎn)圖中的位置如圖1e，f所示。

（二）人臍帶血VSELs的分離

已報(bào)道的分離人臍帶血VSELs的傳統(tǒng)方法是兩步分離法。Halasa等[4]首次建立人臍帶血VSELs兩步分離法。該方法首先用NH4Cl裂解紅細(xì)胞，在保留全部有核細(xì)胞的基礎(chǔ)上，采用Lin、CSCR4、CD45、CD34等多參數(shù)流式分選，最后分選出3類VSELs亞型細(xì)胞，即CXCR4+Lin-CD45-，CD34+Lin-CD45-和CD133+Lin-CD45-。該方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，可以盡可能多的獲取VSELs，但耗時(shí)較長(zhǎng)，一般一份50 ～ 100 ml的臍帶血需要耗時(shí) 3 ～ 4 d。 Zuba-Surma 等[15]在上述分選基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化臍帶血VSELs分離，建立高效分離臍帶血VSELs的三步分離法。他們首先在臍帶血全血中加入NH4Cl裂解紅細(xì)胞，其次用CD133標(biāo)記的免疫磁珠富集包含CD133+的細(xì)胞，最后通過流式細(xì)胞術(shù)分選獲得Lin-/CD45-/CD133+細(xì)胞。該優(yōu)化的臍帶血VSELs分選方案處理100 ml臍帶血只需要2 ～ 4 h，相對(duì)之前3 ～ 4 d的時(shí)間，有顯著的提高。此外，Ratajczak等[16]利用一種以熒光標(biāo)記的乙醛脫氫酶（ALDH）為基礎(chǔ)的干細(xì)胞鑒定試劑盒分選VSELs，使分離效率大幅提高。

圖1 小鼠骨髓VSELs的流式細(xì)胞術(shù)經(jīng)典分選策略圖[14]

（三）不同來源VSELs的體外培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化

1.小鼠骨髓來源的VSELs體外培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化：骨髓來源的VSELs多向分化潛能已得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在體外VSELs可分化成3個(gè)胚層的細(xì)胞。Kucia等[10]將小鼠骨髓來源的VSELs進(jìn)行心肌、神經(jīng)、胰腺定向誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，能夠體外被誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞（中胚層），神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞（外胚層）及胰島細(xì)胞（內(nèi)胚層）。隨后耶魯大學(xué)的Kassmer等[17]的研究證實(shí)小鼠來源的VSELs體內(nèi)可分化成肺上皮細(xì)胞（內(nèi)胚層），進(jìn)一步證實(shí)Oct-4陽性的VSELs具有跨胚層分化潛能。有研究表明，在早期造血激動(dòng)因子和生長(zhǎng)因子刺激條件下，鼠骨髓來源的VSELs可在OP9基質(zhì)細(xì)胞上形成如鵝卵石排列的造血干細(xì)胞原始群落。Ratajczak等[18]將鼠骨髓來源的VSELs在OP9基質(zhì)細(xì)胞上共培養(yǎng)后可形成造血細(xì)胞系克隆，將其移植給接受致死劑量照射的小鼠模型，可使小鼠輻射損傷快速修復(fù)。2016年有學(xué)者研究報(bào)道，小鼠骨髓來源的VSELs可以向受損的脊髓遷移，進(jìn)而發(fā)揮修復(fù)和分化的重要功能[19]。

