張睿 崔樂(lè)

作者單位：438200 黃岡，浠水縣人民醫(yī)院甲乳外科1；430000 武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛(ài)醫(yī)院甲乳外科2

白細(xì)胞介素-12（IL-12）是目前發(fā)現(xiàn)的一種對(duì)免疫活性細(xì)胞誘導(dǎo)以及調(diào)節(jié)作用較強(qiáng)的細(xì)胞因子，研究顯示，IL-12能夠有效促進(jìn)NK細(xì)胞以及T細(xì)胞的活化，促進(jìn)干擾素-γ（IFN-γ）的產(chǎn)生，從而對(duì)腫瘤血管生成具有抑制作用，因此IL-12對(duì)多種腫瘤的治療均具有重要的作用[1-2]。近些年來(lái)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）相關(guān)研究已經(jīng)成為了生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，BMSC目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、自身免疫疾病、消化系統(tǒng)以及腫瘤等方面的基礎(chǔ)研究[3]。在腫瘤治療方面，BMSC作為一個(gè)新興的載體受到了越來(lái)越多研究者的關(guān)注，BMSC具有著較低的免疫原，作為基因治療載體，外源性基因轉(zhuǎn)染至BMSC操作較為簡(jiǎn)單且轉(zhuǎn)染率高[4-5]。本研究探討分析IL-12重組質(zhì)粒（pcDNA6/ IL-12）聯(lián)合BMSC對(duì)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞侵襲及裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

一、材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：MCF-7人乳腺癌細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。BALB/c裸鼠，4周齡，雌性，SPF級(jí)，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所。pcDNA6/IL-12質(zhì)粒由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院創(chuàng)建并保存。

2.主要試劑及儀器：1640（美國(guó)Hyclon公司）；DMEM-F12培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司）；澳洲胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司）；青霉素-鏈霉素（美國(guó)Hyclone公司）；CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（日本同仁）；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton Dickinson公司）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.BMSC原代培養(yǎng)：參照文獻(xiàn)方法[6]，取3 ～ 4周齡雄性昆明種小鼠，處死后剝離股骨和脛骨，剪開(kāi)骨兩端后使用含有150 ml/L胎牛血清、雙抗的DMEM-F12完全培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔。沖洗后的培養(yǎng)基接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。間隔8 h換液1次，連續(xù)3次后，每3天半量換液1次，直至細(xì)胞達(dá)到70﹪左右融合，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。BMSC經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)及茜紅素染色鑒定。

2.BMSC條件培養(yǎng)基制備：經(jīng)上述培養(yǎng)分離，純化至第三代的小鼠BMSC，生長(zhǎng)至70﹪融合時(shí)，棄去上層培養(yǎng)液，使用無(wú)血清的DMEM-F12培養(yǎng)基清洗1遍，然后加入DMEM-F12完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集上清液，9.18×g離心5 min，吸取上清液，使用0.22 μm濾器過(guò)濾后備用。

3.脂質(zhì)體Lip 2000轉(zhuǎn)染：脂質(zhì)體 Lip 2000 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA6/IL-12將培養(yǎng)后的BMSCV細(xì)胞消化離心，緩慢吹打，制成密度為1×105個(gè)/ ml的細(xì)胞懸液，而后將細(xì)胞懸液中細(xì)胞接種于DMEM-F12培養(yǎng)皿內(nèi)，在細(xì)胞達(dá)到50﹪～ 80﹪融合后，將培養(yǎng)基換成無(wú)血清培養(yǎng)基，后續(xù)操作在轉(zhuǎn)染前1 d，換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d，按脂質(zhì)體Lip 2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行操作。具體為：分別取4 μg 質(zhì)粒、10 μl脂質(zhì)體 Lip 2000 溶于 200 μl無(wú)血清無(wú)雙抗培養(yǎng)基中為A、B液，孵育5 min后混勻，室溫繼續(xù)孵育25 min，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備后，將混合液緩慢加入BMSC細(xì)胞培養(yǎng)液中，搖勻37 ℃孵育10 ～ 20 h。

4.BMSC對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，將其接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，常規(guī)培養(yǎng)24 h，然后將制備的BMSC條件培養(yǎng)基與1640完全培養(yǎng)基按照1 : 1比例混合。每孔加入100 μl，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后，參照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞增殖情況。

5.BMSC對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，將其接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h。將制備的BMSC條件培養(yǎng)基與1640完全培養(yǎng)基按照1:1比例混合，每孔加入混合培養(yǎng)基1 ml，培養(yǎng)24、48和72 h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，參照Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

6.BMSC、pcDNA6/IL-12MCF-7細(xì)胞侵襲能力影響：將MCF-7細(xì)胞懸液37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后，于第2天觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)，如果細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，則用移液槍頭在貼壁生長(zhǎng)的孔中間劃痕，而后用PBS將被劃下的細(xì)胞清洗干凈，而后使用PBS、BMSC、BMSC聯(lián)合pcDNA6/IL-12分別加入劃痕兩側(cè)細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h后拍照觀察。