2.臍帶血來源的VSELs體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化：據(jù)報(bào)道，Ratajczak等[20]還從臍帶血分離出兩類VSELs，并發(fā)現(xiàn)VSELs與OP9共培養(yǎng)獲得的造血細(xì)胞，可使致死劑量照射的非肥胖型糖尿病免疫缺陷小鼠重建造血功能，因此研究者推測(cè)，VSELs有可能是臍帶血中最原始的造血干細(xì)胞之一。Ratajczak等[16]研究認(rèn)為，臍帶血VSELs具有可長(zhǎng)期再植造血干細(xì)胞（long-term repopulating hematopoietic stem cells，LT-HSCs）特性，可作為再生醫(yī)學(xué)中PSCs的重要來源。Mcgukin等[21]將臍帶血來源的VSELs在體外給予EGF和bFGF刺激，部分細(xì)胞失去ESC標(biāo)志，并分化表達(dá)Nestin, GFAP和Ki67等神經(jīng)祖細(xì)胞或成熟神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)志的細(xì)胞，他們由此總結(jié)提出VSELs細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的2D實(shí)驗(yàn)方案，可用于相關(guān)后續(xù)研究。Bhartiya等[11]提出VSELs可通過不對(duì)稱分裂進(jìn)行自我更新，同時(shí)可產(chǎn)生子代定向祖細(xì)胞，UCB-VSELs表達(dá)細(xì)胞核Oct-4、細(xì)胞表面蛋白SSEA-4以及其他PSCs標(biāo)志，并且從臍帶血的白細(xì)胞中分離的HSC，可檢測(cè)到細(xì)胞質(zhì)Oct-4。研究者認(rèn)為，這些VSELs可能在人的一生中持續(xù)存在，通過非對(duì)稱細(xì)胞分裂進(jìn)行自我更新，同時(shí)產(chǎn)生大量定向祖細(xì)胞，包括依賴體細(xì)胞微環(huán)境的造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs）和間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSCs），以維護(hù)機(jī)體組織的更新平衡。由此可以推斷，成人的機(jī)體組織中真正起作用的干細(xì)胞其實(shí)是VSELs，而HSCs和MSCs實(shí)際上是VSELs不對(duì)稱分裂產(chǎn)生的子代定向祖細(xì)胞。

3.其他來源的VSELs的體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化研究：Kucia等[10]認(rèn)為，VSELs是在原腸胚和器官形成時(shí)保留于器官或組織中的PSCs，正常情況存在于所有的機(jī)體器官組織中，而VSELs細(xì)胞中Igf2-H19等印記基因（Imprinted genes）甲基化修飾可能會(huì)導(dǎo)致VSELs進(jìn)入靜息狀態(tài)，并在特定條件下消除這種基因修飾，使VSELs形成可為特定組織提供定向分化的干細(xì)胞，因此VSELs對(duì)成體組織保持年輕和器官損傷修復(fù)起著重要作用。Suszynska等[22]也同樣認(rèn)為VSELs是最原始的靜息的PSCs，其他干細(xì)胞可能是其定向分化的結(jié)果。圖2a表示VSELs和其他造血組織中分離的PSCs是獨(dú)立的干細(xì)胞群，圖2b表示VSELs是最原始的靜息的體積極小的干細(xì)胞，并能被激活擴(kuò)增成為其他體積稍大的PSCs。圖2c表示VSELs作為最原始的體型小的靜息的干細(xì)胞，其活化可以生產(chǎn)形體較大、兼有多向重疊分化潛能的干細(xì)胞，很可能是真正發(fā)揮器官修復(fù)作用的生命機(jī)制。

Shi等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，VSELs可分化成 LT-HSCs、MSCs、肺泡上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞和生殖細(xì)胞。由此提出，機(jī)體長(zhǎng)期處在胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子信號(hào)刺激下，可能會(huì)加速成體組織中VSELs的消耗，此機(jī)制可能利于解釋隨著年齡增加人體內(nèi)干細(xì)胞含量降低的問題。

綜上所述，鼠骨髓、臍帶血以及其他相關(guān)來源的與VSELs有關(guān)的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)和造血細(xì)胞等跨胚層的分化已有報(bào)道，并初步建立了小鼠骨髓來源的VSELs的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，研究表明，VSELs是最原始的靜息的PSC，可以繼續(xù)分化成其他PSCs，這對(duì)其在再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用有著重要研究?jī)r(jià)值。

四、VSELs應(yīng)用研究與展望

人臍帶血VSELs可能是目前發(fā)現(xiàn)的，存在于胎兒外周血中最原始的一類干細(xì)胞。研究者們認(rèn)為人臍帶血極小胚胎樣干細(xì)胞最終將作為再生醫(yī)學(xué)中一類重要的PSCs，應(yīng)用于組織醫(yī)學(xué)工程修復(fù)治療，但應(yīng)用之前尚有一系列問題亟需解決。Shin等[23]從人臍帶血和小鼠骨髓分選的VSELs進(jìn)行小鼠體內(nèi)試驗(yàn)研究，并在多個(gè)器官組織中發(fā)現(xiàn)了VSELs，這為VSELs可用于HSCs、MSCs、肺表皮細(xì)胞[17]、心肌細(xì)胞和配子細(xì)胞等相關(guān)功能障礙性疾病的治療提供了理論依據(jù)。此外，Mcgukin等[21]將臍帶血來源的VSELs在優(yōu)化的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)獲得神經(jīng)（祖）細(xì)胞，其認(rèn)為這可為神經(jīng)系統(tǒng)藥物研究和神經(jīng)系統(tǒng)疾病干細(xì)胞移植治療提供新的途徑。Dawn等[24]將VSELs用于小鼠造血重建移植，可幫助接受致死劑量照射的小鼠重建造血系統(tǒng)，促進(jìn)急性心肌梗死小鼠模型的心功能改善。Virant- Klun等[25]從健康人卵巢上皮分離得到VSELs，體外可誘導(dǎo)分化成原始的卵母細(xì)胞樣細(xì)胞，而研究者還在卵巢癌邊緣組織中觀察到具有VSELs分化特征的“腔室（chambers）”結(jié)構(gòu)，提示VSELs可能在女性生育和卵巢癌發(fā)病機(jī)制研究方面具有重要意義。

圖2 VSELs多能分化與其他PSCs的關(guān)系推測(cè)[22]

為保證VSELs更加安全有效的臨床應(yīng)用，未來還應(yīng)對(duì)不同來源的VSELs細(xì)胞生物學(xué)細(xì)微差異作深入的研究。其次，任何細(xì)胞的臨床應(yīng)用前，還應(yīng)解決相應(yīng)細(xì)胞的體外擴(kuò)增制備和質(zhì)量控制，只有在此基礎(chǔ)上才可進(jìn)行臨床應(yīng)用研究或臨床試驗(yàn)。Heider等[26]的研究結(jié)果顯示，人類的VSELs是一群不活躍的異質(zhì)細(xì)胞，它們不能在現(xiàn)有胚胎或成體干細(xì)胞的培養(yǎng)液中擴(kuò)增培養(yǎng)，這為臨床大規(guī)模使用帶來障礙，但相信隨著VSELs培養(yǎng)技術(shù)研發(fā)的深入，會(huì)實(shí)現(xiàn)VSELs體外擴(kuò)增技術(shù)的突破，并逐步完善VSELs的體外規(guī)范化培養(yǎng)工藝，為VSELs的臨床應(yīng)用工作做好臨床前準(zhǔn)備工作。

VSELs作為近年來被發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞，具有PSCs的多種特性，可分化成多種干細(xì)胞、祖細(xì)胞及成體細(xì)胞，對(duì)現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞治療及臨床疾病治療有重要的積極意義。VSELs具有很強(qiáng)的分化能力，若作為組織工程和臨床治療的種子細(xì)胞，可以避免倫理爭(zhēng)議，具有良好的應(yīng)用前景，這也是VSELs作為生物細(xì)胞治療手段的一個(gè)優(yōu)勢(shì)所在。近年來的不斷研究報(bào)道表明，從臍帶血中分離具有多能性的VSELs，其作為PSCs在再生醫(yī)學(xué)中的重要應(yīng)用價(jià)值將受到更多的關(guān)注。