7.BMSC聯(lián)合pcDNA6/IL-12對(duì)裸鼠轉(zhuǎn)移瘤的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)為5×107個(gè)/ml，與裸鼠右前腋窩部皮下接種0.1 ml，待腫瘤直徑達(dá)到5 ～ 8 mm時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為4組，每組6只。分別為對(duì)照組、BMSC組、IL-12組以及聯(lián)合組，其中對(duì)照組裸鼠瘤內(nèi)注射100 μl PBS，每3天注射1次，共注射3次；BMSC組裸鼠瘤內(nèi)注射 100 μl的 1×106BMSC，每 3天注射 1次，共注射3次；IL-12組裸鼠瘤內(nèi)注射pcDNA6/IL-12質(zhì)粒60 μg，每3天注射1次，共注射3次；聯(lián)合組裸鼠瘤內(nèi)分別注射100 μl的1×106BMSC+pcDNA6/ IL-12質(zhì)粒60 μg，每3天注射1次，共注射3次。每隔2天測(cè)量裸鼠腫瘤短徑（a）以及長(zhǎng)徑（b），計(jì)算腫瘤體積，并繪制各組小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線，腫瘤體積 （mm3） = a2b/2。15 d后處死裸鼠，取出裸鼠腫瘤以及脾臟，稱量各組裸鼠腫瘤以及脾臟重量，并計(jì)算各組脾指數(shù)，脾指數(shù)=脾質(zhì)量/體質(zhì)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率、腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量、脾指數(shù)采用± s表示，兩組間細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率、腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量、脾指數(shù)比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，3組及以上細(xì)胞增殖抑制率、單因素細(xì)胞凋亡率、腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量、脾指數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.BMSC對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響：24、48、72 h BMSC條件培養(yǎng)基對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖抑制 率 分 別 為（13.42±1.93）﹪，（16.83±1.77）﹪，（20.21±2.01）﹪。BMSC條件培養(yǎng)基能夠抑制MCF-7細(xì)胞增殖，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)其抑制作用升高（F= 6.271，P＜ 0.001）。

2.BMSC對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響：24、48、72 h BMSC條件培養(yǎng)基對(duì)MCF-2細(xì)胞凋亡率 分 別 為（10.82±2.18）﹪，（18.73±2.95）﹪，（28.15±3.52）﹪，BMSC條件培養(yǎng)基處理MCF-7細(xì)胞，可有效促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞凋亡率升高（F= 9.215，P＜ 0.001，圖 1）。

3.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：與僅用PBS處理的MCF-7乳腺癌細(xì)胞相比，使用BMSC以及聯(lián)合BMSC和pcDNA6/IL-12處理MCF-7細(xì)胞后，細(xì)胞遷徙能力降低（圖 2）。

4.BMSC聯(lián)合pcDNA6/IL-12對(duì)裸鼠轉(zhuǎn)移瘤的影響：與對(duì)照組比較，BMSC組、IL-12組以及聯(lián)合組裸鼠腫瘤體積生長(zhǎng)速度減慢（P＜ 0.05，表1，圖3）。處死各組裸鼠后，BMSC組、IL-12組以及聯(lián)合組裸鼠腫瘤質(zhì)量低于對(duì)照組（P＜ 0.05），且聯(lián)合組裸鼠腫瘤質(zhì)量最低（P＜ 0.05）；而 BMSC 組、IL-12組以及聯(lián)合組裸鼠脾指數(shù)高于對(duì)照組（P＜ 0.05），且聯(lián)合組裸鼠脾質(zhì)量最高（P＜ 0.05，表 2，圖 4）。

圖1 BMSC條件培養(yǎng)基不同時(shí)間處理MCF-7細(xì)胞凋亡率

圖2 倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)（×200）

圖3 正常視野下的三組裸鼠腫瘤

圖4 正常視野下的三組裸鼠脾臟

表1 不同時(shí)間內(nèi)各組裸鼠腫瘤體積變化 （mm3，± s）

表1 不同時(shí)間內(nèi)各組裸鼠腫瘤體積變化 （mm3，± s）

注：與同期對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05；與同期 BMSC 組比較，bP ＜ 0.05；與同期 IL-2 組比較，cP ＜ 0.05

分組 1 d 3 d 5 d 7 d對(duì)照組 124.12± 9.28 582.41±17.28 837.58±37.46 983.42±42.10 BMSC組 132.61±12.41 378.46±23.08a 510.29±30.29a 542.61±58.49a IL-12 組 119.85±13.10 322.75±26.49a 463.85±29.38a 518.37±67.54a聯(lián)合組 123.41± 8.94 217.85±24.03abc 256.73±27.39abc 318.29±47.32abc F值 0.827 37.583 39.857 31.472 P值 0.235 0.000 0.000 0.000對(duì)照組 1180.29±73.48 1472.49±129.37 1095.46±89.30 793.46±109.38 BMSC 組 648.59±73.48a 528.39± 52.37a 402.16±63.20a 329.48± 47.51a IL-12 組 681.39±94.52a 539.44± 75.49a 452.32±68.53a 302.17± 68.53a聯(lián)合組 409.57±38.44abc 382.57± 56.40abc 310.28±63.49abc 189.27± 37.58abc F值 27.843 25.473 20.984 15.372 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 各組裸鼠腫瘤質(zhì)量及脾指數(shù)比較（ ± s）

表2 各組裸鼠腫瘤質(zhì)量及脾指數(shù)比較（ ± s）

注：與對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05；與 BMSC 比較，bP ＜ 0.05；與 IL-12組比較，cP ＜ 0.05

分組 腫瘤質(zhì)量（mg） 脾指數(shù)對(duì)照組 877.42±120.11 5.37±0.89 BMSC 組 529.42± 98.74a 7.58±1.21a IL-12組 544.01±117.85a 7.63±1.09a聯(lián)合組 327.55±78.56abc 10.03±1.52abc F值 10.821 13.411 P值 0.000 0.000

討 論

乳腺癌是全世界女性最為常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，根據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究中心相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)女性乳腺癌標(biāo)化發(fā)病率為21.6/10 萬(wàn)，標(biāo)化死亡率為5.7/10萬(wàn)，我國(guó)每年女性乳腺癌新增病理多達(dá)16.9萬(wàn)，占全球總發(fā)病例數(shù)的12.25﹪，列居世界第二[1]。目前常規(guī)的治療方法包括手術(shù)治療、化療、放療以及生物治療等，雖然隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)不斷提高，但患者仍存在嚴(yán)重的不良反應(yīng)而影響療效[8]。

BMSC是一種中胚層多能干細(xì)胞，BMSC主要存在于結(jié)締組織以及器官間質(zhì)中[9]。近年來(lái)，學(xué)者研究顯示[10-13]，BMSC具有明顯的抗腫瘤作用，可抑制結(jié)腸癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌和黑色素瘤等腫瘤細(xì)胞增殖。本研究制備BMSC條件培養(yǎng)基，分析BMSC對(duì)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，BMSC條件培養(yǎng)基對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖具有抑制作用及促凋亡作用。與相關(guān)研究結(jié)果相似[14]，表明BMSC可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡而發(fā)揮其腫瘤抑制作用，可能由于BMSC條件培養(yǎng)基中存在抑制腫瘤細(xì)胞增殖及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的相關(guān)因子，但是其具體影響機(jī)制，還需要進(jìn)一步研究分析。但是關(guān)于BMSC對(duì)腫瘤作用機(jī)制，仍然存一定的爭(zhēng)議，學(xué)者提出，BMSC對(duì)腫瘤的抑制作用可能依賴免疫機(jī)制的參與，而IL-12是重要的免疫細(xì)胞因子之一，研究證實(shí)，pcDNA6/IL-12具有明顯的抗腫瘤作用[15-17]，本研究探討分析pcDNA6/IL-12聯(lián)合BMSC對(duì)MCF-7乳腺癌轉(zhuǎn)移瘤的影響作用。研究結(jié)果顯示，二者聯(lián)合使用，能夠有效抑制裸鼠轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)，且促進(jìn)裸鼠脾指數(shù)的提高，表明pcDNA6/IL-12聯(lián)合BMSC腫瘤抑制具有協(xié)同作用，同時(shí)其作用機(jī)制可能與免疫機(jī)制影響有關(guān)。學(xué)者報(bào)道顯示[18]，轉(zhuǎn)染IL-12后的人源骨髓干細(xì)胞能夠促進(jìn)特異性T細(xì)胞活性的增強(qiáng)，且其抗腫瘤效果比轉(zhuǎn)染IL-12的重組腺病毒更佳，這與本研究結(jié)果相似。

間充質(zhì)干細(xì)胞在腫瘤治療過(guò)程中，具有一定的損傷修復(fù)功能。在腫瘤損傷的部位，間充質(zhì)干細(xì)胞可以發(fā)生類似于基質(zhì)細(xì)胞樣的分化，如內(nèi)皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞等，同時(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分泌某些基質(zhì)蛋白以及細(xì)胞因子促進(jìn)血管的生成，從而發(fā)揮損傷修復(fù)作用[19]。但是也有學(xué)者認(rèn)為[20]，這種損傷修復(fù)作用存在著促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)與腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，但是其具體的機(jī)制和影響作用目前尚無(wú)統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)，還需要更進(jìn)一步的研究分析。

綜上所述，BMSC在體內(nèi)外均具有抑制MCF-7腫瘤增殖作用，對(duì)于裸鼠MCF-7轉(zhuǎn)移瘤模型，BMSC條件培養(yǎng)基聯(lián)合pcDNA6/IL-12具有著明顯的協(xié)同抑制作用，關(guān)于BMSC對(duì)腫瘤的影響機(jī)制，還需要進(jìn)一步研究深入分析。